来源：Screening of nystatin high-yielding recombinant strains in response to spaceflight and elucidation of digitoxose biosynthesis（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
多组分抗生素制霉菌素因组分复杂制约了其临床应用与工业化生产。本研究采用异源表达策略，将来源于 Streptomyces sp. ZY01 的 123.8 kb 制霉菌素生物合成基因簇成功导入多种链霉菌宿主，并在 S. albus J1074 中获得微量产物——包括一种前所未有的 35 元大环内酯新化合物 nystatin A1–2。随后利用中国实践十九号卫星开展太空诱变，获得产量提升近 10 倍的高产菌株 SSC133。研究还首次阐明了制霉菌素中迪吉托糖糖基的生物合成基因簇，鉴定出核心基因簇外 54 kb 处的七个关键基因，其中 polyVII 编码一个此前未知的 4-酮还原酶。
研究背景
制霉菌素是一种多烯大环内酯类抗真菌抗生素，自 20 世纪 50 年代发现以来，一直是治疗局部念珠菌感染的基础药物。美国 Medicaid 处方数据显示，2009–2023 年间其处方量远超其他抗真菌药物，足见其广泛的临床使用和重要性。然而，这种广泛使用也折射出一个长期存在的悖论——制霉菌素的工业生产长期面临质量控制、纯化和标准化方面的难题。中国本土菌株 Streptomyces sp. ZY01 产生的制霉菌素变体主要由 nystatin A3、polyfungin B 和 albonoursin 组成，仅含微量 nystatin A1。这种组分复杂性既损害了生产工艺的一致性，也影响最终产品的均一性，进而对药物安全性和疗效产生不利影响。其中 albonoursin 是无治疗活性的组分，化学法分离不仅技术难度大，还需消耗大量有机溶剂。对 ZY01 的基因工程改造——尤其是 CRISPR 介导的基因敲除——面临重大挑战，阻碍了菌株改良和代谢途径解析。异源表达为解决遗传难驯化菌株相关难题提供了关键策略，coumermycin A1、chelocardin 和 YM-216391 等天然产物的成功表达均属此类案例。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用全部细菌菌株列于表 S1。制霉菌素原始产生菌 S. sp. ZY01 由浙江震元制药有限公司惠赠。参照菌株 S. noursei ATCC 11455 购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。用于制霉菌素生物合成基因簇（BGC）文库构建与筛选的 pMSBBAC1 载体和电转感受态 E. coli DH10B 细胞均购自武汉靶星生物科技有限公司[31]。所有菌株均在 MS 琼脂培养基（2% 甘露醇、2% 大豆粉、1.8% 琼脂）上、添加相应抗生素、28°C 培养 7 天。
【数据】培养基：MS 琼脂（2% 甘露醇、2% 大豆粉、1.8% 琼脂）；温度：28°C；时间：7 天
2.2 基因合成、DNA 操作与载体组装
本研究所用质粒和引物列于表 S2、表 S3。以 ZY01 基因组为模板，使用引物 polyI-polyVI-FW/polyI-polyVI-RW 扩增六个连续基因（polyI–polyVI）。同时以高表达载体 pWHM3-ermEp 为模板，使用引物 pWHM3-ermEp-FW/RW 扩增获得线性化片段[32]。将上述两个片段通过 Gibson Assembly 组装，构建质粒 pWHM3-ermEp-polyI-polyVI，反应混合物转化入宿主菌。以 ZY01 为模板、nysDI-FW/nysDI-RW 为引物扩增 nysDI 基因，通过 Gibson Assembly 组装至 EcoRI 酶切后的 pWHM3-ermEp 载体，生成 pWHM3-ermEp-nysDI。