来源：Directed evolution of a β-N-acetylhexosaminidase from Haloferula sp. for lacto-N-triose II and lacto-N-neotetraose synthesis from chitin（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
人乳寡糖（HMOs）是母乳中第三大固体成分，其核心结构LNT2和LNnT具有抗炎、益生元及免疫调节等功能。本研究在前期获得的具有高HMOs合成能力的β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74基础上，通过定向进化和位点饱和突变获得双突变体mHaHex74（Asn401Ile/His394Leu），其LNT2转化率最高达28.2%，较野生型提高2.2倍。研究进一步在5 L反应器中构建三酶级联体系，从几丁质出发实现LNT2和LNnT的规模化合成，产量分别达15.0 g/L和4.9 g/L。
研究背景
全球甲壳类水产品消费产生每年超600万吨壳废弃物，造成严重的生物质浪费和环境污染。几丁质是甲壳的主要成分（占20–30%），其组成单元为N-乙酰-D-氨基葡萄糖（GlcNAc），可转化为高价值碳水化合物——人乳寡糖（HMOs）。LNT2和LNnT作为HMOs核心结构，具有抗炎、益生元和免疫调节等健康功能，开发从几丁质高效合成LNT2和LNnT的途径具有重要价值。
相较于化学合成法，酶法合成LNT2和LNnT具有反应条件温和、立体选择性和区域选择性高等优势。LNT2通常可由β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶（EC 2.4.1.149）或β-N-乙酰氨基己糖苷酶（EC 3.2.1.52）合成，前者因底物昂贵且选择性严格而应用受限。β-N-乙酰氨基己糖苷酶因其特殊性质被优先用于LNT2合成。
研究方法
2.1 材料
载体pET28a(+)由Novagen（美国麦迪逊）提供。P. pastoris GS115和pPIC9K购自Invitrogen（Carlsbad, CA）。粉状几丁质、乙二醇几丁质、N-乙酰壳寡糖（DP 2–5）、β-乳糖、pNP-GlcNAc、对硝基苯基N-乙酰-β-D-半乳糖胺（pNP-GalNAc）、LNT2和LNnT均与前期研究来源相同。溶菌酶由Sigma（美国）提供。其余材料均为分析纯级。
【数据】载体：pET28a(+)；菌株：P. pastoris GS115；底物：粉状几丁质、乙二醇几丁质、N-乙酰壳寡糖（DP 2–5）、β-乳糖、pNP-GlcNAc、pNP-GalNAc、LNT2、LNnT；试剂：溶菌酶（Sigma）
2.2 突变库构建
以pET28a-HaHex74为模板，使用引物HaHex74F和HaHex74R（表S1）进行易错PCR构建突变库。易错PCR条件如下：95°C预变性5分钟；30个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸110秒；最后72°C延伸5分钟。经NdeI和XhoI双酶切后，将易错PCR产物（HaHex74-m）克隆至pET28a(+)质粒，转化至E. coli BL21(DE3)获得突变库。
【数据】模板：pET28a-HaHex74；PCR条件：95°C 5min；30循环（95°C 30s，55°C 30s，72°C 110s）；72°C 5min；限制酶：NdeI/XhoI；宿主菌：E. coli BL21(DE3)
2.3 突变库筛选
所有突变体涂布于LB平板（含50 μg/mL卡那霉素），37°C培养24小时。将单菌落和野生型菌株转移至含200 μL LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）的96孔板中，37°C、100 rpm培养4小时。取50 μL培养物转移至含150 μL LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）的新96孔板中，相同条件培养2小时。随后加入IPTG（1‰）进行酶诱导过夜。4°C、3000 g离心10分钟，收集沉淀并与溶菌酶（10 mg/mL）在37°C孵育30分钟。相同条件离心后，收集上清液作为粗酶液。
