来源：Construction of a dual-enzyme cascade system for the directed biosynthesis of indigotin and indirubin from indican fermentation broth（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
靛蓝与靛玉红是源自马蓝等植物的双吲哚生物碱，具有重要工业应用价值。传统植物提取工艺复杂、产量低，化学合成则依赖大量有机试剂、污染严重。本研究对来源于 Methylophaga sp. SK1 的黄素依赖型单加氧酶 MeFMO 进行蛋白质工程改造，获得催化活性提高 2.1 倍的突变体 MeFMOQ318L/W319F，并与 β-葡萄糖苷酶 Asbg1 构建一锅法级联体系，实现从靛苷发酵液中高效定向转化靛蓝（413 mg/L，摩尔转化率 99.1%）和靛玉红（795 mg/L，摩尔转化率 80.0%）。
研究背景
靛蓝与靛玉红是靛玉红类吲哚生物碱化合物，也是中药青黛的主要活性成分。靛蓝作为历史悠久的天然染料，在食品、制药、纺织和化妆品制造中应用广泛，全球年需求量已达 8 万吨。其结构异构体靛玉红则表现出更显著的药理活性——不仅具有优异的抗癌、抗炎和神经保护作用，还已成功应用于慢性粒细胞白血病的临床治疗，在多种癌症和炎症性疾病治疗中展现出巨大潜力。
当前靛蓝与靛玉红的生产主要依赖三条途径：植物提取、化学合成和生物转化。传统植物提取法利用含靛苷的植物（如马蓝和木蓝），经浸泡发酵、空气氧化沉淀和纯化等工序制备目标化合物，但存在生产周期长、环境依赖性强、过程不可控（依赖自然发酵）、产率低（<0.5% 干重）和环境污染严重等局限。化学合成虽效率高，却需使用大量有机试剂。在绿色生产理念推动下，符合可持续发展原则的生物催化技术为靛蓝与靛玉红的生物合成开辟了新路径。
研究方法
2.1 菌株、质粒、培养基与化学品
编码黄素依赖型单加氧酶（MeFMO，GenBank: AF494423.2）、β-葡萄糖苷酶（Asbg1，GenBank: KF660588）和葡萄糖脱氢酶（GDH，GenBank: AFQ56330.1）的基因以及突变引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本研究所用全部质粒和菌株列于表 S1。E. coli DH5α 和 BL21(DE3)（Invitrogen）分别用于质粒扩增和重组酶生产。TransStart FastPfu DNA 聚合酶、T4 多核苷酸激酶（T4 PNK）和 T4 DNA 连接酶（T4 DLig）购自北京全式金生物技术有限公司。培养基采用标准 Luria-Bertani（LB）肉汤和 Terrific Broth（TB）。靛苷（纯度 >97%）购自南京元芝生物科技有限公司。
【数据】靛苷纯度：>97%；菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)
2.2 MeFMO 的分子对接
MeFMO 的三维结构取自蛋白质数据库（PDB ID: 2XVE），吲哚的三维结构（PubChem CID: 798）从 PubChem 数据库获取。对接前，使用 AutoDock Tools 进行蛋白质结构预处理。利用 AutoDock 4.2.6 进行 MeFMO 与吲哚的分子对接，参数设置如下：格点盒大小为 40 × 40 × 40，中心坐标为（x = 7.95, y = 32.87, z = 1.27），以覆盖结合口袋。共执行 50 次独立对接模拟，结果按结合亲和力排序，选取最优构象进行后续分析。使用 PyMOL 分子图形系统完成对接结果可视化和 MeFMO 与吲哚间相互作用机制的表征。
【数据】格点盒：40 × 40 × 40；中心坐标：(7.95, 32.87, 1.27)；对接次数：50
2.3 质粒构建与 MeFMO 突变体文库构建