质粒 pWHM3-ermEp-selSV 和 pWHM3-ermEp-cmiM5 由华大基因定制合成并组装。三个质粒（pWHM3-ermEp-nysDI、pWHM3-ermEp-selSV、pWHM3-ermEp-cmiM5）分别导入 J1074-nystatin BGC 原生质体，获得菌株 J1074-nystatin BGC-pWHM3-ermEp-nysDI、J1074-nystatin BGC-pWHM3-ermEp-selSV 和 J1074-nystatin BGC-pWHM3-ermEp-cmiM5。为研究 polyVII 的功能，以 ZY01 为模板、polyVII-FW/polyVII-RV 为引物扩增 polyVII 片段，通过 Gibson assembly 插入 EcoRI 酶切的 pWHM3-ermEp-polyI-polyVI 质粒，构建 pWHM3-ermEp-polyI-polyVI-polyVII。类似地，以 pET28a-eryBIV 为模板、eryBIV-FW/eryBIV-RV 为引物扩增 eryBIV，插入 pWHM3-ermEp-polyI-polyVI，生成 pWHM3-ermEp-polyI-polyVI-eryBIV。两个质粒分别转化 SSC133 和 SSC133nysL 原生质体，获得菌株 J1074-nystatin BGC-SSC133-pWHM3-ermEp-polyI-polyVI-polyVII、J1074-nystatin BGC-SSC133-pWHM3-ermEp-polyI-polyVI-eryBIV、J1074-nystatin BGC-SSC133nysL-pWHM3-ermEp-polyI-polyVI-polyVII 和 J1074-nystatin BGC-SSC133nysL-pWHM3-ermEp*-polyI-polyVI-eryBIV。
【数据】模板：ZY01 基因组；载体：pWHM3-ermEp*；酶切位点：EcoRI；组装方法：Gibson Assembly；引物对：polyI-polyVI-FW/RW、nysDI-FW/nysDI-RW、polyVII-FW/polyVII-RV、eryBIV-FW/eryBIV-RV
2.3 基因组 BAC 文库构建
使用琼脂糖包埋法[33]提取基因组 DNA 至 TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0）。在优化条件下用 BamHI 对 DNA 进行部分酶切：冰上孵育 90 分钟，随后 37°C 酶切 8 分钟。酶切后的 DNA 片段经 1% 琼脂糖脉冲场凝胶电泳分离，通过电洗脱回收 100–180 kb 的 DNA 片段。同时纯化 BAC 载体 pMSBBAC1 并用 BamHI 限制性内切酶线性化[34]。将纯化的大片段 DNA 与线性化载体用 T4 DNA 连接酶于 16°C 连接过夜。连接产物脱盐后通过电穿孔转化入电转感受态 E. coli DH10B 细胞（图 S3A）。转化子在含适当抗生素及 X-gal/IPTG 的 LB 琼脂平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落（代表潜在重组克隆），排列至含 15% 甘油的 LB 培养基的 384 孔微量滴定板中。文库分为 8 个池，每池含一块 384 孔板。37°C 培养 20 小时后，平板于 −80°C 长期保存（图 S3A）。
【数据】TE 缓冲液：10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA，pH 8.0；BamHI 部分酶切：冰上 90 min + 37°C 8 min；片段大小：100–180 kb；连接：T4 DNA 连接酶，16°C 过夜；转化：电穿孔；筛选：X-gal/IPTG 蓝白斑；文库规格：8 池 × 384 孔；甘油：15%；培养：37°C，20 h；保存：−80°C
2.4 含制霉菌素 BGC 阳性克隆的筛选
