来源：Engineering L-threonine transaldolase and a chaperone assisted cascade for the efficient biosynthesis of L-threo-p-methylsulfonylphenylserine（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-苏式对甲磺酰基苯丝氨酸（L-threo-4-MTPS）是合成甲砜霉素类抗生素的关键手性砌块，其不对称合成长期受限于天然转醛酶催化效率低及乙醛积累引起的反馈抑制。本研究通过基因组挖掘从几丁质噬几丁菌中获得新型L-苏氨酸转醛酶CeLTTA，经结构引导的半理性进化获得三重突变体F70N/F59A/C57M，比活力提升4.46倍；进一步构建辅因子非依赖的甲酰化酶（FLS）清除级联，最终工程菌株产率达18.8 mM，转化率93.9%。
研究背景
从尖端药物到精细化学品，光学纯非天然氨基酸的合成往往依赖于精确的手性构建。β-羟基-α-氨基酸作为关键手性砌块，广泛用于合成多种生物活性化合物。L-苏式对甲磺酰基苯丝氨酸是合成氟苯尼考的重要中间体，其分子中相邻的Cα和Cβ立体中心对合成方法的立体选择性提出了严苛要求。传统化学合成路线步骤繁琐、副产物多，且难以实现精确的非对映体控制。生物催化凭借固有的立体选择性和温和反应条件，成为传统化学合成的重要替代方案。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
大肠杆菌BL21(DE3)作为所有克隆和表达实验的宿主。含有来自几丁质噬几丁菌的L-苏氨酸转醛酶基因的质粒pET28a-CeLTTA作为亲本模板。在此基础上构建了一系列衍生质粒，包括带有不同溶解度标签（SUMO、MBP）的载体、用于酶级联的pACYC-Duet共表达系统以及多种定点突变体。所有构建的质粒均通过DNA测序验证。菌株和质粒列于表S1，氨基酸序列和引物分别列于表S2和表S3。L-苏氨酸、4-甲磺酰基苯甲醛、磷酸吡哆醛（PLP）、焦磷酸硫胺素（TPP）、NADH、NAD+、异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）和二甲基亚砜（DMSO）购自阿拉丁（中国上海）或Sigma-Aldrich。限制性内切酶（Bsa I）、Dpn I、Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶和Infusion HD克隆试剂盒购自Vazyme Biotech Co., Ltd.（中国南京）。SanPrep柱式质粒小提试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购自生工生物（中国上海）。Ni-NTA亲和树脂购自Qiagen（德国）。BCA蛋白定量试剂盒购自Omega Bio-Tek（美国）。所有其他化学品均为分析纯或色谱纯。
【数据】宿主菌株：E. coli BL21(DE3)；亲本质粒：pET28a-CeLTTA；试剂来源：Aladdin/Sigma-Aldrich/Vazyme/Sangon/Qiagen/Omega Bio-Tek
2.2 基因挖掘与序列分析
以荧光假单胞菌LTTA（PfLTTA，GenBank：WP_065936857.1）为查询序列，通过NCBI BLASTP进行基因挖掘。使用MEGA 11对氨基酸一致性超过20%的候选序列进行比对，以鉴定保守基序。随后，基于PfLTTA模板（PDB：7K34），使用SWISS-MODEL服务器构建CeLTTA的三维结构，并通过QMEAN和GMQE指标验证模型质量。
【数据】查询序列：PfLTTA（WP_065936857.1）；序列一致性阈值：>20%；模板：PDB 7K34；建模工具：SWISS-MODEL
2.3 蛋白表达与纯化
将重组大肠杆菌BL21(DE3)单菌落在3 mL LB培养基中过夜培养（37°C，200 rpm）。将种子培养物以2%（v/v）接种量转接至50 mL新鲜LB培养基中，在37°C（200 rpm）下培养至OD₆₀₀为0.6–0.8。加入0.1–0.5 mM IPTG诱导后，在不同温度（16°C、20°C或25°C）下以200 rpm继续培养20小时以优化表达。通过离心（8000 ×g，10 min，4°C）收集细胞并重悬于裂解缓冲液中。在冰上超声破碎（25%功率，2 s/3 s循环，15 min）。离心澄清（12,000 ×g，30 min，4°C）后，将上清液上样至Ni-NTA柱。所用缓冲液含20 mM磷酸钠和500 mM NaCl（pH 7.5），并补充不同浓度的咪唑：20 mM（裂解）、100 mM（洗涤）和400 mM（洗脱）。通过SDS-PAGE监测蛋白纯度，使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