编码黄素依赖型单加氧酶（MeFMO）和 β-葡萄糖苷酶（Asbg1）的基因分别克隆至 pET-28a 载体，构建重组质粒 pET-28a-MeFMO 和 pET-28a-Asbg1。葡萄糖脱氢酶基因（GDH）插入 pETDuet-1 载体，构建 pETDuet-1-GDH。本研究所用全部正向和反向互补寡核苷酸引物列于表 S2。以重组质粒 pET28a-MeFMO 为模板，通过反向 PCR 在选定残基处进行定点饱和突变，使用 NNK 简并密码子（其中 N = A/T/G/C，K = G/T）覆盖所有可能的氨基酸替换。随后以最高活性突变体质粒为模板，在有益位点进行迭代突变。各突变体对吲哚的催化效率通过体外反应中吲哚消耗量的高效液相色谱（HPLC）监测来评估。
【数据】简并密码子：NNK（N = A/T/G/C，K = G/T）
2.4 重组蛋白表达
将 2.3 中构建的重组质粒分别转化至感受态 E. coli BL21(DE3) 细胞，获得表达 MeFMO、Asbg1 和 GDH 的菌株。过夜培养后，以 1%（v/v）接种量转接至含相应抗生素的 LB 培养基中（MeFMO 和 Asbg1 用 50 μg/mL 卡那霉素，GDH 用 100 μg/mL 氨苄青霉素），于 37°C、200 rpm 振荡培养至对数生长期。MeFMO 以 0.2 mM IPTG 诱导，18°C 培养 24 h；GDH 以 0.6 mM IPTG 诱导，28°C 培养 22 h；Asbg1 无需 IPTG 诱导，25°C 培养 22 h。细胞经 8000 rpm 离心 10 min 收集，重悬于 25 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.8），超声破碎。粗酶液经 12,000 rpm 离心 15 min 去除细胞碎片后获得。
【数据】接种量：1%（v/v）；卡那霉素：50 μg/mL；氨苄青霉素：100 μg/mL；IPTG：0.2 mM（MeFMO）/0.6 mM（GDH）；温度：18°C/28°C/25°C；时间：24 h/22 h/22 h；离心：8000 rpm 10 min、12000 rpm 15 min；缓冲液：25 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.8）
2.5 MeFMO 及其突变体酶活测定
反应体系（100 μL）含 50 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 7.5）、1 mM 吲哚、1 mM NADPH 和 30 μL MeFMO 或其突变体（补充半胱氨酸的体系中额外添加 5 mM 半胱氨酸）。反应于 45°C 进行 1 h，加入 300 μL 甲醇终止反应。吲哚消耗量通过 HPLC 测定。
【数据】缓冲液：50 mM 柠檬酸盐缓冲液（pH 7.5）；吲哚：1 mM；NADPH：1 mM；半胱氨酸：5 mM；温度：45°C；时间：1 h；酶液：30 μL；终止剂：300 μL 甲醇
2.6 氨基酸和还原剂对反应体系的影响
反应体系中分别添加 5 mM 氨基酸（半胱氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、色氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、组氨酸、精氨酸或丝氨酸）或还原剂（抗坏血酸/Vc、谷胱甘肽/GSH、二硫苏糖醇/DTT 或十二烷基硫酸钠/SDS），同时加入 0.5 g/L 吲哚基葡萄糖苷、100 mM CPBS 缓冲液（pH 9.0）和 1 U/mL Asbg1。于 45°C 孵育 1 h 后，加入 400 μL DMF 终止反应。样品超声至有色沉淀完全溶解，12,000 rpm 离心 10 min，经 0.22 μm 滤膜过滤，HPLC 分析靛蓝和靛玉红含量。以未添加氨基酸或还原剂的产量为对照（100%）。随后将 MeFMO 纳入上述体系，评估氨基酸和还原剂对一锅法反应产物的影响，同样以无添加剂时的产量为对照（100%）。