将稀释粗酶液（20 μL）与50 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.5）中的2 mM pNP-GlcNAc（20 μL）混合，45°C孵育10分钟，加入0.5 M NaOH（40 μL）终止反应。测定410 nm处吸光度。随后测试OD410＞0.1的突变体的转糖基活性。转糖基反应混合物含15 μL 60 mM (GlcNAc)₂、15 μL 450 mM β-乳糖和15 μL稀释粗酶液（溶于50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.5），40°C孵育2.5小时。合成的LNT2通过TLC定性分析，HPLC定量测定。
【数据】筛选条件：LB平板（50 μg/mL卡那霉素）37°C 24h；96孔板培养：200 μL LB，37°C，100 rpm，4h；诱导：IPTG（1‰）过夜；离心：4°C，3000 g，10min；溶菌酶处理：10 mg/mL，37°C，30min；酶活测定：2 mM pNP-GlcNAc，50 mM磷酸盐缓冲液pH 6.5，45°C，10min，0.5 M NaOH终止；转糖基反应：60 mM (GlcNAc)₂ + 450 mM β-乳糖，pH 7.5，40°C，2.5h；检测：TLC + HPLC
2.4 位点饱和突变（SSM）
以pET28a-HaHex74为模板，使用简并引物AAG/AHG/CNC/GNG/TNC/TGT/GAC/CAG（Asn401）和DAC/CBC/CAD/ANA/GNG/TTC/TCC/TGG（His394）（表S1）对HaHex74的Asn401和His394残基进行SSM。PCR条件如下：95°C预变性3分钟；25个循环的95°C变性20秒、55°C退火20秒、72°C延伸2.5分钟；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经DpnI在37°C消化2小时，转化至E. coli DH5α，随后在LB平板上37°C培养24小时。进行菌落PCR并对单菌落测序以获得每个突变位点的全部20种突变体。随后收集质粒并转化至E. coli BL21(DE3)。
【数据】模板：pET28a-HaHex74；简并引物：Asn401位（AAG/AHG/CNC/GNG/TNC/TGT/GAC/CAG）、His394位（DAC/CBC/CAD/ANA/GNG/TTC/TCC/TGG）；PCR条件：95°C 3min；25循环（95°C 20s，55°C 20s，72°C 2.5min）；72°C 10min；DpnI消化：37°C，2h；宿主菌：E. coli DH5α → BL21(DE3)
2.5 mHaHex74（Asn401Ile/His394Leu）在E. coli中的表达
以pET28a-HaHex74/H394L为模板，使用引物N401-F和N401-R（表S1）进行PCR扩增，获得双突变体HaHex74-H394L/N401I（mHaHex74）。经NdeI和XhoI双酶切后，将PCR产物（mHaHex74）克隆至pET28a(+)质粒，转化至E. coli BL21(DE3)。按照前期研究方法，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）启动酶诱导表达。
【数据】模板：pET28a-HaHex74/H394L；引物：N401-F/N401-R；限制酶：NdeI/XhoI；宿主菌：E. coli BL21(DE3)；诱导剂：IPTG
2.6 突变体纯化
