全细胞生物催化中伯醇对大肠杆菌表达宿主的毒性研究

来源：Primary alcohols as substrates or products in whole-cell biocatalysis: Toxicity for Escherichia coli expression strains（Molecular Catalysis）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

全细胞生物催化在涉及多酶系统或需要复杂辅因子再生的反应中具有独特优势，但底物或产物本身——尤其是短链至中链伯醇——对微生物宿主的毒性往往被忽视。本研究系统评估了四种常见表达菌株（大肠杆菌BL21(DE3)、Top10、恶臭假单胞菌KT2440和枯草芽孢杆菌168）对C1–C10伯醇的耐受性，揭示了链长、细胞密度与生长状态对醇毒性的关键影响，并将这些知识应用于大肠杆菌Top10催化正己烷生产1-己醇的全细胞生物转化体系。研究发现，毒性随碳链延长而升高，但高细胞密度和静息细胞状态可显著提高醇耐受浓度——这一结论对生物催化反应中的底物/产物投料策略具有直接指导意义。

研究背景

高昂成本和日益加剧的环境污染推动了对大宗及精细化学品替代生产路径的需求。酶催化作为一种温和且选择性高的方法，是传统石油化工路线的有力替代方案。然而，游离酶通常需要耗时耗钱的纯化过程、在工艺条件下稳定性有限，且常依赖昂贵的辅底物（如电子供体）。固定化策略虽改善了多种酶的可应用性，但对依赖烟酰胺类等复杂电子供体的酶系，静息细胞全细胞生物催化往往成为首选方案——它能够实现电子供体试剂的体内再生，因而在工业上更具优势。

短链至中链伯醇在工业中具有高度价值：甲醇和乙醇是车辆和燃料电池的主要能源资源，广泛用作溶剂及化学品生产原料；丙醇、丁醇、戊醇和己醇则在生物燃料、制药、化妆品、纺织等产业中扮演重要角色。然而，醇类与许多有机溶剂一样对微生物具有毒性。尽管关于短链和长链醇对膜流动性等影响的报道已有很多，但在生物技术条件下、对不同链长醇类影响细胞活力的系统性研究仍然缺失。本研究旨在填补这一空白，系统考察典型微生物表达菌株对伯醇的耐受性，并将所得规律应用于实际的全细胞生物转化工艺。

研究方法

2.1 实验材料

甲醇、乙醇及C6–C10线性醇购自SIGMA-Aldrich/Merck KgaA（德国汉堡）；1-丙醇和1-丁醇购自VWR Chemicals（德国达姆施塔特）；1-戊醇购自Alfa Aesar（德国卡尔斯鲁厄）。Bacto™酵母提取物和Bacto™胰蛋白胨购自Thermo Fisher Scientific（德国德赖艾希）。氯化钠购自Carl Roth（德国卡尔斯鲁厄）。所有单化合物化学品均以分析级纯度购买。6孔、24孔和96孔细胞培养板（平底）购自Sarstedt（德国尼姆布雷希特）。PCR聚合酶（PrimeSTAR Max）购自Takara Bio Europe（法国圣日耳曼昂莱）。NEBuilder Hifi DNA组装预混液购自New England Biolabs（德国美因河畔法兰克福）。质粒纯化用NucleoSpin试剂盒购自Macherey-Nagel（德国迪伦）。本研究所用菌株中，Escherichia coli Top10和BL21(DE3)购自Thermo Scientific，Pseudomonas putida KT2440和Bacillus subtilis str. 168购自DSMZ。

【数据】试剂来源：SIGMA-Aldrich/Merck、VWR Chemicals、Alfa Aesar、Thermo Fisher Scientific、Carl Roth、Sarstedt、Takara Bio Europe、New England Biolabs、Macherey-Nagel；菌株来源：Thermo Scientific、DSMZ

2.2 不同宿主菌株的初步毒性测试

初步毒性测试中，将10 mL含有不同醇浓度的Luria-Bertani（LB）培养基以相应测试生物过夜培养物接种至OD600为0.1，在37°C、130 rpm条件下培养。前4小时观察生长情况，24小时后使用Cary 60 UV-vis分光光度计（Agilent）在600 nm处测量浊度作为光密度值。使用不同醇浓度来确定每种生物的致死浓度。毒性效应和致死性通过与无醇影响的对照比较来确定。随后，将浓度调整为更窄的浓度范围，以观察所有醇存在下的较慢生长。

