来源：Whole-cell biocatalysis of HMF into BHMF by Aspergillus niger: Process development and identification of key genes（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
5-羟甲基糠醛（HMF）是木质纤维素生物炼制中的关键平台分子，其选择性还原产物2,5-双(羟甲基)呋喃（BHMF）在精细化工与高分子材料领域应用广泛。本研究以实验室保藏的黑曲霉M13为催化剂，构建了仅含无菌水和葡萄糖的极简全细胞催化体系，12小时内实现HMF完全转化，BHMF产率达84.1%。通过分批补料和重复批次策略，细胞可循环使用21轮，平均BHMF产率76.8%。转录组分析揭示了多个与HMF还原相关的氧化还原酶基因，为后续菌株工程改造提供了遗传靶点。
研究背景
化石燃料日益枯竭与环境污染加剧，推动了以木质纤维素生物质为代表的绿色可再生资源利用研究。HMF作为己糖脱水产物，是连接生物质原料与能源化工的关键中间体，其活性醛基和碳碳双键可通过氧化、氢化等反应转化为多种高附加值化学品。BHMF是HMF醛基选择性加氢的产物，广泛用于精细化学品合成、新型功能化聚醚、聚氨酯及药物杂环化合物制备。化学催化法通常需要高温、金属催化剂和有机溶剂，不符合绿色化学原则。开发条件温和、组分简单的生物催化体系成为替代方案。黑曲霉因具有良好的底物耐受性和工业应用潜力，在HMF生物转化中备受关注。
研究方法
2.1 菌株
黑曲霉M13（CGMCC No. 41010）由本实验室分离并保藏。
2.2 培养基
#### 2.2.1 PDA斜面培养基
PDA斜面培养基购自北京索莱宝科技有限公司，用于培养黑曲霉M13孢子。配制方法：取4.6 g培养基溶于100 mL水中，加热煮沸至完全溶解。取8 mL溶解后的培养基分装至18 cm试管中，121°C高压灭菌20 min，随后倾斜15°冷却凝固。
#### 2.2.2 合成培养基
用于培养黑曲霉M13菌丝球的合成培养基组成为：葡萄糖35 g/L、KH₂PO₄ 2.5 g/L、NH₄Cl 2.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.25 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.24 mg/L、ZnSO₄·7H₂O 1.1 mg/L、FeSO₄·7H₂O 6.45 mg/L、MnCl₂ 3.6 mg/L。取100 mL培养基分装至500 mL锥形瓶中，115°C高压灭菌15 min。
2.3 方法
#### 2.3.1 微生物培养与孢子制备
将甘油管保藏的黑曲霉M13接种至PDA培养基，培养7天获得孢子。用无菌水从PDA斜面刮取孢子，制备孢子悬液，孢子浓度约为0.905 × 10⁸个/mL。取1 mL孢子悬液接种至含100 mL合成培养基的500 mL锥形瓶中，培养24 h获得菌丝球。
#### 2.3.2 菌丝球制备
菌丝球经无菌纱布过滤收集，用无菌水或10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）充分洗涤以去除残留培养基。洗涤后的菌丝球重悬于无菌水或相应缓冲液中，调整至所需细胞浓度，形成菌丝球悬液。
#### 2.3.3 黑曲霉M13对HMF的代谢特征分析
黑曲霉M13在合成培养基中培养24 h后（方法见2.3.1），向培养体系中加入10 mM HMF，考察黑曲霉M13对HMF的代谢情况。
#### 2.3.4 HMF和BHMF毒性抑制研究
黑曲霉M13在合成培养基中培养24 h（方法见2.3.1），分别向培养体系中添加不同终浓度的HMF（50、80、120、140或160 mM）或BHMF（60、100、140、180或220 mM），评估黑曲霉M13对这两种化合物的耐受性。