4°C、10,000 g离心3分钟收集细胞并超声破碎。4°C、10,000 g离心10分钟获得粗酶液。按照前期研究方法进行酶纯化：将粗酶液上样至预先用缓冲液A（50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，含20 mM咪唑和500 mM NaCl）平衡的Ni-HP柱（1 × 5 cm，GE Healthcare，美国），流速0.5 mL/min。用10倍柱体积的缓冲液B（50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，含50 mM咪唑和500 mM NaCl）洗去杂质。目标蛋白用缓冲液C（50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4，含200 mM咪唑和500 mM NaCl）洗脱，流速固定为1.0 mL/min。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认收集组分的纯度。
【数据】离心：4°C，10,000 g，3min（收集细胞）/10min（获取粗酶）；Ni-HP柱：1 × 5 cm；缓冲液A：50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4 + 20 mM咪唑 + 500 mM NaCl，流速0.5 mL/min；缓冲液B：50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4 + 50 mM咪唑 + 500 mM NaCl，10倍柱体积；缓冲液C：50 mM磷酸盐缓冲液pH 7.4 + 200 mM咪唑 + 500 mM NaCl，流速1.0 mL/min
2.7 酶活性和蛋白质含量测定
酶活性和蛋白质含量按前期研究方法测定。简言之，100 μL稀释酶液与100 μL含2 mM pNP-GlcNAc的50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 5.5）混合，35°C孵育10分钟。加入200 μL 0.5 M NaOH后测定OD410。一个β-N-乙酰氨基己糖苷酶活性单位（U）定义为在上述条件下每分钟释放1 μmol pNP所需的酶量。
【数据】酶活测定：100 μL酶液 + 100 μL 2 mM pNP-GlcNAc（50 mM柠檬酸盐缓冲液pH 5.5），35°C，10min；终止：200 μL 0.5 M NaOH；检测波长：OD410；酶活单位定义：释放1 μmol pNP/min
2.8 生化特性和底物特异性
酶的最适pH、pH稳定性、最适温度和热稳定性按照Liu等（2020）的方法评估。最适温度和热稳定性测定使用柠檬酸盐缓冲液（50 mM，pH 5.5）。底物特异性按照Liu等（2020）的方法测定，使用不同底物包括pNP-GlcNAc、N-乙酰壳寡糖（DP 2–5）、pNP-GalNAc、壳聚糖、乙二醇几丁质、胶体几丁质和羧甲基纤维素（CMC）。
【数据】缓冲液：柠檬酸盐缓冲液（50 mM，pH 5.5）；底物：pNP-GlcNAc、N-乙酰壳寡糖（DP 2–5）、pNP-GalNAc、壳聚糖、乙二醇几丁质、胶体几丁质、CMC
2.9 LNT2合成条件优化、分离与鉴定
LNT2合成反应在不同条件下将酶与(GlcNAc)₂和β-乳糖共孵育。最适pH、温度、反应时间、β-乳糖浓度和酶用量按照前期研究方法考察。合成产物通过配备5 µm XBridge BEH Amide柱（Waters，4.6 × 250 mm，美国）的HPLC-RID分析。流动相为乙腈-水溶液（72:28，v/v），流速0.6 mL/min。合成产物按照前期研究方法通过活性炭柱（50 × 2.0 cm）分离，用0–20%（v/v）线性梯度乙醇溶液洗脱。纯化产物随后通过质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）鉴定。
【数据】HPLC条件：XBridge BEH Amide柱（5 µm，4.6 × 250 mm），流动相乙腈:水 = 72:28（v/v），流速0.6 mL/min；分离：活性炭柱（50 × 2.0 cm），0–20%（v/v）线性梯度乙醇洗脱；鉴定：MS + NMR
2.10 突变体结构分析
使用SWISS-MODEL进行同源建模，以来自Bacteroides thetaiotaomicron的β-己糖胺酶结构（PDB条目6Q63）为模板。结构图使用PyMol 1.8制备。
