来源：Discovery, engineering and application of a maleate isomerase for efficient L-malic acid biosynthesis via dual-enzyme cascade with fumarase（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-苹果酸是食品、医药和化妆品行业广泛应用的有机酸。本研究通过生物信息学大数据挖掘，从数千条候选序列中鉴定出源自Schaalia vaccimaxillae的高活性顺丁烯二酸异构酶（SvMI），并借助深度学习工具预测突变位点，获得活性提升153.6%的突变体A124V。该突变酶与延胡索酸酶BtFum在大肠杆菌中共表达，构建一锅法双酶级联体系，在优化条件下将150 g/L顺丁烯二酸转化为171.4 g/L L-苹果酸，时空产率达14.28 g·(L·h)⁻¹，展示了良好的工业应用前景。
研究背景
L-苹果酸全球市场稳步增长，消费者对食品饮料天然成分的需求是主要驱动力。作为一种天然水果有机酸，L-苹果酸契合"天然标签"趋势，其酸味品质和功能特性优于延胡索酸甚至柠檬酸等合成酸味剂。在医药领域，L-苹果酸可改善药物稳定性与生物利用度；在化妆品中用于调节pH并提供保湿功效；工业上还用于金属清洗和电镀。此外，L-苹果酸是多种手性分子合成的关键前体。
目前L-苹果酸生产主要有三条途径。传统方法是在高温高压下催化石化来源的顺丁烯二酸或延胡索酸水合，该方法效率低且无选择性，产生D型和L型混合的外消旋产物，需昂贵且复杂的纯化步骤。微生物发酵利用曲霉属真菌或细菌转化可再生原料，但存在周期长、产物浓度低等问题。酶法催化因其高选择性和温和反应条件受到关注，但缺乏高效廉价的生物催化剂限制了其应用。本研究旨在通过大数据挖掘和蛋白质工程获得高活性顺丁烯二酸异构酶，并与延胡索酸酶偶联实现L-苹果酸的绿色高效合成。
研究方法
2.1 质粒、菌株与化学试剂
质粒构建使用大肠杆菌DH5α，酶表达使用大肠杆菌BL21(DE3)。pET28a和pETDuet-1作为表达载体。将MI基因克隆至Nco I和Xho I限制性酶切位点，构建pET28a-MI质粒。MI的C末端设计含有组氨酸标签。大肠杆菌BL21 ΔFumA ΔFumC用于酶表达和生物催化，其中负责将延胡索酸转化为苹果酸的FumA和FumC两个基因采用Yang等报道的基因删除方法敲除。含50 μg/mL卡那霉素或氨苄青霉素的Luria-Bertani（LB）培养基用于质粒构建和扩增。ClonExpress®II一步克隆试剂盒和2× Phanta Max Master Mix购自南京Vazyme Biotech Co., Ltd.。所有寡核苷酸由南京GenScript Biotech合成。PCR纯化、凝胶回收和质粒提取的DNA纯化试剂盒购自Omega BioTek。其他试剂和溶剂购自中国国药集团化学试剂有限公司。
【数据】培养基：LB；抗生素浓度：50 μg/mL卡那霉素或氨苄青霉素；菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)、BL21 ΔFumA ΔFumC；载体：pET28a、pETDuet-1；限制性酶切位点：Nco I、Xho I
2.2 顺丁烯二酸异构酶的发掘
以已知顺丁烯二酸异构酶（PDB登录号4FQ5）为参考，采用大数据挖掘方法鉴定新型候选酶。首先使用HMMER（v3.3.2）进行同源搜索和过滤，获得数千条序列。使用Dedal进行同源评分，并对专利数据库进行BLAST搜索。最终候选序列通过AlphaFold2预测三维结构，与参考结构经DeepAlign（TM-score）比对，综合BLAST指标和人工评估后确定用于湿实验验证。
【数据】参考蛋白：4FQ5；软件：HMMER v3.3.2、Dedal、BLAST、AlphaFold2、DeepAlign；筛选标准：TM-score、BLAST指标
2.3 顺丁烯二酸异构酶的智能设计