【数据】培养基：LB；接种OD600：0.1；温度：37°C；转速：130 rpm；观察时间：4h和24h；检测波长：600nm

2.3 1-己醇对不同宿主菌株毒性的深入分析

为进一步测试1-己醇对测试生物的毒性，将50 mL LB培养基接种各生物细胞并在37°C下过夜培养。将这些培养物与新鲜LB培养基和不同醇浓度混合，使OD600为0.1、终体积为1 mL，置于24孔板中。样品在37°C、160 rpm条件下振荡。使用Tecan Infinite m200酶标仪在0–8小时内每小时测量OD600，并在孵育24小时后再次测量。每次测量前，充分混合细胞以分离积聚的细胞并均匀分布细胞悬液。

比生长速率µ根据以下公式确定：ln Nt - ln N0 = µ(t - t0)。µ通过µ = [ln(OD600)t - ln(OD600)0] / (t - t0)计算，其中t为目标时间点，t0为前一时间点（通常为1小时前），OD600为在600 nm处测量的培养物浊度/吸光度。

为研究醇处理后的恢复能力并为静息细胞活力测试提供可比数据，在每个时间点取出10 µL样品，用25 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.2）稀释至OD600为0.1，取10 µL稀释样品接种至终体积200 µL的LB培养基中（96孔板）。培养板再次在160 rpm、37°C条件下振荡24小时。之后通过目视和酶标仪观察生长情况。

【数据】培养基：LB；接种OD600：0.1；终体积：1mL（24孔板）；温度：37°C；转速：160rpm；测量间隔：每小时（0–8h）及24h；稀释缓冲液：25mM磷酸钠缓冲液pH 7.2；恢复培养体积：200µL（96孔板）

2.4 大肠杆菌静止期和静息状态的活力测试

为检验高细胞密度下细胞的活力，将100 mL LB肉汤接种至OD600为0.1，在37°C下于锥形瓶中培养至OD600为1，以确保充分通气。随后，将细胞与相应百分比的醇混合至终体积1 mL（24孔板）。细胞在37°C、160 rpm条件下振荡，在0 h、1 h、2 h和24 h时取出5 µL样品，涂布于方形LB琼脂平板（1.5%琼脂）上，37°C过夜培养。用UVP GelStudio Plus（Analytik Jena）记录生长情况。通过比较可见菌苔、单菌落或无生长来确定活力，生长越少对应活力越低。

对于静息细胞状态的活力测试，将E. coli Top10野生型和携带pBAD/HisA_fdr_fd_cyp质粒的E. coli Top10按2.7和2.8节所述方法培养和处理。同样在0 h、1 h、2 h和24 h取出样品并涂布于方形LB琼脂平板上。

【数据】培养基：LB肉汤；接种OD600：0.1；培养至OD600：1；醇处理终体积：1mL；温度：37°C；转速：160rpm；取样时间：0、1、2、24h；涂布量：5µL；琼脂浓度：1.5%

2.5 光学显微镜观察

为观察大肠杆菌的生理变化，在实验开始和结束时各取50 µL细胞培养物。培养物通过离心收集，细胞重悬于500 µL 25 mM磷酸钠缓冲液中。取10 µL液滴滴加至覆盖有琼脂糖层的载玻片上，琼脂糖层由含1%琼脂糖的相同缓冲液组成。样品加盖玻片覆盖，用40×或100×物镜记录。显微镜观察使用Olympus BX51显微镜、Retiga 3电荷耦合器件相机（QImaging）和LED光源（Sola 365；Lumencor）进行。

【数据】取样量：50µL；重悬体积：500µL；缓冲液：25mM磷酸钠缓冲液；琼脂糖浓度：1%；物镜倍数：40×或100×

2.6 全细胞生物催化融合构建体的构建

编码铁氧还蛋白还原酶（FDR）和铁氧还蛋白（FD）的基因fdr和fd（GenBank登录号AB221118）来自Acinetobacter sp. OC4，由Genscript（荷兰阿姆斯特丹）合成。来自Polaromonas sp. JS666（ATCC BAA-500）的CYP153A基因由GeneArt ThermoScientific（德国雷根斯堡）合成。表达载体使用pBAD/His A（Thermo Scientific）。基因和载体通过Gibson组装融合，产生FDR_FD_CYP顺序的融合蛋白，每个蛋白间由短螺旋连接肽（EAAKEAAK）连接。扩增引物序列见Supporting Table S1。