为鉴定携带制霉菌素生物合成基因簇的克隆，采用层级筛选策略。分别提取每个板池各行和各列的质粒混合物，构建行克隆和列克隆。设计六对特异性引物靶向 BGC 的不同区域：簇前区（Region35–1-FW/RV）、上游区（Region35–2-FW/RV）、中间区（Region35–3-FW/RV 和 Region35–4-FW/RV）、下游区（Region35–5-FW/RV）和簇后区（Region35–6-FW/RV）（表 S3）。使用这些引物对所有八个板池进行系统筛选。根据初筛结果，使用行克隆和列克隆进行二次 PCR 筛选以精确定位阳性克隆。阳性克隆接种于含阿普拉霉素（Apr）的 LB 液体培养基中，37°C、220 rpm 振荡培养 16 小时。使用六对引物通过 PCR 扩增确认完整制霉菌素 BGC 的存在。
【数据】引物对：6 对（Region35–1 至 Region35–6）；抗生素：阿普拉霉素（Apr）；培养：37°C，220 rpm，16 h；筛选策略：层级 PCR（板池→行/列克隆）
2.5 制霉菌素生物合成基因簇的异源表达
将前述阳性克隆制备的经验证的 pMSBBAC1-nystatin BGC 构建体导入模式链霉菌菌株——S. albus J1074、S. coelicolor M1154、S. coelicolor M1152、S. lividans TK24 和 S. lividans 1326，转化方法参照已有方案[35]。转化子在 MS 琼脂平板上筛选，28°C 培养 7 天。使用四对引物（Region35–2-FW/RV、Region35–3-FW/RV、Region35–4-FW/RV 和 Region35–5-FW/RV）通过 PCR 扩增确认制霉菌素 BGC 的成功整合（表 S3）。
【数据】宿主菌：S. albus J1074、S. coelicolor M1154/M1152、S. lividans TK24/1326；培养：MS 琼脂，28°C，7 天；验证：4 对引物 PCR
2.6 链霉菌中的基因抑制与碱基编辑
CRISPR-cBEST 质粒用于链霉菌基因抑制。sgRNA 的 20 核苷酸（nt）间隔序列（N20）使用 CRISPy-web 软件（https://crispy.secondarymetabolites.org）设计[36]。对于碱基编辑应用，将合成并退火的寡核苷酸双链体（序列为 5´-CGGTTGGTAGGATCGACGGC-(N20)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′）（表 S3）通过 Gibson assembly 组装至 pCRISPR-cBEST 载体的 NcoI 限制性酶切位点，生成 CRISPR-cBEST 质粒。将 cBEST 质粒导入链霉菌后，转化子在 MS 琼脂平板上 28°C 连续培养三代。随后挑选 5–8 个转化子进行 DNA 测序分析。目标突变体定义为携带导致提前翻译终止突变的菌株。
【数据】sgRNA 间隔序列：20 nt；载体骨架：pCRISPR-cBEST；酶切位点：NcoI；培养：MS 琼脂，28°C，三代；测序转化子数：5–8 个
2.7 发酵产物提取
菌株在含适当抗生素的 MS 琼脂培养基上 28°C 培养 7 天制备发酵接种物。随后分别进行液体发酵和固体发酵。液体发酵在含发酵培养基 V 的 100 mL 摇瓶中进行（培养基组成：6.0% 葡萄糖、0.2% (NH₄)₂SO₄、0.2% CaCO₃、0.8% 蛋白胨、0.2% MgSO₄、0.05% 大豆粉、2.5% 蚕蛹粉，每 30 mL 培养基加 0.1 mL 鲁花花生油）。液体发酵条件为 28°C、220 rpm 振荡。固体发酵使用 MS 培养基，28°C 培养 7 天。发酵结束后，菌丝体用甲醇提取。提取液离心，收集上清液用于下游检测。
【数据】液体培养基：发酵培养基 V（6.0% 葡萄糖、0.2% (NH₄)₂SO₄、0.2% CaCO₃、0.8% 蛋白胨、0.2% MgSO₄、0.05% 大豆粉、2.5% 蚕蛹粉、0.1 mL/30 mL 花生油）；液体发酵：28°C，220 rpm；固体发酵：MS 培养基，28°C，7 天；提取溶剂：甲醇