酶设计方法整合基于结构的过滤与深度学习以实现高效突变体筛选。首先，AlphaFold2和DiffDock预测蛋白质-配体复合物结构，鉴定活性位点附近的179个候选残基。随后使用集成ESM1v模型对所有可能的单点突变进行排序，经过严格的距离和一致性过滤，选择20个最优单突变体。对于双突变，将表现最佳的单突变体与其他活性位点进行组合配对，第二佳的突变体则根据ESM1v预测与剩余位点偶联，产生20个优先双突变体。该流程将计算预测与实验数据协同结合，实现智能化酶工程改造。
【数据】候选残基数：179个；单突变体筛选数：20个；双突变体筛选数：20个；软件：AlphaFold2、DiffDock、ESM1v
2.4 酶纯化
细胞通过10,000 ×g离心10 min收集，用20 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）洗涤。洗涤后，将收集的细胞沉淀重新悬浮于相同磷酸盐缓冲液中，超声破碎。细胞碎片通过相同条件（10,000 ×g，10 min）再次离心去除。随后，含细胞内容物的液体经0.22 μm滤膜过滤。目标酶使用His Trap FF柱从滤液中纯化，该柱可与酶结合。收集的酶置于50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）中，4 °C透析8至12 h以脱盐，透析液在此期间更换两次。纯化酶的纯度通过SDS-PAGE检测。样品中总蛋白量采用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）作为参考标准。
【数据】离心：10,000 ×g，10 min；缓冲液：20 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）；滤膜孔径：0.22 μm；纯化柱：His Trap FF；透析缓冲液：50 mM磷酸盐缓冲液（pH 8.0）；透析温度：4 °C；透析时间：8-12 h；蛋白定量：Bradford法，BSA标准
2.5 pETDuet-SvMI-BtFum的构建
多酶体系中使用的酶基因均由南京Genscript Biotech Co., Ltd.根据基因序列提供。编码SvMI的基因svmi以引物P1和P2从质粒pET28a-SvMI扩增，载体pETDuet-1以引物P3和P4线性化。SvMI PCR片段通过同源重组插入pETDuet-1的MCS1（多克隆位点）。编码BtFum的基因btfum以引物P5和P6从质粒pET28a-BtFum扩增，载体pETDuet-SvMI以引物P7和P8线性化（表S1）。随后采用相同方法将基因btfum插入质粒pETDuet-SvMI的MCS2。携带两个基因的质粒在含50 μg/mL抗生素的LB固体培养基上筛选。
【数据】引物：P1-P8；载体：pETDuet-1；抗生素浓度：50 μg/mL；培养基：LB固体培养基
2.6 酶学性质测定
每分钟产生1 μmol延胡索酸所需的酶量定义为SvMI的一个酶活单位（U），每毫克蛋白所产生的酶活单位定义为比活力（U/mg）。为确定最适温度，在20至60 °C温度范围内，使用上述标准反应混合物测定SvMI及其突变体的活性。为确定最适pH，在40 °C下反应10 min，使用一系列不同pH值的通用缓冲液测定SvMI及其突变体的活性。热稳定性测定中，酶在不同温度水浴中预孵育1 h，然后测定残余活性。
【数据】酶活单位定义：1 μmol/min延胡索酸；温度范围：20-60 °C；反应时间：10 min；热稳定性预孵育：不同温度，1 h
2.7 顺丁烯二酸至L-苹果酸的一锅法全细胞催化
启动全细胞催化将顺丁烯二酸生物转化为L-苹果酸时，将适量细胞悬液与100 g/L或150 g/L顺丁烯二酸溶液（用KOH或CaCO₃调节pH至8.0）混合。反应体系总体积为10 mL，在40 °C、200 rpm条件下孵育。反应期间每隔2 h取样。每个样品用盐酸处理以终止反应并酸化。L-苹果酸、顺丁烯二酸和延胡索酸的浓度经适当稀释和膜过滤后测定。