【数据】氨基酸/还原剂浓度：5 mM；吲哚基葡萄糖苷：0.5 g/L；CPBS 缓冲液：100 mM（pH 9.0）；Asbg1：1 U/mL；温度：45°C；时间：1 h；终止剂：400 μL DMF
2.7 靛苷发酵液的制备与预处理
以 E. coli 为宿主菌，携带编码色氨酸酶、黄素依赖型单加氧酶、UDP-葡萄糖基转移酶、葡萄糖脱氢酶、纤维二糖磷酸化酶和 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因。反应体系以 1.5 g/L 色氨酸为底物，添加 10 g/L 纤维二糖以增强 β-葡萄糖苷酶活性，并添加 0.1 mM IPTG 和 5 mM 葡萄糖支持细胞生长。体系在含 1% 菊粉作为碳源的 TB 培养基中进行 72 h，通过色氨酸酶和黄素依赖型单加氧酶的协同作用——将色氨酸转化为吲哚再进一步转化为靛苷——实现靛苷的异源合成。异源合成结束后，发酵液于 12000 rpm 离心 20 min 分离细胞，所得上清液即为靛苷发酵液。向发酵液中加入等体积超纯水，充分振荡混匀，再次于 12000 rpm 离心 15 min 去除水不溶性沉淀。随后用 pH 9.0 的 Gly-NaOH 缓冲液将上清液 pH 调至 7.0，充分混匀后于 12000 rpm 离心 15 min 去除额外沉淀。发酵液随后采用微波法浓缩——中高火力煮沸至体积减少为原来的一半，然后于 12000 rpm 离心 15 min。该浓缩过程按需重复。最后，用 Gly-NaOH 缓冲液将浓缩发酵液 pH 再次调至 7.0，获得浓度为 10 g/L 的靛苷浓缩液。
【数据】色氨酸：1.5 g/L；纤维二糖：10 g/L；IPTG：0.1 mM；葡萄糖：5 mM；碳源：1% 菊粉；培养时间：72 h；离心：12000 rpm 20 min、15 min；靛苷浓缩液浓度：10 g/L
2.8 靛苷发酵液生物催化转化定向生产靛蓝或靛玉红
将浓缩液用水稀释至适当浓度，随后加入 Asbg1（用于靛苷水解）和 MeFMO 进行一锅法串联酶反应。反应体系中补充 100 mM Gly-NaOH 缓冲液和 1 mM NADPH 以促进氧化缩合。反应指定时间后，加入 DMF 终止反应，超声确保产物完全溶解。不溶性残渣经 12,000 rpm 离心 10 min 去除，上清液经 0.22 μm 滤膜过滤后进行 HPLC 分析。
【数据】Gly-NaOH 缓冲液：100 mM；NADPH：1 mM；离心：12,000 rpm 10 min
2.9 HPLC 分析
目标化合物采用 Agilent 1260 HPLC 系统（安捷伦科技，美国）定量分析，配备 Agilent Eclipse XBridge-C18 色谱柱。
【数据】色谱柱：Agilent Eclipse XBridge-C18
研究结果
3.1 MeFMO 的蛋白质工程
#### 3.1.1 分子对接分析与 NNK 饱和突变
前期研究表明，单加氧酶 MeFMO 在靛蓝和靛玉红的生物合成途径中发挥关键催化作用。酶用量直接影响催化反应效率和目标产物的定向合成。为确保高产率同时降低酶使用成本，本研究采用蛋白质工程技术在分子水平对 MeFMO 进行改造。通过将半理性设计与定向进化策略相结合，旨在提高 MeFMO 的催化活性和底物亲和力，从而提升酶利用效率。对酶结构-功能关系及其与底物相互作用机制的全面理解是理性酶设计的理论基础。分子对接与分子动力学（MD）模拟的整合为催化性能优化提供了理论指导。X 射线晶体学分析显示，MeFMO 包含两个不同的结构域：负责 FAD 辅因子结合的大结构域（残基 1–164 和 276–447）以及参与 NADPH 结合的小结构域（残基 165–275）。