2.8 通用实验流程
制霉菌素的分析与定量在 Thermo Scientific Ultimate 3000 HPLC 系统上进行。流动相由溶剂 A（乙腈）、溶剂 B（甲醇）和溶剂 C（含 0.8% 乙酸的 28 mM 乙酸铵）组成。流速恒定为 1 mL/min。流动相梯度洗脱程序如下：0 分钟，25% B、25% A、50% C；25 分钟，25% B、55% A、20% C；35–40 分钟，25% B、25% A、50% C（再平衡）。进样量原文未详述。
【数据】HPLC 系统：Thermo Scientific Ultimate 3000；流动相：乙腈/甲醇/28 mM 乙酸铵（含 0.8% 乙酸）；流速：1 mL/min；梯度：0 min（25% B/25% A/50% C）→ 25 min（25% B/55% A/20% C）→ 35–40 min（25% B/25% A/50% C）
研究结果
3.1 制霉菌素 BGC 的文库构建、筛选与异源表达
通过 antiSMASH 分析，在 ZY01 基因组中鉴定出完整的制霉菌素 A1 生物合成基因簇，跨度达 123.8 kb（表 S4）。将该基因簇克隆至 pMSBBAC1 载体构建重组文库（图 S3B）。共获得约 1536 个阳性克隆，使用针对制霉菌素基因簇设计的特异性引物进行 PCR 筛选。筛选后鉴定出 4 个阳性克隆，其中 1 个命名为 pMSBBAC1-nystatin BGC 的克隆经 PCR（图 S3C）和末端测序确认含有完整基因簇。该阳性重组载体用于后续实验。
随后将 pMSBBAC1-nystatin BGC 转入不同链霉菌宿主，包括 S. albus J1074、S. coelicolor M1152/M1154、S. lividans TK24/1326（图 1A）。研究发现，四种异源宿主菌——S. coelicolor M1152 和 M1154、S. albus J1074 及 S. lividans TK24——均成功产生制霉菌素及其同系物。无活性副产物 albonoursin 在这些异源宿主中被成功消除。然而产量普遍较低，可能归因于宿主兼容性差和生物合成基因簇表达欠佳。其中 S. albus J1074 因制霉菌素产量最优而被选作进一步研究对象，命名为菌株 J1074-nystatin BGC。J1074-nystatin BGC 的全基因组测序证实制霉菌素 BGC 以单拷贝精确整合至宿主 J1074 的假 attB 位点。J1074-nystatin BGC 菌株的主要产物为 nystatin A1（1）及其异构体 nystatin A1–2（2）。nystatin A3（3）和 polyfungin B（4）的缺失表明所导入的制霉菌素基因簇可能不支持 l-迪吉托糖的生物合成或连接（图 1B）。
【数据】基因簇大小：123.8 kb；BAC 文库阳性克隆数：约 1536 个；阳性克隆：4 个；整合方式：单拷贝、假 attB 位点；主要产物：nystatin A1 和 nystatin A1–2
3.2 nystatin A1–2 的结构解析与活性评估
使用 J1074-nystatin BGC 菌株进行液体发酵实验。菌液经甲醇提取后分离获得 nystatin A1–2（2）。化合物 2 为白色无定形粉末，HRESIMS 数据显示其与 nystatin A1 具有相同分子式。NMR 数据结合紫外-可见（UV–vis）吸收最大值 291、305 和 319 nm（图 S4）揭示化合物 2 是 nystatin A1 的类似物。比较化合物 2 与 nystatin A1 的 NMR 数据（表 S5、图 S5、图 S6），化合物 2 中 H-35 的共振信号显著位移 +1.54 ppm，而 H-37 位移 −1.42 ppm。此外，C-34、C-34-甲基、C-36-甲基和 C-37 的共振信号相对于 nystatin A1 分别高场位移 3.8、5.1、3.2 和 5.5 ppm。这些差异表明化合物 2 中酯键应在 C-35 和 C-1 之间形成。C-1 与 C-35 之间的酯键连接通过 H-35 到 C-1 的 HMBC 相关得到确认，揭示化合物 2 具有一个不寻常的 35 元大环内酯环。由此确定了化合物 2 的平面结构（图 2）。由于化合物 2 和 nystatin A1 源自同一生物合成基因簇，二者的绝对构型应一致。此外，化合物 2 的 CD 谱与 nystatin A1 一致（图 S7、图 S8），也支持上述推断。