【数据】培养温度：37°C；转速：200 rpm；接种量：2%（v/v）；OD₆₀₀：0.6–0.8；IPTG浓度：0.1–0.5 mM；诱导时间：20 h；诱导温度：16/20/25°C；离心：8000 ×g 10 min / 12,000 ×g 30 min；超声：25%功率，2 s/3 s循环，15 min；咪唑浓度：20/100/400 mM
2.4 分子对接与理性设计
在Chimera中制备CeLTTA模型：去除水分子、添加氢原子并分配Gasteiger电荷。使用Chem3D生成PLP-L-threo-4-MTPS的能量最小化结构。以活性位点为中心的网格框内，通过AutoDock Vina进行对接模拟。使用PyMOL可视化所得相互作用。
【数据】对接工具：AutoDock Vina；网格框：以活性位点为中心；可视化：PyMOL
2.5 饱和突变与高通量筛选
使用Mut Express II快速突变试剂盒V2（Vazyme）构建饱和突变文库，引物含NNK简并密码子。使用Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶进行反向PCR，随后用DpnI消化模板，并经Exnase II介导环化。反应产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)。每个文库挑取约95个菌落以保证超过95%的理论覆盖率。将单菌落在200 μL LB培养基（96深孔板，37°C，200 rpm）中过夜培养。取60 μL接种物转移至含卡那霉素和2–3粒玻璃珠的540 μL乳糖自诱导培养基中，在28°C（200 rpm）下表达24小时。收集细胞（4000 ×g，10 min）并重悬于500 μL反应缓冲液中，该缓冲液含50 mM Tris-HCl pH 7.0、150 mM L-苏氨酸、20 mM 4-甲磺酰基苯甲醛、1 mM MgCl₂、0.05 mM PLP、10% DMSO，在30°C下孵育3小时。随后，取20 μL上清液加入180 μL混合物B（50 mM Tris-HCl pH 7.0、0.25 mM NADH、1 U ADH）中测定。根据此前报道的ADH偶联法，通过监测340 nm处NADH消耗10分钟测定活性，选择速率高于野生型的突变体。
【数据】突变体库覆盖率：>95%（约95个菌落/文库）；诱导温度：28°C；诱导时间：24 h；筛选反应体系：50 mM Tris-HCl pH 7.0、150 mM L-苏氨酸、20 mM 4-甲磺酰基苯甲醛、1 mM MgCl₂、0.05 mM PLP、10% DMSO；反应条件：30°C，3 h；检测波长：340 nm；检测时间：10 min
2.6 多酶级联反应与乙醛消除系统
为评估潜在产物抑制和辅因子需求，在标准反应中分别添加乙偶姻（0–100 mM）或焦磷酸硫胺素（TPP 0、0.1、0.5、1 mM）。这些实验分别旨在确定FLS介导的级联对产物积累的耐受性，以及全细胞系统对外源辅因子补充的需求。多酶级联反应在1 mL体系中进行，含50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）、150 mM L-苏氨酸、20 mM 4-甲磺酰基苯甲醛、0.05 mM PLP、1 mM MgCl₂和10%（v/v）DMSO。使用CeLTTAM3/FLS共表达菌株的湿细胞（相当于OD₆₀₀ = 10）作为催化剂。反应在30°C、200 rpm摇动条件下进行。
【数据】乙偶姻添加范围：0–100 mM；TPP浓度：0/0.1/0.5/1 mM；反应体系：1 mL；催化剂浓度：OD₆₀₀ = 10；反应温度：30°C；转速：200 rpm
2.7 分析方法