基于上述结构信息，使用 AutoDock 软件对底物吲哚进行分子对接（图2），鉴定出底物结合口袋 6 Å 半径内的 13 个关键氨基酸残基：N73、G74、P75、C78、F165、Y207、Q318、W319、Y320、S321、F397、W400 和 K404。此前研究表明，MeFMO 活性位点含有六个关键残基（W47、M66、N73、F165、Y207 和 S208），对这些位点进行饱和突变后，多数突变体的催化活性显著降低。基于结构分析和对接结果，使用 NNK 简并密码子（N = A/T/C/G，K = T/G）对 6 Å 底物结合区域内的残基进行系统突变，所得突变体文库用于后续筛选。
考虑到半胱氨酸是靛玉红生物合成途径中的关键前体，本研究在常规吲哚催化效率评估体系之外，建立了将半胱氨酸纳入反应体系的新型比活测定方法。这种双体系策略能够在更贴近生理生物合成条件下全面评估突变酶的催化性能。如图 3a 所示，从文库中鉴定出多个具有不同催化特性的突变体。约 35% 的保守突变体保留了超过 60% 的基础活性，而若干突变体表现出显著增强的催化性能。其中，Q318L 突变体的提升最为显著——在标准测定体系中，其对吲哚的比活较野生型提高 46%；在含半胱氨酸体系中提高 44%。分子动力学模拟揭示了这一增强效应的潜在机制（图 3b 和 c）：Q318L 突变体中亮氨酸的支链烷基侧链与吲哚环形成新的疏水相互作用，优化了底物结合口袋的疏水微环境，稳定了吲哚环利于亲核攻击的有利取向。这种结构优化显著提高了底物亲和力。
为验证本研究突变策略的优越性，构建并测试了文献中报道的两个参照突变体：D197E 单点突变体和 K223R/D317S 双点突变体。实验结果证实，本研究产生的 Q318L 突变体的催化性能显著优于已报道的参照突变体。
【数据】6 Å 半径内关键残基：13 个；保守突变体保留活性：约 35% 保留 >60% 基础活性；Q318L 比活提高：标准体系 +46%、含半胱氨酸体系 +44%
#### 3.1.2 双突变体的构建
在前期筛选获得优势突变体 MeFMO-Q318L 的基础上，本研究进一步选取六个关键残基（K223R/D317S、D197E、F165H、P75V、W319F 和 C78I）进行组合突变。采用"模板引导的位点特异性优化"策略，将理性设计与实验验证相结合，成功构建了六个新型突变体。对六个突变体的酶活比较发现，MeFMOQ318L/W319F 双突变体的催化增强效果最为显著——催化活性为野生型的 2.1 倍，且在含半胱氨酸体系中仍保持优越活性（图 4a）。
晶体学分析显示，Q318L 和 W319F 突变体的空间构象发生显著变化，氨基酸侧链长度大幅缩短，导致活性位点空腔体积增大、空间位阻降低（图 4b 和 c）。这些结构修饰促进了底物更有效地进入活性位点，增强了酶-底物复合物的稳定性，最终提高了酶与底物的结合亲和力。这些发现与前期研究一致——例如 Sun 等人的研究显示，类似的结构修饰促进了底物向催化中心的可及性并稳定了酶-底物复合物，显著增强了酶与底物之间的分子识别。
在此基础上，进一步研究了双突变体的酶学性质。结果表明，与野生型相比，MeFMOQ318L/W319F 双突变体的最适 pH 仍为 7.0，而最适温度升高了 10°C 至 40°C。这提示突变可能通过疏水相互作用或降低芳香族残基的空间位阻增强了酶的刚性，使该突变体更适合在较高温度下运行的生物催化体系。MeFMOQ318L/W319F 双突变体表现出增加的辅因子依赖性——添加 1 mM NADPH 后比活提高 8 倍（图 S1）。这一现象可能与突变诱导的辅因子结合结构域构象优化有关。例如，319 位苯丙氨酸可能通过 π-π 堆积稳定 NADPH 的腺嘌呤环，从而提高电子传递效率，为工业生物催化应用提供了优势。此外，与野生型酶相比，MeFMOQ318L/W319F 突变体在弱碱性条件（pH 8.0–9.5）下的稳定性增强（图 S2），其热稳定性也显著提高（图 S3）。这一变化可能归因于 318 位引入亮氨酸增强了疏水核心的稳定性，或 319 位色氨酸被苯丙氨酸取代后减少了碱性条件下芳香族残基间的电荷排斥并降低了高温下的构象波动。