PCR程序以95°C初始变性2分钟开始，随后30个循环的变性（95°C，15秒）、退火（60°C，15秒）和延伸（72°C，30秒）。循环结束后，进行最终延伸步骤（72°C，10分钟）。聚合酶使用PrimeSTAR Max。PCR产物用DpnI在37°C下过夜消化，随后按照制造商说明使用NEBuilder Hifi DNA Assembly Master Mix（NEB）进行Gibson组装。

【数据】PCR程序：95°C 2min初始变性；30循环（95°C 15s变性、60°C 15s退火、72°C 30s延伸）；72°C 10min最终延伸；DpnI消化：37°C过夜；连接肽序列：EAAKEAAK

2.7 大肠杆菌的培养、转化和蛋白生产

E. coli Top10细胞通过热激法[30]用2 µL Gibson混合物转化，随后涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基琼脂平板[30]上进行抗性筛选。挑取单菌落进行菌落PCR，阳性克隆在液体LB中37°C过夜培养。按照制造商说明进行质粒制备。构建体通过热激法导入化学感受态E. coli Top10细胞（CaCl2法），并在LB琼脂氨苄青霉素平板上培养。挑取单菌落接种至含抗生素的50 mL LB锥形瓶中。培养物在37°C下生长16小时，随后用于接种1 L LB-Amp培养物。培养物生长至光密度（OD600）为0.7，用0.02% L-阿拉伯糖诱导。诱导后，细胞在150 rpm、20°C条件下振荡16小时。

【数据】氨苄青霉素浓度：100µg/mL；接种体积：50mL→1L；诱导前OD600：0.7；诱导剂：0.02% L-阿拉伯糖；诱导温度：20°C；转速：150rpm；诱导时间：16h

2.8 全细胞生物转化及产物提取

蛋白生产后，收集细胞（6420 × g，4°C，20分钟），重悬于含1%甘油、0.4%葡萄糖的25 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.2）中，用缓冲液稀释至OD600为20。随后，以20 mM底物在100 mL锥形瓶中开始生物转化，总体积10 mL，在28°C、130 rpm条件下振荡。在0 h和1 h时间点各取1 mL样品，加入1 mL含1 mM环己酮（作为内标）的EtOAc，剧烈涡旋混合。短暂离心（17000 × g，1分钟）后，取800 µL上清液，加入一药匙尖无水MgSO4干燥，涡旋并再次离心。随后将液相转移至玻璃样品瓶中，用隔垫密封。

【数据】离心收集：6420×g、4°C、20min；重悬缓冲液：25mM磷酸钠缓冲液pH 7.2、含1%甘油、0.4%葡萄糖；反应OD600：20；底物浓度：20mM；反应体积：10mL（100mL锥形瓶）；温度：28°C；转速：130rpm；取样时间：0h、1h；萃取：1mL EtOAc含1mM环己酮内标；离心：17000×g、1min

研究结果

3.1 C1–C10伯醇的通用毒性测定

为鉴定适用于生物转化的最优表达宿主，研究选取了四种典型表达菌株——Escherichia coli BL21(DE3)和Top10、Pseudomonas putida KT2440及Bacillus Subtilis 168——并评估了它们在伯醇存在下的生长能力。为此，初始实验包括在六种同源伯醇（甲醇、乙醇、1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇和1-己醇）的宽浓度范围内粗略评估细胞生长。培养物在LB培养基中生长，在相应醇存在下接种至OD600为0.1。用于估算致死浓度的初步测定作为详细实验的基础，以确定所有菌株的毒性和致死浓度；E. coli Top10的代表性结果见Supporting Figs. S1和S2。为此，培养物在LB培养基中生长，接种至OD600为0.1并同时添加醇。细胞密度（OD600）测量至24小时。这些初始毒性测试在所有醇的宽浓度范围内进行，以找到已损害生长的浓度。