#### 2.3.5 黑曲霉M13生物催化环境探索
黑曲霉M13在合成培养基中培养24 h（方法见2.3.1），按2.3.2方法制备150 mg/mL菌丝球悬液，重悬介质为无菌水或10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。取10 mL菌悬液转移至50 mL锥形瓶中，考察无菌水、磷酸盐缓冲液及营养补充对HMF催化效率的影响。HMF终浓度50 mM，葡萄糖终浓度50 mM，营养补充为合成培养基中的无机盐组分（见2.2.2）。
#### 2.3.6 不同黑曲霉M13浓度对HMF催化转化的影响
将培养24 h的黑曲霉M13细胞（方法见2.3.1）按2.3.2方法制备不同浓度的菌悬液。取10 mL菌悬液加入50 mL锥形瓶中，反应体系含50 mM葡萄糖和50 mM HMF，反应12 h。
#### 2.3.7 不同成熟阶段黑曲霉M13细胞对HMF生物催化的影响
将培养不同时间（24、48、72、96和120 h）的黑曲霉M13细胞按2.3.2方法制备为120 mg/mL菌悬液。取10 mL菌悬液加入50 mL锥形瓶中，加入HMF和葡萄糖至终浓度各50 mM，孵育12 h。
#### 2.3.8 底物流加（Fed-batch）催化策略
将培养72 h的黑曲霉M13细胞（方法见2.3.1）按2.3.2方法制备为120 mg/mL菌悬液。取20 mL菌悬液加入100 mL锥形瓶中，加入HMF和葡萄糖至终浓度各50 mM。当HMF接近耗尽时，补加至50 mM。重复此操作直至HMF消耗停止。
#### 2.3.9 重复批次（Repeated-batch）催化策略
将培养72 h的黑曲霉M13细胞（方法见2.3.1）按2.3.2方法制备为120 mg/mL菌悬液。取20 mL菌悬液加入100 mL锥形瓶中，加入HMF和葡萄糖至终浓度各50 mM。HMF完全转化后，用无菌纱布过滤收集细胞，转移至含20 mL无菌水的新100 mL锥形瓶中，加入HMF和葡萄糖至终浓度各50 mM。重复此循环直至细胞对HMF失去催化活性。
#### 2.3.10 再活化黑曲霉M13细胞的催化效率
将2.3.9中失活的黑曲霉M13菌丝球经无菌纱布过滤收集，转移至含20 mL新鲜合成培养基的锥形瓶中，孵育72 h进行细胞再活化，获得再生细胞。按2.3.9方法考察再生细胞的催化效率。
#### 2.3.11 转录组测序样品培养
将PDA斜面上培养7天的黑曲霉M13孢子用无菌水洗涤制备孢子悬液，接种至合成培养基培养24 h。随后向实验组添加50 mM HMF，对照组不添加。继续培养2 h后收集细胞。细胞重悬于1 mL TRIzol试剂中，立即液氮速冻，-80°C保存。转录组测序与分析由上海生工生物工程股份有限公司完成，设置3个生物学重复。
2.4 NADH/NAD⁺测定
使用微量测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，BC0310）测定细胞内NADH和NAD⁺含量。细胞经液氮研磨后，取0.1 g粉末转移至2 mL离心管中，加入1 mL碱性提取液（用于NADH提取）或1 mL酸性提取液（用于NAD⁺提取），混匀。冰浴超声3 min，沸水浴5 min。冰上冷却后，4°C、10000 g离心10 min。取200 μL上清液，分别加入等体积酸性或碱性提取液中和。涡旋混匀后再次于4°C、10000 g离心10 min。NADH和NAD⁺浓度按试剂盒说明书测定。
2.5 分析方法
各物质浓度采用高效液相色谱（HPLC，Shimadzu LC-20A）测定。色谱柱为Aminex® HPX-87H柱（Bio-Rad，美国），柱温65°C，流动相为0.005 mol/L H₂SO₄，流速0.8 mL/min。葡萄糖采用RID-10A检测器检测，HMF、BHMF和5-羟甲基-2-呋喃甲酸（HMFCA）采用SPD-20A检测器检测。进样量20 μL。
产物产率定义为产物实际摩尔浓度与理论摩尔浓度之比，计算公式为：
Y(%) = (C_p / C_0) × 100%
底物百分转化率（PC）定义为底物摩尔浓度的减少量与其初始摩尔浓度之比。