动力学参数如表 1 所示：野生型 MeFMO 以吲哚为底物时的 K m 为 16.2 mM，V max 为 167.7 μmol·mg⁻¹·s⁻¹，催化效率（k cat /K m）为 0.17 mM⁻¹·s⁻¹。相比之下，MeFMOQ318L/W319F 突变体的 K m 为 11.6 mM，V max 为 238.2 μmol·mg⁻¹·s⁻¹，k cat /K m 为 0.34 mM⁻¹·s⁻¹。这些结果表明，双突变体 MeFMOQ318L/W319F 显著提高了对吲哚的底物亲和力和催化效率。
【数据】MeFMOQ318L/W319F 催化活性：野生型的 2.1 倍；最适 pH：7.0（不变）；最适温度：40°C（+10°C）；NADPH 添加后比活提高：8 倍；野生型 K m：16.2 mM；野生型 V max：167.7 μmol·mg⁻¹·s⁻¹；野生型 k cat/K m：0.17 mM⁻¹·s⁻¹；突变体 K m：11.6 mM；突变体 V max：238.2 μmol·mg⁻¹·s⁻¹；突变体 k cat/K m：0.34 mM⁻¹·s⁻¹
3.2 氨基酸和还原剂对反应体系的影响
在靛苷定向生物合成靛蓝和靛玉红的过程中，氨基酸和还原剂对酶活性和反应途径有重要影响，从而调控产物效率、产量和纯度。氨基酸能够增强靛苷代谢中关键酶的催化性能，可能改善生物转化过程。
【数据】原文未详述本节具体数值
（注：原文结果部分在此处被截断，后续靛蓝/靛玉红合成条件优化、GDH/NADPH 再生系统整合、三步预处理策略、最终产量与摩尔转化率等结果内容未包含在原文节选范围内。）
讨论与解读
本研究系统评估了从靛苷发酵液中选择性合成靛蓝和靛玉红的可行性。靛苷作为两种色素的关键前体，在产靛植物中含量丰富，但其大规模提取仍面临技术挑战，异源生物合成因此成为更有前景的替代方案。然而，微生物合成获得的靛苷通常伴随复杂杂质，增加了纯化难度并限制了酶催化效率。为突破这一瓶颈，本研究对黄素依赖型单加氧酶 MeFMO 进行工程改造，催化活性较野生型提高 2.1 倍。通过构建 MeFMO 与 Asbg1 组成的双酶级联体系，实现了从发酵液中直接选择性生物合成靛蓝和靛玉红。体系中还整合了 NADPH 再生模块——利用靛苷水解释放的游离葡萄糖作为葡萄糖脱氢酶（GDH）的底物——从而提高了过程效率、可持续性和成本效益。在优化条件下，靛蓝和靛玉红的摩尔转化率分别达到 99.1% 和 80.0%，展现出明确的技术优势。
编译者解读
该研究的亮点在于"从发酵液直接到产物"的级联设计思路——跳过中间纯化步骤，用双酶一锅法将含杂质的靛苷发酵液直接转化为高值色素，这在工业放大中可显著降低分离成本。蛋白质工程部分采用半理性设计结合双体系筛选（标准体系 + 含半胱氨酸体系），策略上兼顾了靛玉红合成路径中半胱氨酸前体的实际需求，筛选出的 Q318L/W319F 双突变体在亲和力和热稳定性上均有改善。NADPH 再生模块利用靛苷水解释放的葡萄糖作为 GDH 底物，属于巧妙的内源性辅因子循环设计。不过，靛玉红 80.0% 的摩尔转化率仍有提升空间，且发酵液预处理步骤较多，工业化时需评估整体经济性。未来若能将三步预处理简化为一步或实现连续流反应，该绿色合成路线的竞争力将进一步提升。
参考来源
Luo J. Construction of a dual-enzyme cascade system for the directed biosynthesis of indigotin and indirubin from indican fermentation broth. Bioorganic Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bioorg.2025.109381
DOI: 10.1016/j.bioorg.2025.109381