使用配备InertSustain AX-C18色谱柱（4.6 × 250 mm，5 μm）的Shimadzu LC-20A系统测定L-threo-4-MTPS浓度，柱温维持在30°C。以水（A）和乙腈（B）为流动相，流速0.5 mL/min，进样量10 μL，在224 nm处检测。梯度洗脱程序如下：0–3 min，15% B；3–6 min，15–70% B；6–11 min，70–60% B；11–17 min，60% B；17–18 min，60–0% B；18–24 min，0% B；24–25 min，0–95% B。基于标准品生成的标准曲线进行定量。甲酰化酶活性通过三苯基四氮唑氯化物（TTC）法测定。反应混合物（1 mL）含50 mM Tris-HCl（pH 7.0）、1 M乙醛、0.5 mM TPP、1 mM MgCl₂和表达FLS的湿细胞（OD₆₀₀ = 10），在30°C下孵育8小时。随后，取40 μL上清液与160 μL TTC试剂（含3 mM TTC、6 mL 5 M NaOH、7.5 mL乙醇和26.5 mL H₂O）在微孔板中混合。避光孵育后，在510 nm处测量吸光度。一个酶活力单位（U）定义为每分钟产生1 μmol乙偶姻所需的酶量。蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒测定。取20 μL样品与200 μL工作试剂在96孔板中混合，37°C孵育15分钟，在562 nm处测量吸光度，使用BSA标准曲线（0.04–1 mg/mL）计算浓度。为明确量化催化性能，按标准方案计算关键指标：比活力定义为每毫克总蛋白每分钟催化形成1微摩尔产物所需的酶量；转化率计算为最终产物浓度与初始底物浓度之比乘以100%；de值通过主要和次要非对映体浓度之差的绝对值除以两者总浓度之和并乘以100%确定。
【数据】HPLC柱温：30°C；流速：0.5 mL/min；进样量：10 μL；检测波长：224 nm；TTC法反应体系：50 mM Tris-HCl pH 7.0、1 M乙醛、0.5 mM TPP、1 mM MgCl₂；TTC法反应条件：30°C，8 h；TTC检测波长：510 nm；BCA检测波长：562 nm；BSA标准曲线范围：0.04–1 mg/mL
2.8 分子动力学模拟
对接输入（加氢/带电蛋白、最小化配体）以PDBQT格式制备，使用以结合位点为中心的网格。使用GROMACS和AMBER99SB-ILDN力场进行100 ns分子动力学模拟。体系以TIP3P水模型溶剂化（1.2 nm填充），中和至0.154 M离子浓度，并进行能量最小化。经NVT/NPT平衡（各100 ps）后，进行生产运行。
【数据】模拟时长：100 ns；力场：AMBER99SB-ILDN；水模型：TIP3P；填充距离：1.2 nm；离子浓度：0.154 M；平衡时间：NVT 100 ps + NPT 100 ps
研究结果
3.1 新型高活性L-苏氨酸转醛酶的挖掘与鉴定
挖掘具有优异催化性能的酶对于工业生物催化至关重要。为鉴定性能增强的新型L-苏氨酸转醛酶，我们进行了系统的基因挖掘。以荧光假单胞菌LTTA（PfLTTA）为查询序列，对NCBI非冗余蛋白数据库进行BLASTP搜索。我们选择了与PfLTTA序列一致性超过20%的同源物——这一阈值旨在捕获进化多样性，同时保留关键的催化支架。选取了6种代表性酶进行分析，序列一致性跨度从近乎同工酶到远缘同源物。这些酶包括PfLTTA本身、来自几丁质噬几丁菌的CeLTTA、来自Pseudomonas salmasensis的ObiH、来自棒状链霉菌的ScSHMT、来自链霉菌属的LipK以及来自Streptantibioticus cattleyicolor的ScFTase（表1）。这一系统发育和序列多样性集合为阐明LTTA家族的结构-功能关系提供了坚实框架。
为阐明LTTA家族的共同结构特征和保守性，我们对6种同源酶进行了结构叠合。整体三级结构表现出高度相似性，共享保守的骨架架构（图1A）。对预测活性位点的仔细观察提示关键残基存在空间保守性。需要明确指出的是，对于与模板序列一致性较低的远缘同源物（如ScFTase、ScSHMT和LipK），SWISS-MODEL预测主要反映整体骨架拓扑而非精确的侧链构象。尽管如此，可能参与催化的关键残基（如赖氨酸、酪氨酸、组氨酸和丝氨酸残基）在三维空间中大致对齐。例如，关键的催化赖氨酸和独特的酪氨酸簇在这些预测模型中占据大致相似的空间区域。鉴于该序列一致性范围内同源建模的固有限制，这些空间描述旨在突出潜在的进化保守趋势而非精确的原子坐标。这一保守核心与可变的周边区域形成鲜明对比。虽然ObiH与PfLTTA几乎完全一致，但远缘同源物（ScSHMT、LipK、ScFTase）在活性口袋周围的表面区域表现出显著的序列差异（图1D）。这些见解为该酶家族中观察到的功能多样性提供了结构基础。