nystatin A1–2 的抗真菌活性低于 nystatin A1，其对所有测试念珠菌株的 MIC 值均一致性地更高（表 S6）。例如，对光滑念珠菌 C2001，A1–2 的 MIC（4 μg/mL）是 A1（2 μg/mL）的两倍。这种效力降低在对白色念珠菌 3147 和 562 菌株中更为显著。这一致性模式表明结构修饰显著损害了抗真菌效力。显著升高的 MIC 值确立了 nystatin A1–2 作为一种效力明显减弱的抗真菌剂，凸显了 nystatin A1 特定结构特征对其生物活性的关键贡献。
【数据】UV–vis 吸收最大值：291、305、319 nm；H-35 位移：+1.54 ppm；H-37 位移：−1.42 ppm；C-34 高场位移：3.8 ppm；C-34-甲基：5.1 ppm；C-36-甲基：3.2 ppm；C-37：5.5 ppm；MIC（光滑念珠菌 C2001）：A1–2 为 4 μg/mL，A1 为 2 μg/mL；环大小：35 元
3.3 太空诱变选育制霉菌素 A1 高产菌株
利用太空独特诱变环境——包括高真空、高能离子辐射和微重力——对重组微生物菌株 J1074-nystatin BGC 进行诱变。菌株密封于含斜面培养基的 2 mL 冻存管中，搭载于中国首颗可重复使用返回式技术试验卫星——实践十九号，该卫星于 2024 年 9 月 27 日发射、2024 年 10 月 11 日回收。环境条件包括：高真空（低于 10⁻⁵ Pa）、微重力水平 2 × 10⁻⁷ 至 7 × 10⁻⁷ g、辐射剂量 0.153–0.217 rad（Si）、恒温 15°C ± 1°C。
返回菌株首先在琼脂平板上复苏培养。共获得 300 个单孢子分离株用于后续分析。分离株经固体发酵后，使用 HPLC 分析产量。观察到 22.3% 的测试菌株（67/300）制霉菌素产量增加，色谱峰高超过 100 mAu，而原始菌株约为 50 mAu（图 3A）。其中 10 株达到高产水平（400–800 mAu），分别命名为 SSC24、SSC25、SSC77、SSC118、SSC133、SSC136、SSC156、SSC182、SSC187 和 SSC264。
基于初筛结果，将十株菌在液体培养基中进行三重复发酵。结果表明 SSC118、SSC133 和 SSC182 产生较高水平的 nystatin A1，其中 SSC133 表现最佳（图 S9）。经传代验证，三株菌均确认为稳定的高产菌株。根据 nystatin A1 和 A1–2 的峰面积及其标准曲线方程，SSC133 菌株中二者的浓度分别计算为 106.30 ± 8.45 μg/mL 和 180.15 ± 13.16 μg/mL。这些数值分别是原始菌株中 nystatin A1（11.63 ± 2.06 μg/mL）和 nystatin A1–2（21.44 ± 2.63 μg/mL）浓度的 9.11 倍和 8.40 倍（图 3B、表 S7）。此外，在相同条件下检测了已知 nystatin A1 产生菌 ATCC 11455 的发酵情况。ATCC 11455 产生 nystatin A1（53.59 ± 10.71 μg/mL）和 nystatin A1–2（42.33 ± 11.32 μg/mL），以及前体 10-脱氧制霉菌素 A1（6）（图 3B-C）。与 ATCC 11455 相比，SSC133 菌株表现出更高的 nystatin A1 及其同系物 nystatin A1–2 产量。