研究结果
3.1 黑曲霉M13对HMF的代谢特征
能够转化和利用HMF的微生物种类各异，但其氧化代谢途径具有相似性。如图1所示，HMF首先被氧化为HMFCA或被还原为BHMF。HMF还原为BHMF是一个可逆反应。由于不同微生物的酶种类和活性存在差异，BHMF可被重新氧化为HMF，进而转化为HMFCA。HMFCA随后被FAD依赖性氧化酶进一步氧化为2,5-呋喃二甲酸（FDCA）。FDCA经脱羧和氧化转化为2-呋喃甲酸，最终经一系列催化反应以α-酮戊二酸形式进入三羧酸（TCA）循环。
图2展示了黑曲霉M13转化HMF过程中反应物和产物的动态变化。在实验条件下，黑曲霉M13细胞完全转化了10 mM HMF。随着HMF浓度降低，BHMF浓度显著升高，24 h时达到最大值8.63 mM，此时HMF已被完全消耗。主要副产物为HMFCA（0.86 mM）。继续延长培养时间，BHMF被细胞进一步代谢。上述结果表明，控制催化时间对于HMF定向转化为BHMF至关重要。
【数据】HMF初始浓度：10 mM；BHMF最高浓度：8.63 mM（24 h）；HMFCA浓度：0.86 mM；HMF完全消耗时间：24 h
3.2 黑曲霉M13对HMF和BHMF的耐受性
HMF对微生物细胞具有强烈的抑制和毒性作用。它可破坏微生物细胞膜、抑制多种脱氢酶活性和RNA合成、损害细胞复制、减少ATP和辅因子供应。严重时可导致细胞死亡。因此，高HMF耐受性是高效全细胞生物催化HMF的前提。
图3A和B展示了黑曲霉M13细胞对HMF的耐受性。HMF代谢速率随HMF浓度升高而逐渐降低。具体而言，当HMF初始浓度为50 mM时，细胞在24 h内完全转化了全部HMF，BHMF产率达80.7%，主要副产物HMFCA产率为17.4%。但当初始HMF浓度提高至80 mM时，完全转化时间延长至168 h，BHMF产率降至71.7%。在更高HMF浓度下，黑曲霉M13无法实现HMF完全转化，BHMF产率也随之降低。上述结果表明，黑曲霉M13可耐受高达80 mM的HMF。为获得最优催化效率，建议HMF初始浓度不超过50 mM。
此前研究表明，黑曲霉M13能有效去除木质纤维素酸水解液中的发酵抑制剂。该菌株可在48 h内去除乙酸（69.3–128.7 mM）、糠醛（9.9–15.7 mM）和HMF（2.9–3.8 mM范围内）。黑曲霉M13的HMF耐受性高于文献报道的其他黑曲霉菌株。例如，Zhang等人报道的能够发酵未脱毒玉米秸秆水解液并将HMF还原为BHMF的黑曲霉SIIM M276，其HMF耐受性仅为15.9 mM。
细胞对目标产物BHMF的耐受性是影响其在催化过程中积累的关键因素。如图3C所示，当BHMF浓度低于180 mM时，黑曲霉M13可完全代谢BHMF。但当BHMF浓度为220 mM时，黑曲霉M13仅部分代谢BHMF，残留13.8%未被消耗。上述结果表明，BHMF对细胞的毒性远低于HMF。此外，为最大化BHMF积累并防止其被进一步代谢，精确控制催化反应时间至关重要。
【数据】50 mM HMF：24 h完全转化，BHMF产率80.7%，HMFCA产率17.4%；80 mM HMF：168 h完全转化，BHMF产率71.7%；220 mM BHMF：13.8%未被代谢
3.3 黑曲霉M13生物催化环境探索
在全细胞生物催化中，添加葡萄糖对于实现微生物细胞内辅酶原位再生至关重要，可免除昂贵的外源辅酶需求。无机盐也是支持微生物细胞生长和代谢的重要营养素。本研究考察了不同催化环境对黑曲霉M13转化HMF的影响，结果见图4。
初始实验在无菌水中进行。未添加葡萄糖时，HMF转化率为87.3%，BHMF和HMFCA产率分别为43.5%和27.4%。添加葡萄糖后（H₂O+G体系），HMF转化率显著提高，12 h内达到100%。同时BHMF产率大幅提升至78.0%，HMFCA产率降至19.5%。上述结果表明，葡萄糖的存在使HMF转化强烈偏向还原途径。这一提升归因于葡萄糖作为碳源，在代谢过程中产生了HMF还原所需的NADH和NADPH等关键辅因子。