【数据】建模工具：SWISS-MODEL；模板：Bacteroides thetaiotaomicron β-己糖胺酶（PDB：6Q63）；绘图：PyMol 1.8
2.11 从粉状几丁质合成LNT2和LNnT
LNT2和LNnT合成按照前期研究方法稍作修改进行。简言之，球磨粉状几丁质用几丁质酶PbChi70（200 U/g）在50°C水解24小时。4°C、10,000 g离心10分钟后，上清液浓缩至初始体积的1/10。随后加入4 U/mL的mHaHex74和0.8 M β-乳糖，在pH 7.0和40°C下孵育进行LNT2合成。之后，用0–20%（v/v）乙醇溶液线性梯度去除多余的β-乳糖。含少量β-乳糖的LNT2溶液进一步浓缩，并与β-半乳糖苷酶BgaD-D（0.2 U/mL）在50°C孵育进行LNnT合成。
【数据】几丁质水解：几丁质酶PbChi70（200 U/g），50°C，24h；离心：4°C，10,000 g，10min；浓缩：至初始体积1/10；LNT2合成：mHaHex74（4 U/mL）+ 0.8 M β-乳糖，pH 7.0，40°C；β-乳糖去除：0–20%（v/v）乙醇线性梯度；LNnT合成：β-半乳糖苷酶BgaD-D（0.2 U/mL），50°C
研究结果
3.1 突变库筛选与位点饱和突变
通过易错PCR构建突变库，突变率为0.62%。经过两轮筛选，获得两个LNT2转化率分别为20.0%和18.9%的突变体（7G12和54C6）（表1）。每个突变体中各有一个氨基酸残基被替换，即7G12为Asn401Leu，54C6为His394Leu。氨基酸序列比对显示，GH家族20 β-N-乙酰氨基己糖苷酶中Asn401不保守，但His394部分保守（图1）。
为揭示Asn401和His394残基对HaHex74转糖基活性的影响，构建了Asn401和His394两个位点的SSM文库。对每个位点的全部20种突变体进行了转糖基活性测试（表1）。在Asn401突变体中，4个突变体表现出提高的LNT2转化率，即Asn401Ile（22.2%）、Asn401Leu（20.0%）、Asn401Tyr（17.5%）和Asn401Pro（16.1%）。对于His394，除His394Leu、His394Ala、His394Ser、His394Tyr、His394Lys和His394Gln外，大多数突变体无活性，仅His394Leu显示出比HaHex74更高的转糖基活性（19%）（表1）。
为研究两个替换的相互作用，进一步进行了组合突变。突变体Asn401Ile/His394Leu（mHaHex74）表现出最高的转糖基活性，LNT2转化率为27.1%，比HaHex74高2.1倍。此外，mHaHex74合成产物中LNT2异构体含量较少（图S1）。
虽然SSM已成功应用于多种酶的分子改造，但利用SSM提高β-N-乙酰氨基己糖苷酶转糖基活性的研究鲜有报道。BbhΙ是一种具有高LNT2合成转糖基活性的β-N-乙酰氨基己糖苷酶，通过对其两个位点（Asp714和Trp773）进行SSM改造，获得了两个突变体（Trp773Arg和Asp714Thr），其LNT2转化率分别比野生型酶高1.8倍和1.9倍。
【数据】突变率：0.62%；突变体7G12：Asn401Leu，LNT2转化率20.0%；突变体54C6：His394Leu，LNT2转化率18.9%；Asn401突变体转化率：Ile（22.2%）、Leu（20.0%）、Tyr（17.5%）、Pro（16.1%）；His394Leu转化率：19%；mHaHex74（Asn401Ile/His394Leu）转化率：27.1%（比HaHex74高2.1倍）
3.2 mHaHex74的纯化与性质
突变基因（mHaHex74）成功在E. coli BL21(DE3)中表达，重组酶（mHaHex74）经Ni-HP柱纯化至表观均一（图2），纯化倍数为2.4，回收率为62.7%（表S2）。
重组酶（mHaHex74）在pH 5.5和35°C条件下显示最大活性，与HaHex74相比分别降低了1个pH单位和10°C（图S2）。mHaHex74在pH 5.0–9.0范围内稳定，与HaHex74（pH 5.5–9.0）相似。然而，mHaHex74的热稳定性略有下降。