【数据】底物浓度：100 g/L或150 g/L顺丁烯二酸；pH：8.0（KOH或CaCO₃调节）；体系体积：10 mL；温度：40 °C；转速：200 rpm；取样间隔：2 h
2.8 HPLC分析
L-苹果酸、延胡索酸和顺丁烯二酸采用HPLC分析，使用XDB-C8色谱柱，流动相为0.1%磷酸水溶液/甲醇（90/10，v/v），流速0.85 mL/min，柱温40 °C。进样量20 μL，检测波长214 nm。保留时间：L-苹果酸3.9 min，顺丁烯二酸4.7 min，延胡索酸5.7 min。
【数据】色谱柱：XDB-C8；流动相：0.1%磷酸水溶液/甲醇（90/10，v/v）；流速：0.85 mL/min；柱温：40 °C；进样量：20 μL；检测波长：214 nm；保留时间：L-MA 3.9 min、顺丁烯二酸4.7 min、延胡索酸5.7 min
2.9 统计分析
所有实验均进行三次独立重复，图中的误差线表示相应的标准偏差（SD）。
【数据】重复次数：3次独立重复；误差线：标准偏差（SD）
研究结果
3.1 顺丁烯二酸异构酶的发现与初步表征
首先，以4FQ5为参考蛋白，使用HMMER（v3.3.2）对GMGC发布的90%冗余蛋白序列数据库进行搜索，获得7492条蛋白序列。以10⁻²的E值阈值过滤后，保留5556条序列。随后使用Dedal计算以4FQ5为参考的序列同源评分，以SW-score ≥ 50为阈值过滤，保留616条序列。接着使用BLAST（v2.13.0）将候选序列与NCBI pataa专利数据库中的所有序列进行比对，以覆盖率>0.9和一致性>0.3为阈值判定序列属于专利数据库，过滤后获得58条序列。这58条序列使用AlphaFold2进行结构预测，DeepAlign（v1.135）将所有结构与4FQ5比对，以TM-score衡量结构相似性。同时使用BLAST（v2.13.0）计算候选序列与4FQ5的覆盖率和一致性分数。然后使用MEME计算序列功能约束（seq_feature），Rosetta计算与配体的结合亲和力（score）。最终，通过整合AlphaFold2预测的结构相似性（TM-score）、BLAST序列一致性和MEME功能基序约束，初步筛选具有拓扑基础的序列。随后重点使用Rosetta计算蛋白质与配体之间的结合自由能，选择能量景观最稳定、亲和力潜力最高的候选序列进行实验验证（表S1）。基于多维指标和人工评估，最终选择5条候选序列进行后续湿实验验证（图1、图2）。
为减少TCA循环中延胡索酸的消耗，采用敲除fumA和fumC基因的大肠杆菌BL21-△fumA/fumC作为宿主细胞合成L-苹果酸。经密码子优化后，所选MI的编码序列克隆至pET28a，在大肠杆菌BL21-△fumA/fumC中表达（图3），并对其酶活性进行表征。结果表明，5种MI中，来自Schaalia vaccimaxillae的MI（SvMI）表现出较高的酶活性。在100 g/L顺丁烯二酸底物浓度下反应1 h后，测定残余顺丁烯二酸浓度和生成的延胡索酸浓度。结果显示，活性最高的顺丁烯二酸异构酶为SvMI，产生99.2 g/L延胡索酸，显著高于AxMI（88.7 g/L）、PbMI（6.76 g/L）和GsMI（66.6 g/L）（图4）。基于高酶活性和高转化率，选择SvMI作为本研究对象。
【数据】HMMER搜索获得序列数：7492条；E值过滤后：5556条；SW-score ≥ 50过滤后：616条；专利数据库过滤后：58条；最终选择：5条候选序列；底物浓度：100 g/L顺丁烯二酸；反应时间：1 h；延胡索酸产量：SvMI 99.2 g/L、AxMI 88.7 g/L、PbMI 6.76 g/L、GsMI 66.6 g/L；宿主菌：E. coli BL21-△fumA/fumC
3.2 实验室进化进一步提高SvMI活性