所有候选酶均在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并通过L-threo-4-MTPS的不对称合成进行评估。CeLTTA表现出最高效率，比活力比参考酶PfLTTA高1.7倍（图1C）。其他酶表现较低：ObiH显示114.41%的相对活性，而LipK和ScFTase低于6%（图1C）。因此，选择CeLTTA用于后续定向进化和生化表征。尽管初步评估表明CeLTTA在大肠杆菌中的可溶性表达挑战比其他候选酶（如PfLTTA）更为突出，但内在比活力被优先作为主要选择标准。从酶工程的角度来看，通过已建立的分子伴侣共表达来挽救可溶性表达通常比从低基线进化出对空间位阻底物的高内在催化活性更为可预测和可行。
【数据】筛选酶数：6种；CeLTTA比活力：PfLTTA的1.7倍；ObiH相对活性：114.41%；LipK和ScFTase相对活性：<6%
3.2 大肠杆菌中可溶性表达的优化
CeLTTA在大肠杆菌BL21(DE3)中的异源表达主要形成包涵体，仅4.7%为可溶性蛋白（图S2）。为减轻聚集（图2A，E. coli 1），我们构建了组合表达文库。首先，测试了N端标签包括SUMO、双SUMO和MBP（图2B，E. coli 2–4）。选择这些特异性融合标签是因为它们代表了在原核表达系统中改善蛋白溶解性的经过高度验证的经典工具。MBP通常作为被动分子伴侣，物理性阻止部分折叠中间体的聚集。而SUMO被广泛认为能促进蛋白正确折叠，并具有通过特异性蛋白酶无痕切割产生天然酶的独特优势。同时，我们评估了使用Trigger Factor（Tig）、GroES-GroEL和DnaK-DnaJ-GrpE的分子伴侣共表达以辅助折叠（图2C，E. coli 5–7）。最后，实施了将SUMO与每组分子伴侣组合的混合策略（图2D，E. coli 8–10）。
我们对SUMO融合进行了逐步优化。首先，在固定IPTG浓度为0.1 mM的条件下评估了16、20和25°C的温度效应（图S3，E. coli 1a、1b和1c）。确定20°C为最适温度后，在该温度下进一步测试了IPTG浓度（0.1、0.2和0.5 mM）（图S4，E. coli 1b、1d和1e）。0.1 mM IPTG在20°C下最为有效，可溶性比例为5.5%，可溶性部分为27.3%（图3B），相对酶活性为122.9%（图3A）。相比之下，其他条件表现较低，可溶性比例为4.9–5.2%，相对活性为108.6–117.2%（图3A、B）。
鉴于近期在表达困难的人类细胞因子方面的成功，我们构建了串联双SUMO标签。然而，该方法在多种诱导条件下均未显著提高溶解性（图S5）。在0.1 mM IPTG、20°C或25°C下，可溶性比例分别为5.8%和6.0%，可溶性部分分别为30.8%和31.7%（图3B），相对活性分别达到117.1%和102.9%（图3A）。在0.5 mM IPTG和20°C或25°C下，数值仍然较低：可溶性比例为5.2%和5.3%，可溶性部分为28.7%和31.2%（图3B），相对活性为97.14%和108.6%（图3A）。
接下来测试了麦芽糖结合蛋白（MBP，约40 kDa，图S6）。尽管可溶性部分达33.2%（图3B），MBP未能改善溶解性且显著降低活性至81.3%（图3A），提示大标签造成空间位阻或构象干扰。
随后研究了使用pGro7（GroES-GroEL）、pKJE7（DnaK-DnaJ-GrpE）和pTf16（Trigger Factor）的分子伴侣共表达。pGro7显著提高了CeLTTA的溶解性（图S7泳道c和d）。目标蛋白占细胞裂解上清液中总可溶性蛋白的8.9%，可溶性CeLTTA占CeLTTA总表达量的37.9%（图4B）。这与活性显著提高至183.6%相关（图4A）。相比之下，将SUMO标签与pGro7共表达组合并未带来额外益处（图S7泳道i和j），反而导致性能下降：可溶性比例8.6%，可溶性部分35.8%（图3B），相对活性154.8%（图3A）。
pKJE7和pTf16系统仅表现出轻微的溶解性效应（图S7泳道a、b、e和f）。pTf16产生可溶性比例6.5%，可溶性部分32.1%（图3B），相对活性86.2%（图3A）。pKJE7系统数值更低：可溶性比例5.0%，可溶性部分32.0%（图3B），相对活性85.5%（图3A）。当这些分子伴侣与SUMO标签组合时，未观察到显著改善（图S7，泳道g、h、k和l）。具体而言，pTf16与SUMO组合的两个溶解性参数值为4.6%和27.9%（图3B），活性为88.4%（图3A）；而pKJE7与SUMO组合产生可溶性比例5.3%、可溶性部分29.8%（图3B），酶活性进一步降低至79.8%（图3A）。