mHaHex74对所有测试底物的比活性较HaHex74均有所降低。该酶对pNP-GlcNAc的比活性最高（61.3 U/mg），其次为(GlcNAc)₃（15.1 U/mg）、(GlcNAc)₂（14.2 U/mg）、(GlcNAc)₄（7.3 U/mg）、(GlcNAc)₅（4.7 U/mg）和pNP-GalNAc（3.3 U/mg）。对胶体几丁质、壳聚糖、乙二醇几丁质和CMC无活性（表2）。
经定向进化和SSM后，mHaHex74被改造为酸性酶。其最适pH高于来自Lamellidens corrianus（pH 4.0）和Myceliophthora thermophila（pH 4.5）的β-N-乙酰氨基己糖苷酶，但低于来自Akkermansia muciniphila（pH 7.0）和Stackebrandtia nassauensis（pH 6.0）的β-N-乙酰氨基己糖苷酶。mHaHex74的pH稳定性优于大多数其他β-N-乙酰氨基己糖苷酶，如来自Shinella sp.（pH 6.0–9.0）和Sphingobacterium sp.（pH 6.0–8.0）的酶。但其pH稳定范围窄于来自土壤宏基因组文库的β-N-乙酰氨基己糖苷酶（pH 3.0–9.0）。
mHaHex74的最适温度高于来自Pseudoalteromonas sp.的β-N-乙酰氨基己糖苷酶（30°C），但低于来自Chitinolyticbacter meiyuanensis（40°C）和Rhizomucor miehei（50°C）的酶。虽然mHaHex74对GlcNAc底物的比活性低于HaHex74，但仍高于大多数其他具有转糖基活性的β-N-乙酰氨基己糖苷酶，如rNag3HWLB1（对pNP-GlcNAc为19.4 U/mg；对(GlcNAc)₂为0.3 U/mg）和PoHex（对pNP-GlcNAc为35 U/mg）。
【数据】纯化倍数：2.4；回收率：62.7%；最适pH：5.5（比HaHex74低1个单位）；最适温度：35°C（比HaHex74低10°C）；pH稳定范围：5.0–9.0；比活性：pNP-GlcNAc（61.3 U/mg）、(GlcNAc)₃（15.1 U/mg）、(GlcNAc)₂（14.2 U/mg）、(GlcNAc)₄（7.3 U/mg）、(GlcNAc)₅（4.7 U/mg）、pNP-GalNAc（3.3 U/mg）；无活性底物：胶体几丁质、壳聚糖、乙二醇几丁质、CMC
3.3 mHaHex74合成LNT2的条件优化、分离与鉴定
mHaHex74合成LNT2的条件优化为：0.1 M (GlcNAc)₂、0.8 M β-乳糖、mHaHex74用量4.0 U/mL，pH 7.0、40°C反应2.5小时（图3）。这些条件与HaHex74几乎相同，唯pH从6.5变为7.0。在优化条件下，最大LNT2转化率达28.2%。
主要产物的正离子ESI质谱显示与LNT2（MW 545）相同的[M+Na]+峰，位于568.3（数据未显示）。产物进一步通过¹³C NMR谱鉴定，谱图与已报道的LNT2 NMR数据在β-半乳糖基C-3位被β-GlcNAc连接处匹配（化学位移81.9 ppm）（数据未显示）。
虽然已有报道部分β-N-乙酰氨基己糖苷酶可合成LNT2，但多数只能使用昂贵的活化人工底物作为供体，如来自Bifidobacterium bifidum的BbhΙ和来自Catenibacterium mitsuokai的CmHex189。仅发现3种β-N-乙酰氨基己糖苷酶能利用天然底物(GlcNAc)₂合成LNT2，即来自土壤宏基因组文库的HEX1和HEX2，以及来自Haloferula sp.的HaHex74。由于HEX1（2.0%）和HEX2（8.0%）的LNT2转化率较低，研究者通过环序列插入对HEX1和HEX2进行改造，获得一个LNT2转化率显著提高的变体（HEX1GTEPG，4.7%）。本研究中，mHaHex74的转化率高达28.2%，是迄今报道的天然底物合成LNT2的最高转化率。因此，mHaHex74可能是高效环保合成HMOs的优良候选酶。