本研究的目标之一是寻找适合生产1-己醇的生物。图1显示了四种受试菌株在无醇和含1-己醇条件下8小时内的详细生长曲线（通过24孔板中OD600测量）。剂量依赖性行为清晰可见，有助于选择后续实验的浓度。生长行为的直接比较表明，B. subtilis和P. putida对1-己醇具有更好的耐受性，在0.2 vol% 1-己醇存在下仅表现出轻微的生长受损，而两种E. coli sp.在0.15 vol% 1-己醇存在下8小时内均无生长。

比生长速率µ（表1，图S4）也提供了类似的见解。B. subtilis和P. putida在1-己醇浓度高达0.1 vol%时µ max值仍保持在参考值的75%以上，而两种E. coli菌株在0.075 vol% 1-己醇时生长速率已显著降低（µ max <参考值的75%）。值得注意的是，在B. subtilis中观察到达到µ max的时间偏移，表明在0.15–0.3 vol%浓度范围内存在延长的迟滞期，但生长速率仍能达到参考值的50%以上。其他受试生物中未同样明显地观察到可比趋势。尽管如此，即使在最终OD600值低于无醇培养物的值，B. subtilis在高达0.3 vol%浓度下24小时后仍观察到生长。对于两种E. coli菌株和P. putida，经过延长的适应时间后，高达0.25 vol%的醇浓度可被耐受（图S3）。因此，即使在前8小时内未观察到生长，细胞仍保持活力并能在一定浓度范围内适应生理应激。

乙醇和1-己醇等醇类对生长的初始抑制在E. coli菌株中已被观察到[31,32]。适应醇诱导应激的方法因生物而异。E. coli可以改变质膜流动性以适应醇的影响[33]。具有自发突变的细胞如果某些基因被上调，也能更好地适应并耐受醇类[34]。P. putida具有复杂的醇分解代谢途径，其中这些醇的氧化以进一步代谢，因此有毒水平的积累被延迟[35]，而B. subtilis在细胞内积累脯氨酸和谷氨酸以获得更高的耐受性[36]。

菌株从醇应激中恢复的能力并行测试。从醇添加后立即、醇影响2、5和24小时后取自相同培养物的样品在无1-己醇的LB培养基中再生长24小时（图S5）。两种E. coli菌株即使在0.3 vol% 1-己醇的短暂暴露后也无法恢复，且仅能耐受0.2 vol%醇的短时间（<5小时）暴露。B. subtilis和P. putida在这些实验中耐受高达0.35 vol%的醇暴露。更高的浓度对生物体而言要么使细胞失活，要么致死。

为更全面地了解表达菌株对不同醇类的行为，对四种受试菌株进行了C1–C6伯醇的毒性测试。暴露24小时后不再观察到生长的浓度列于表2。总体而言，醇对受试生物的毒性取决于链长，与先前的研究结果[27,29,37]良好一致。处于高醇应激下的细胞还表现出细胞尺寸减小，E. coli Top10细胞在高浓度醇中发生聚集（图3）。

对于甲醇至1-丙醇，四种受试培养物的耐受性相当。对于较长链醇，P. putida和B. subtilis似乎比E. coli菌株BL21和Top10更能应对升高的醇水平。

我们根据以下标准评估了所有四种菌株作为指定反应——线性脂肪族的末端羟基化——的表达宿主：基因操作工具的可获得性（质粒、方案等）、基因构建体的生产效率、宿主酶对底物或产物的可能降解以及潜在的不期望背景反应。P. putida和B. subtilis对1-丙醇至1-己醇具有更好的耐受性，这归因于膜适应过程。对于P. putida，讨论了膜更快适应以降低溶剂渗透性并将溶剂转运出膜双层[37,38]。B. subtilis利用多药外排泵和主动生物降解作为一般应激反应[39]。由于甲醇和乙醇主要不在膜双层中积累，而是在细胞质中积累，它们似乎对所有受试生物具有相似的毒性效应。