为筛选最佳突变体，首先使用AlphaFold2预测蛋白质三维结构并提取原子坐标信息。随后通过DiffDock对接配体获得配体中心坐标。在此基础上，选择活性残基和配体中心15 Å范围内的179个位点，构建所有可能的单点突变序列集合。然后采用ESM1v模型预测每个突变在对应位点发生的概率，综合5个ESM1v模型的评分进行排序。突变体筛选遵循以下原则：首先根据综合评分从高到低排序，每个位点优先选择评分最高的突变残基；其次，排除距活性中心超过17.5 Å或距残基92超过21 Å的突变体；最后，逐步过滤在任何ESM1v模型中排名较低的突变体，以确保预测的可靠性和一致性（表S2）。通过该筛选流程，最终选出20个最优单点突变体（图5）。其中，A124V和M145V与野生型相比表现出更高活性。与野生型酶相比，酶活性分别提高153.6%和114.3%（图6A）。
在双突变体筛选阶段，首先选择在单突变实验中活性最高的A124V位点，与其他10个高活性位点组合，筛选出前10个双突变体。随后选择活性第二高的M145V位点，根据ESM1v模型预测的突变概率，筛选其与剩余位点的突变组合。按综合评分排序后，选择评分最高的10个双突变体，共获得20个推荐双突变体。如图6B所示，与第一轮单点突变相比，5个双点突变体表现出高于野生型酶的活性，分别为A124V/M145V、A124V/S107A、A124V/V96S、A124V/C76A和M145V/V96S，酶活性分别提高122.7%、102.4%、114%、104.5%和106.1%。然而，所有双点突变体的活性均未超过最佳单点突变体A124V。因此，选择突变体A124V进行后续酶学性质研究。
通过结构建模和分子对接阐明底物结合模式及活性改变的结构基础（图S1）。与其他顺丁烯二酸异构酶类似，SvMI的活性位点含有两个关键半胱氨酸残基Cys92和Cys210，对异构酶活性至关重要。Cys92与顺丁烯二酸的C2原子形成共价键，可能代表催化过程中的捕获中间体，在此过程中Cys92通过Michael加成机制对C2原子进行亲核攻击。除Cys92和Cys210外，其他几个活性位点残基参与底物识别。具体而言，Asn27和Asn179与远离Cys92的顺丁烯二酸羧基形成氢键。Cys92的攻击硫原子与顺丁烯二酸C2原子之间的空间距离（d）被认为特别重要。在野生型SvMI中，该距离为3.4 Å，而在A124V突变体中略微缩短至2.4 Å，使底物更接近攻击性半胱氨酸。此外，A124V突变体活性的增强也可能归因于Asn27和Asn179参与的氢键相互作用增强。
【数据】候选位点数：179个（15 Å范围内）；距离阈值：活性中心17.5 Å、残基92为21 Å；单突变体筛选数：20个；双突变体筛选数：20个；酶活性提升：A124V +153.6%、M145V +114.3%；双突变提升：A124V/M145V +122.7%、A124V/S107A +102.4%、A124V/V96S +114%、A124V/C76A +104.5%、M145V/V96S +106.1%；关键残基：Cys92、Cys210、Asn27、Asn179；Cys92-C2距离：野生型3.4 Å、A124V突变体2.4 Å
3.3 SvMI及其突变体的生化表征
为评价突变体的催化性能，本研究系统表征了其酶学性质。纯化后，SvMI及其突变体A124V的SDS-PAGE分析（如图7A所示）显示单一清晰条带，大小与预期一致，表明突变体有效表达。脱盐后测定酶活单位，纯化的SvMI和突变体A124V的比活力分别为42.5 U/mg和63.4 U/mg。在20-60 °C范围内研究SvMI和突变体A124V的最适温度。SvMI及其突变体A124V的最适温度均为40 °C，两者的最适pH均为8.0（图7B和C）。在30 °C孵育1 h后，A124V突变体保留76%的相对活性。而在60 °C时，其相对活性降至仅13%，野生型酶在相同条件下完全失活（图7D）。
以100 g/L、150 g/L和200 g/L顺丁烯二酸为底物，考察野生型酶和A124V突变体的催化性能。在100 g/L底物浓度下，野生型SvMI转化顺丁烯二酸生成延胡索酸，A124V突变体表现出更高的转化效率。随着底物浓度提高至150 g/L和200 g/L，A124V突变体仍能有效转化底物，展现出优异的底物耐受性和催化效率。