【数据】优化条件：0.1 M (GlcNAc)₂ + 0.8 M β-乳糖 + 4.0 U/mL酶，pH 7.0，40°C，2.5h；最大LNT2转化率：28.2%；ESI-MS：[M+Na]+峰m/z 568.3（MW 545）；¹³C NMR：C-3化学位移81.9 ppm；对比：HEX1（2.0%）、HEX2（8.0%）、HEX1GTEPG（4.7%）
3.4 HaHex74突变体的结构分析
HaHex74的整体结构呈现典型的(β/α)₈-TIM桶状折叠。mHaHex74与野生型HaHex74的模型比对分析显示，催化沟周围的环结构发生反转（图4）。mHaHex74的催化沟结构与HaHex74相似，表明双位点突变未引起催化沟结构变化。
HaHex74中的Asn401和His394均位于酶表面（图5A）。Asn401位于活性位点入口处（图5B和C）。当酶内部的His残基被Leu替换后，苯环结构消失（图5D和E）。
已有报道指出，通过增加活性位点入口的疏水性，可以将水分子排除在催化沟之外，催化沟中低水活度可能导致高转糖基活性。四个Asn401残基被高疏水性残基替换的突变体，即Asn401Leu、Asn401Pro、Asn401Tyr和Asn401Ile，其LNT2转化率均高于HaHex74（表1）。在其他酶中也观察到类似结果。对于来自B. lehensis G1的麦芽糖淀粉酶，将催化沟入口处的Met替换为高疏水性的Ile后，该酶的转糖基活性提高，T/H值增加了4.2倍。此外，Asn401残基被Ile替换的突变体（Asn401Ile）导致催化沟变窄（图5B和C），这可能保护中间产物免于水解，从而进一步提高转糖基活性。
【数据】结构特征：(β/α)₈-TIM桶状折叠；突变位置：Asn401（活性位点入口）、His394（酶内部表面）；Asn401Ile导致催化沟变窄；参考：B. lehensis G1麦芽糖淀粉酶Met→Ile后T/H值增加4.2倍
3.5 从粉状几丁质合成LNT2和LNnT
在5 L反应器中进行了从几丁质合成LNT2和LNnT的三酶级联反应。球磨粉状几丁质经几丁质酶PbChi70水解后，加入mHaHex74和β-乳糖合成LNT2，随后利用β-半乳糖苷酶BgaD-D将LNT2转化为LNnT（图6）。反应结束后，LNT2和LNnT的含量分别达到15.0 g/L和4.9 g/L。
【数据】反应器规模：5 L；LNT2产量：15.0 g/L；LNnT产量：4.9 g/L
讨论与解读
本研究通过定向进化和位点饱和突变对来自Haloferula sp.的β-N-乙酰氨基己糖苷酶HaHex74进行了分子改造，获得了具有双替换（His394Leu和Asn401Ile）的突变体mHaHex74。与野生型HaHex74相比，mHaHex74的转糖基活性提高了2.2倍。结构分析揭示，Asn401位于活性位点入口处，被高疏水性残基Ile替换后导致催化沟变窄，可能通过排斥水分子保护糖基中间体免于水解，从而提高转糖基活性。在5 L反应器中，三酶级联反应从几丁质合成LNT2和LNnT的含量分别达15.0 g/L和4.9 g/L。
编译者解读：该研究展示了一条完整的"酶工程—机制解析—过程放大"链条。从合成生物学应用角度看，亮点在于将廉价几丁质原料通过多酶级联转化为高价值人乳寡糖，且突变策略（活性位点入口疏水化）具有可推广的理性设计逻辑。局限性在于mHaHex74的比活力和热稳定性较野生型有所下降，可能影响工业应用中的酶用量和操作窗口；此外，5 L反应器规模仍属中试级别，距离产业化尚需进一步放大验证。
参考来源
Liu Y. Directed evolution of a β-N-acetylhexosaminidase from Haloferula sp. for lacto-N-triose II and lacto-N-neotetraose synthesis from chitin. Enzyme and Microbial Technology, 2023. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2022.110177
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2022.110177