尽管观察到对醇类（特别是1-丙醇至1-己醇）的耐受性增强，P. putida和B. subtilis并非预期生物转化的理想候选菌株。P. putida携带两种醇脱氢酶，对醇和醛分解代谢具有广泛的底物谱[35,40]，而B. subtilis具有用于伯醇羟基化的单加氧酶[41]。在我们手中也观察到这些菌株显著的1-己醇消耗（图S8），这在某种程度上解释了这两种表达宿主对1-己醇更好的耐受性：主动解毒可能有助于细胞活力，但使它们不适合醇的生产或转化。在E. coli sp.中未观察到同等程度的效果（图S9），这证实了我们的决策过程。

因此，选择E. coli BL21和Top10进行进一步研究，评估它们对C1至C10醇的反应，同时考虑到通过长期暴露作为进化驱动力或通过对外排泵调控等进行定向操作，可能实现靶向适应从而改善耐受性。此外，E. coli Top10被确定为蛋白生产菌株的首选，因为使用pBAD表达系统和E. coli Top10作为宿主生物时获得了最高量的可溶蛋白。由于该系统的araBAD操纵子，需要L-阿拉伯糖进行诱导。E. coli Top10携带araD139突变，阻断阿拉伯糖代谢以最佳利用诱导物。因此，该生物被确定为我们进一步研究的首要目标。

【数据】测试菌株：E. coli BL21(DE3)、E. coli Top10、P. putida KT2440、B. subtilis 168；醇类：甲醇、乙醇、1-丙醇、1-丁醇、1-戊醇、1-己醇（C1–C6）；E. coli生长抑制阈值：0.075 vol% 1-己醇；E. coli 8h无生长浓度：0.15 vol% 1-己醇；B. subtilis/P. putida耐受浓度：0.2 vol% 1-己醇轻微受损；B. subtilis 24h生长上限：0.3 vol%；E. coli/P. putida适应后耐受：0.25 vol%；恢复实验耐受：E. coli ≤0.2 vol%短时暴露，B. subtilis/P. putida ≤0.35 vol%；B. subtilis µ max >75%参考值上限：0.1 vol%

3.2 E. coli BL21和Top10菌株从OD600为1起始的毒性比较分析

对于异源蛋白的全细胞生物转化，基因表达和蛋白生产通常在OD600为0.5–0.9时诱导……

（注：原文节选在此处中断，后续内容未在提供的文本中完整呈现。）

讨论与解读

本研究的所有数据清楚地表明，除所施加的醇量外，还有许多因素影响微生物表达菌株的生长抑制效应。从C1至C6伯醇影响的初步总体评估中，四种不同表达菌株的链长-活力关系被量化。在这些数据中，生物体之间的显著反应差异变得明显。对于所研究的两种E. coli菌株，在这些实验中的行为大致相似。在后续更详细的研究中比较E. coli Top10和BL21(DE3)时，观察到了表型差异以及对中链醇耐受性的细微差异。

研究还表明，培养条件和生长状态影响E. coli菌株对简单醇类的耐受性。当在对数期之前的早期生长阶段暴露于应激源时，微生物比在对数期后暴露时更容易受到醇应激的影响。在后一种情况下，培养物中的细胞似乎有更多时间适应培养条件，因此可以应对更高的醇浓度。这导致在短时间暴露（1–2小时）下，短链醇的残余活力对应的醇浓度高出约15%。

考虑到E. coli Top10作为涉及醇类的生物转化宿主的适用性，残余活力……

编译者解读

本研究最值得借鉴之处在于将"菌株筛选—毒性机制—工艺应用"串成完整逻辑链：先通过系统的C1–C10醇耐受性图谱筛选出合适宿主，再针对实际生物转化条件（高密度静息细胞）重新评估毒性阈值，避免了传统研究中"只筛不验"的脱节。发现高细胞密度可耐受更高醇浓度这一现象，对工业上底物流加策略的设计具有直接参考价值。局限在于毒性评估主要基于LB复杂培养基和摇瓶条件，与工业发酵罐中的气液传质和营养环境仍有差距；此外，醇胁迫下细胞形态变化的分子机制未深入探讨。对合成生物学研究者而言，这项工作提示：宿主选择不能只看蛋白表达量，底物/产物的原位毒性应作为设计全细胞催化剂时的核心考量参数。

参考来源

期刊：Molecular Catalysis, 2023

DOI: 10.1016/j.mcat.2023.112979

DOI: 10.1016/j.mcat.2023.112979