【数据】比活力：SvMI 42.5 U/mg、A124V 63.4 U/mg；最适温度：40 °C（两者）；最适pH：8.0（两者）；30 °C孵育1 h后A124V残余活性：76%；60 °C孵育1 h后A124V残余活性：13%；60 °C野生型：完全失活；底物浓度：100、150、200 g/L
3.4 全细胞催化与双酶级联转化
图8显示了SvMI及其突变体催化顺丁烯二酸转化为延胡索酸的结果。在100 g/L底物浓度下（图8A），SvMI突变体在12 h内将底物完全转化为延胡索酸，转化率接近100%。在150 g/L底物浓度下（图8B），突变体在16 h内完成转化，产物延胡索酸浓度达到约148 g/L。在200 g/L底物浓度下（图8C），突变体在24 h内实现约90%的转化率，延胡索酸浓度达到约180 g/L。野生型酶在各底物浓度下的转化效率均显著低于突变体。
进一步构建了共表达SvMI突变体A124V与BtFum的双酶级联体系，实现顺丁烯二酸经延胡索酸中间体向L-苹果酸的一锅法转化。如图9所示，在100 g/L底物浓度下（图9A），级联体系在12 h内将底物完全转化，L-苹果酸产量达108.5 g/L。在150 g/L底物浓度下（图9B），体系在16 h内完成转化，L-苹果酸产量达171.4 g/L，时空产率为14.28 g·(L·h)⁻¹。在200 g/L底物浓度下（图9C），体系在36 h内实现约85%的转化率，L-苹果酸浓度达约170 g/L。该结果表明，以CaCO₃为中和剂、pH 8.0条件下，双酶级联体系能高效转化高浓度底物，展现出良好的工业应用潜力。
【数据】100 g/L底物：12 h完全转化，L-MA产量108.5 g/L；150 g/L底物：16 h转化完成，L-MA产量171.4 g/L，时空产率14.28 g·(L·h)⁻¹；200 g/L底物：36 h转化率约85%，L-MA浓度约170 g/L；pH：8.0；中和剂：CaCO₃
讨论与解读
本研究通过多轮计算筛选与实验验证相结合的策略，从58条候选序列中鉴定出高活性顺丁烯二酸异构酶SvMI，并通过深度学习引导的蛋白质工程获得活性提高153.6%的A124V突变体。同时，以突变体A124V和前期报道的延胡索酸酶BtFum为核心元件，在大肠杆菌中成功构建了以顺丁烯二酸为底物的双酶共表达催化体系。在pH 8.0、CaCO₃作为中和剂的条件下进行过程优化后，该体系实现了150 g/L顺丁烯二酸向171.4 g/L L-苹果酸的高效转化，时空产率达14.28 g·(L·h)⁻¹，展现了良好的工业应用潜力。
【编译者解读】
本研究的方法学链条值得关注——从公共数据库挖掘到深度学习预测突变，再到双酶级联全细胞催化，是一条完整的"发现-改造-应用"路径。A124V单点突变的效果（活性提升153.6%）优于所有组合双突变，提示在特定酶中单点突变可能已接近活性上限附近，组合突变的增益未必叠加。以廉价顺丁烯二酸为底物、CaCO₃中和的策略兼顾了成本与效率，171.4 g/L的L-MA产量具有实际生产参考价值。局限在于全细胞催化中底物浓度200 g/L时转化率下降至约85%，高渗透压或产物抑制问题仍待解决。
参考来源
Huang W. Discovery, engineering and application of a maleate isomerase for efficient L-malic acid biosynthesis via dual-enzyme cascade with fumarase. Bioorganic Chemistry, 2026.
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.109842
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.109842