总之，GroES-GroEL共表达是获得可溶性CeLTTA的最有效策略。
【数据】无伴侣可溶性比例：4.7%；SUMO最优条件：0.1 mM IPTG + 20°C，可溶性比例5.5%，可溶性部分27.3%，相对活性122.9%；双SUMO：可溶性比例5.8–6.0%，可溶性部分30.8–31.7%，相对活性102.9–117.1%；MBP：可溶性部分33.2%，相对活性81.3%；GroES-GroEL：可溶性比例8.9%，可溶性部分37.9%，相对活性183.6%；SUMO+pGro7：可溶性比例8.6%，可溶性部分35.8%，相对活性154.8%；pTf16：可溶性比例6.5%，可溶性部分32.1%，相对活性86.2%；pKJE7：可溶性比例5.0%，可溶性部分32.0%，相对活性85.5%；SUMO+pTf16：可溶性比例4.6%，可溶性部分27.9%，相对活性88.4%；SUMO+pKJE7：可溶性比例5.3%，可溶性部分29.8%，相对活性79.8%
【数据】对接对象：PLP-L-threo-4-MTPS中间体与CeLTTA活性位点；相互作用类型：氢键等（原文未详述具体残基）
【数据】突变体：F70N/F59A/C57M；比活力提升：4.46倍；立体选择性：>94% de（原文未详述各突变体逐步数据）
【数据】模拟时长：100 ns；分析指标：RMSD、Rg、SASA、RMSF、氢键数（原文未在节选内给出具体数值）
3.3 级联系统构建与生化表征
（原文该部分正文内容未在节选范围内完整呈现，以下根据可获得的摘要信息进行忠实编译）
为应对乙醛积累导致的反馈抑制瓶颈，本研究构建了人工辅因子非依赖级联系统，将CeLTTA与甲酰化酶（FLS）清除模块偶联。该设计将有毒副产物高效转化为乙偶姻，无需外源辅因子补充即可缓解反馈抑制。通过优化基因架构和分子伴侣共表达，发现GroES-GroEL系统对解决蛋白折叠问题和最大化通路通量至关重要。
【数据】级联系统：CeLTTA-FLS；最终工程菌株产率：18.8 mM；转化率：93.9%（原文未详述温度/pH优化各点具体数值）
【数据】分组：Group 1（单酶对照：WT/M3/FLS单独表达）；Group 2（双质粒和双顺反子操纵子级联）；Group 3（双质粒和双顺反子操纵子级联）（原文未在节选内给出各组具体数值）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功鉴定并改造了来自几丁质噬几丁菌的新型L-苏氨酸转醛酶CeLTTA，用于L-threo-4-MTPS的不对称合成。通过结构引导的半理性进化获得F70N/F59A/C57M三重突变体，催化效率提高4.46倍，立体选择性维持超过94% de。分子动力学模拟揭示这些改进源于整体刚性增强和活性位点底物限制的优化。此外，为应对乙醛抑制，建立了原子经济且外源辅因子非依赖的甲酰化酶清除级联。对基因架构和分子伴侣共表达的系统评估确定GroES-GroEL系统是解决蛋白折叠瓶颈的决定性因素。最终工程菌株实现产物滴度18.8 mM、转化率93.9%。
编译者解读：该研究展示了酶工程与代谢通路组装的系统整合策略。值得关注的是，作者将可溶性表达问题与催化效率提升置于同一优化框架内——通过GroES-GroEL共表达而非传统的标签融合策略解决蛋白折叠瓶颈，这一选择避免了大型标签对催化活性的潜在干扰。FLS清除模块的设计尤为巧妙，将有毒副产物乙醛转化为乙偶姻，同时摆脱外源辅因子依赖，显著提升了全细胞催化的经济性。三重突变对蛋白全局刚性的影响提示，远离活性位点的突变同样可通过稳定整体构象来优化底物通道，这一机制对转醛酶家族的工程改造具有参考价值。后续研究可探索该级联系统在更复杂底物或连续流反应中的适用性。
参考来源
Wang C. Engineering L-threonine transaldolase and a chaperone assisted cascade for the efficient biosynthesis of L-threo-p-methylsulfonylphenylserine. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.151614
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.151614