在含葡萄糖条件下，测定催化过程中细胞内NADH/NAD⁺比值，结果见表1。与无葡萄糖条件相比，含葡萄糖时NADH/NAD⁺比值提高了约27%。这证实了葡萄糖代谢显著增强了胞内还原力。葡萄糖在HMF还原体系中的有益作用在其他研究中也有类似报道。例如，He等人报道添加葡萄糖使大肠杆菌CCZU-K14的还原酶活性提高了1.4倍；Li等人的研究表明，添加葡萄糖使M. guilliermondii SC1103转化HMF的催化时间从24 h缩短至7 h。
为进一步考察营养效应，在含葡萄糖的无菌水中添加其他营养物（H₂O+G+N体系），HMF转化率维持在100%，但BHMF产率降至57.8%，副产物HMFCA产率升至23.5%。这一结果可能归因于葡萄糖和额外营养物同时存在加速了细胞代谢，导致BHMF被更快地进一步代谢。
文献中常采用磷酸盐缓冲液（PBS）作为生物催化介质以维持适宜的pH和细胞离子平衡。本研究考察了黑曲霉M13在PBS体系中的催化效率。如图4所示，PBS+G体系（PBS补充葡萄糖）中HMF转化率为91.5%，BHMF产率为60.2%。在PBS体系中继续添加营养物（PBS+G+N体系）后，HMF转化率提高至100%，BHMF产率提升至70.1%。但该产率仍低于H₂O+G体系的78%，表明含葡萄糖的无菌水在BHMF生产方面整体优于PBS体系。
综上，黑曲霉M13在无菌水+葡萄糖体系中催化HMF还原为BHMF的效率最高。该优化条件在12 h内实现了100%的HMF转化率和78%的BHMF产率。值得注意的是，该催化体系无需添加磷酸盐、氮源或金属离子，简化了常规全细胞生物催化方法，不仅精简了操作流程，还显著降低了成本。
【数据】无菌水无葡萄糖：HMF转化率87.3%，BHMF产率43.5%，HMFCA产率27.4%；H₂O+G：转化率100%（12 h），BHMF产率78.0%，HMFCA产率19.5%；NADH/NAD⁺比值提升约27%；H₂O+G+N：转化率100%，BHMF产率57.8%，HMFCA产率23.5%；PBS+G：转化率91.5%，BHMF产率60.2%；PBS+G+N：转化率100%，BHMF产率70.1%
3.4 黑曲霉M13细胞浓度和成熟度对HMF催化效率的影响
催化剂用量是影响催化效率的关键因素。作为生物催化剂，黑曲霉M13细胞浓度对反应速率起决定性作用。如图5A所示，随着细胞浓度从30 mg/mL提高至150 mg/mL，HMF转化率从59.8%持续提升至100%，BHMF产率从51.1%提升至79.3%。当细胞浓度为120 mg/mL时，HMF转化率已达100%，BHMF产率为78.2%，与150 mg/mL时的79.3%无显著差异。综合考虑催化效率与经济性，选择120 mg/mL作为后续实验的细胞浓度。
细胞成熟度同样显著影响催化性能。如图5B所示，培养24 h的细胞（对数生长期早期）催化HMF转化率为84.1%，BHMF产率为66.8%。随着培养时间延长至48 h和72 h，细胞催化能力逐步增强，72 h时HMF转化率达到100%，BHMF产率提升至84.1%。继续延长培养时间至96 h和120 h，HMF转化率维持在100%，但BHMF产率分别降至80.2%和74.6%。因此，培养72 h的细胞具有最佳的催化活性，被选为后续实验的标准细胞。
【数据】细胞浓度30→150 mg/mL：转化率59.8%→100%，BHMF产率51.1%→79.3%；120 mg/mL：转化率100%，BHMF产率78.2%；培养72 h细胞：转化率100%，BHMF产率84.1%；96 h：产率80.2%；120 h：产率74.6%
3.5 底物流加催化策略
在全细胞催化体系中，高浓度底物可能对细胞产生毒性抑制，而低浓度底物则可能限制产物积累。流加策略可在维持低底物浓度的同时实现高产物积累。如图6所示，采用72 h培养的黑曲霉M13细胞（120 mg/mL），以50 mM HMF和50 mM葡萄糖起始反应，每当HMF接近耗尽时补加至50 mM。经过7轮补料，HMF总消耗量达350 mM，BHMF总生成量为239.5 mM。然而，随着补料轮次增加，HMF转化率逐渐下降，第7轮时转化率降至71.4%。细胞催化活性下降可能归因于反应体系中BHMF的积累对细胞产生毒性，或细胞老化导致辅酶再生能力下降。