【数据】飞行时长：2024-09-27 至 2024-10-11；真空度：<10⁻⁵ Pa；微重力：2×10⁻⁷ 至 7×10⁻⁷ g；辐射剂量：0.153–0.217 rad（Si）；温度：15°C ± 1°C；单孢子分离株：300 个；产量增加菌株比例：22.3%（67/300）；原始菌株峰高：约 50 mAu；高产菌株峰高：400–800 mAu；SSC133 中 nystatin A1 浓度：106.30 ± 8.45 μg/mL（9.11 倍）；A1–2 浓度：180.15 ± 13.16 μg/mL（8.40 倍）；原始菌株 A1：11.63 ± 2.06 μg/mL；A1–2：21.44 ± 2.63 μg/mL；ATCC 11455：A1 为 53.59 ± 10.71 μg/mL，A1–2 为 42.33 ± 11.32 μg/mL
3.4 太空暴露菌株的基因组与转录组分析
对高产太空突变株 SSC133 与其地面亲本菌株 J1074-nystatin BGC 的基因组进行共线性分析，结果显示整体基因组结构高度保守（图 S10A）。基因排列顺序和方向几乎完全保留，这有力排除了大规模染色体易位、倒位或 Mb 级重复等大型结构变异作为产量提升的主要机制。此外，尽管在 6.7 Mb 附近检测到局部重排事件（结构变异，SV），但该区域与制霉菌素 BGC 的核心区域不重叠，进一步缩小了产量提升机制的搜索范围。两菌株间所有基因组特征和变异的综合分析汇总于 Circos 图（图 S10B）。唯一 SNP 变异被鉴定为同义突变（ctg1_5498），不改变氨基酸序列（图 S10C）。关键的是，InDel 事件主要位于基因间区或紧邻编码序列的调控元件中（图 S10D）。受影响的基因类型包括 ATPase/组氨酸激酶、TetR/AcrR 家族转录调控因子和 HTH 型调控蛋白。
【数据】SV 位置：约 6.7 Mb（与 BGC 核心区不重叠）；SNP：1 个（ctg1_5498，同义突变）；InDel 位置：基因间区/调控元件
3.5 制霉菌素基因簇的转录分析
为探究 SSC133 菌株中制霉菌素生物合成基因簇的转录水平变化，进行了转录组分析。结果显示，与亲本菌株 J1074-nystatin BGC 相比，SSC133 中制霉菌素生物合成基因的转录水平显著上调，包括 nysC 和 nysL 等基因（图 4A）。nysC 编码聚酮合酶模块，负责制霉菌素大环内酯环的组装；nysL 则参与糖基的修饰或连接过程。上调表达的差异基因覆盖了从聚酮链延伸、环化到后修饰的多个环节（图 4B-C），表明太空诱变通过转录水平的全局性调控促进了制霉菌素的过量合成。
【数据】上调基因：nysC、nysL 等；分析方法：转录组测序
3.6 TCS 基因在制霉菌素产量中的作用探究
为考察双组分调控系统（TCS）基因对制霉菌素产量的影响，构建了四个 TCS 基因突变菌株，并比较了其 nystatin A1 和 A1–2 相对产量（倍数变化）与野生型对照菌株（J1074-nystatin BGC，灰色柱）的差异（图 5）。数据显示不同 TCS 基因的突变对制霉菌素产量产生不同程度的影响，证实 TCS 系统参与制霉菌素生物合成的调控。
【数据】突变菌株数：4 个 TCS 基因；对照：J1074-nystatin BGC；检测指标：nystatin A1 和 A1–2 相对产量（倍数变化）
3.7 基因组指导的 S. sp. ZY01 迪吉托糖产生基因挖掘
对含有迪吉托糖的 jadomycin、selvamicin、nystatin、cremimycin 和 kijanimicin 产生菌基因组进行 antiSMASH 分析（图 6）。通过比较基因组学方法，在 S. sp. ZY01 基因组中鉴定出负责迪吉托糖生物合成的基因簇。该基因簇位于制霉菌素核心 BGC 之外约 54 kb 处，包含七个连续基因 polyI–polyVI 及 polyVII。这些基因的序列特征和推定功能通过生物信息学分析进行了注释。
【数据】位置：核心 BGC 外 54 kb；基因数：7 个（polyI–polyVI、polyVII）