【数据】补料7轮；HMF总消耗：350 mM；BHMF总生成：239.5 mM；第7轮转化率：71.4%
3.6 重复批次催化策略
为延长细胞使用寿命并实现连续生产，本研究进一步考察了重复批次催化策略。如图7A所示，黑曲霉M13细胞在重复批次模式下可循环使用21轮。前10轮中，HMF转化率均维持在100%，BHMF产率稳定在较高水平。第11轮后，转化率开始缓慢下降，至第21轮时HMF转化率降至约60%。21轮累计运行中，BHMF平均产率为76.8%。图7B展示了各批次中BHMF和HMFCA的产率变化趋势。整个重复批次过程中，BHMF为主要产物，HMFCA为次要副产物。该结果表明，黑曲霉M13细胞具有良好的操作稳定性和可重复使用性，适用于多次批次转化。
【数据】循环使用：21轮；前10轮转化率：100%；第21轮转化率：约60%；BHMF平均产率：76.8%
3.7 再活化黑曲霉M13细胞的催化效率
经过21轮重复批次催化后，细胞活性显著下降。本研究考察了通过新鲜合成培养基再活化失活细胞的可能性。失活细胞在新鲜合成培养基中孵育72 h后，其催化活性得到明显恢复。如图8所示，再活化细胞在后续重复批次中可继续使用多轮。再活化后第1轮即恢复至100%的HMF转化率，BHMF产率达到80%以上。细胞再生策略将黑曲霉M13细胞的总催化寿命延长了43%。该策略显著提高了细胞利用效率，降低了生物催化剂成本。
【数据】再活化后第1轮：转化率100%，BHMF产率>80%；催化寿命延长：43%
3.8 转录组分析
为解析黑曲霉M13响应HMF胁迫的分子机制，对添加50 mM HMF处理2 h的细胞与未处理对照进行了转录组测序分析。结果显示，HMF胁迫下多个氧化还原酶基因显著上调，包括醇脱氢酶基因和醛脱氢酶基因。这些基因编码的酶可能参与了HMF的还原和氧化代谢途径。差异表达基因的功能富集分析表明，与氧化还原过程、辅因子代谢和应激响应相关的基因本体类别显著富集。上述结果为后续通过基因工程改造提高黑曲霉M13的BHMF选择性和产率提供了候选遗传靶点。
讨论与解读
本研究构建了以黑曲霉M13为核心的全细胞催化体系，实现了HMF向BHMF的高效选择性转化。该体系的最大特色在于极简反应介质——仅需无菌水和葡萄糖，无需磷酸盐缓冲液、氮源或金属离子补充，即可达到优于传统复杂体系的催化效率（12 h内100%转化率，78% BHMF产率）。这一简化源于葡萄糖在代谢过程中提供的胞内还原力（NADH/NAD⁺比值提升约27%），实现了辅酶的原位再生。重复批次实验证明细胞可循环使用21轮，平均产率76.8%，细胞再活化策略进一步延长催化寿命43%，显著降低了生物催化剂的使用成本。转录组学分析鉴定了多个HMF胁迫下显著上调的氧化还原酶基因，为菌株定向改造提供了分子靶标。
编译者解读：从合成生物学应用视角看，该研究巧妙利用了黑曲霉自身的代谢网络实现辅酶再生，避免了外源辅酶添加的高昂成本，体现了"设计-简化-优化"的工程化思维。细胞多轮重复使用和再活化策略直击工业生物催化的经济性痛点。不足之处在于，虽然转录组分析鉴定了候选基因，但尚未进行功能验证和过表达改造以进一步提升BHMF产率。未来若能将关键醇脱氢酶基因在黑曲霉中过表达或异源表达，有望进一步提高催化效率与底物耐受性，推动该体系向工业化应用迈进。
参考来源
Zhang H. Whole-cell biocatalysis of HMF into BHMF by Aspergillus niger: Process development and identification of key genes. Journal of Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.03.013
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.03.013