3.8 ZY01 来源迪吉托糖生物合成基因的功能描述
为验证 ZY01 来源的迪吉托糖生物合成基因的功能，在 SSC133 菌株中进行了异源互补实验（图 7A）。将携带 polyI–polyVI 的表达质粒 pWHM3-ermEp*-polyI-polyVI 导入 SSC133 菌株，检测迪吉托糖的合成情况。在此基础上，分别导入 polyVII 和 eryBIV（来自红霉素生物合成基因簇的已知 4-酮还原酶基因）进行功能比较。实验设置了多个菌株组合进行功能验证，包括 SSC133 野生型、单独表达 polyI–polyVI、以及共表达 polyI–polyVI 与 polyVII 或 eryBIV 的菌株。
【数据】宿主菌：SSC133；表达质粒：pWHM3-ermEp-polyI-polyVI、pWHM3-ermEp-polyI-polyVI-polyVII、pWHM3-ermEp*-polyI-polyVI-eryBIV
讨论与解读
制霉菌素作为治疗浅表真菌感染的基石性抗真菌药物，其临床重要性不言而喻。然而，组分复杂性导致的批次间差异和纯化困难长期困扰着工业生产。本研究通过两条技术路径有效应对了这些挑战：基因簇异源表达和太空诱变育种。
异源表达策略成功绕过了原始菌株 ZY01 遗传操作困难的障碍。123.8 kb 的巨大基因簇在 S. albus J1074 中实现了单拷贝精确整合，并成功消除了无活性副产物 albonoursin——这是化学分离法长期面临的难题。值得注意的是，异源宿主中产生了新化合物 nystatin A1–2——首个具有 35 元大环内酯环的多烯大环内酯类化合物，其结构经 NMR 和 HMBC 相关得以确证。活性评估显示该异构体的抗真菌效力显著低于 nystatin A1，说明大环内酯环的尺寸或酯键位置对生物活性至关重要。
太空诱变是本研究另一亮点。实践十九号卫星提供的独特空间环境——高真空、微重力和宇宙辐射——使 22.3% 的返回菌株产量增加，其中 SSC133 的 nystatin A1 和 A1–2 产量分别达 106.30 ± 8.45 μg/mL 和 180.15 ± 13.16 μg/mL，较原始菌株提升 9.11 倍和 8.40 倍，甚至超过已知产生菌 ATCC 11455。基因组分析排除了大片段结构变异作为主要机制，转录组数据则显示 nysC、nysL 等基因的转录上调是产量提升的重要原因。
迪吉托糖生物合成途径的阐明是另一重要突破。通过 antiSMASH 比较基因组分析，在距核心 BGC 54 kb 处定位到七个必需基因（polyI–polyVI），其中 polyVII 编码一个此前未表征的 4-酮还原酶。这一发现填补了制霉菌素中迪吉托糖生物合成的认知空白。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"异源表达 + 太空诱变"双策略联用的强大潜力。异源表达不仅解决了原始菌株遗传操作困难的问题，还意外发现了新的大环内酯异构体——这提示 BGC 的异源表达不仅是产物重构工具，更是结构多样性的潜在来源。太空诱变作为一种非理性育种手段，其效率（22.3% 阳性率）令人印象深刻，但机制解析仍面临挑战——本研究中基因组仅发现同义 SNP 和基因间区 InDel，暗示表观遗传或调控层面的变化可能更为关键。迪吉托糖基因簇的定位为理性改造制霉菌素组分提供了分子靶点，但 polyVII 作为新型 4-酮还原酶的具体催化机制仍待生化表征。整体而言，该研究为复杂天然产物的组分优化提供了可借鉴的技术范式。
参考来源
Li K. Screening of nystatin high-yielding recombinant strains in response to spaceflight and elucidation of digitoxose biosynthesis. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2025.171702
DOI: 10.1016/j.cej.2025.171702