来源：Engineering an Mn(II)-oxidizing Pseudomonas whole-cell catalyst chassis to efficiently biosynthesize 2,5-furandicarboxylic acid from hydroxymethylfurfural（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
2,5-呋喃二甲酸（FDCA）是合成生物基聚合物的重要单体，但其微生物转化受限于底物5-羟甲基糠醛（HMF）的细胞毒性。本研究以Mn(II)氧化假单胞菌MB04B为出发菌株，通过基因组删减构建工程化底盘MB04C-6，引入外源基因盒后结合CaCO₃优化反应体系，使FDCA产量提升约63.4倍。进一步优化CRISPR关联转座酶系统实现染色体单步整合，最优菌株MB04S-HMF8在12小时内从100 mmol/L HMF快速生产97 mmol/L FDCA，产率达1.26 g L⁻¹h⁻¹。
研究背景
化学品生产目前消耗地球化石资源的十分之一，预计未来十年将翻倍。向可再生生物质转型是应对此挑战的重要路径。HMF作为关键底物，其衍生物FDCA因可替代石油基对苯二甲酸用于生产聚2,5-呋喃二甲酸乙二醇酯（PEF）等生物基聚合物而备受关注。美国能源部已将FDCA列为"生物质高附加值化学品"之一。化学催化氧化合成FDCA虽为主流方法，但依赖贵金属催化剂且需高温高压条件。生物催化被视为有前景的替代方案，然而HMF的细胞毒性及氧化胁迫严重限制了微生物全细胞催化的效率。Mn(II)氧化细菌能在高活性氧胁迫下维持正常生长代谢，为FDCA生物合成提供了独特的宿主平台。
研究方法
4.1 化学试剂
HMF（纯度98.5%）和FDCA（纯度99.9%）购自毕得医药（Bide Pharmatech Co., Ltd., 上海，中国）。MnO₂（纯度99%）购自麦克林（上海麦克林生化科技有限公司，中国）。色谱级乙腈（纯度≥99.8%）、5-氟乳清酸（5-FOA）和leucoberbelin blue（LBB）购自Sigma-Aldrich。所有化学品均为分析纯或更高纯度，未经进一步纯化直接使用。
【数据】HMF纯度：98.5%；FDCA纯度：99.9%；MnO₂纯度：99%；乙腈纯度：≥99.8%
4.2 菌株、质粒与培养条件
本研究所用细菌菌株和质粒列于表S4和表S5。野生型Mn(II)氧化菌株Pseudomonas sp. GSICC31629（甘肃省微生物菌种保藏中心，兰州，中国）MB04B作为亲本菌株用于构建工程化底盘MB04C-6。大肠杆菌Mach1-T1作为宿主菌株用于构建各种基因操作所需重组质粒，大肠杆菌S17-1/λpir作为含R6K复制子质粒的宿主菌株，用于大肠杆菌-假单胞菌接合转移。大肠杆菌常规在Luria–Bertani（LB）培养基中于37°C、150 rpm振荡培养。假单胞菌细胞在LB、M9或Lept培养基中于30°C、150 rpm振荡培养。重组大肠杆菌培养时按需添加氨苄青霉素（Amp，100 μg mL⁻¹）、卡那霉素（Kan，50 μg mL⁻¹）、庆大霉素（Gen，20 μg mL⁻¹）、红霉素（Ery，400 μg mL⁻¹）和四环素（Tet，20 μg mL⁻¹）。重组假单胞菌按需添加Ery（500 μg mL⁻¹）、Kan（50 μg mL⁻¹）、Gen（50 μg mL⁻¹）和Tet（50 μg mL⁻¹）。为形成BMO聚集体，假单胞菌在含1 mmol/L MnCl₂的Lept肉汤中于28°C、200 rpm连续培养24–72小时。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；转速：150 rpm；假单胞菌培养温度：30°C；转速：150 rpm；Amp浓度：100 μg mL⁻¹；Kan浓度：50 μg mL⁻¹（大肠杆菌）/50 μg mL⁻¹（假单胞菌）；Gen浓度：20 μg mL⁻¹（大肠杆菌）/50 μg mL⁻¹（假单胞菌）；Ery浓度：400 μg mL⁻¹（大肠杆菌）/500 μg mL⁻¹（假单胞菌）；Tet浓度：20 μg mL⁻¹（大肠杆菌）/50 μg mL⁻¹（假单胞菌）；MnCl₂浓度：1 mmol/L；BMO培养温度：28°C；转速：200 rpm；时间：24–72 h
4.3 Mn(II)氧化活性测定
全细胞悬液的Mn(II)氧化活性采用标准LBB法测定。该方法定量Mn氧化物的产生量，主要假定为MnO₂。以KMnO₄为标准品测定620 nm处吸光度。产生的MnO₂浓度（1 mmol/L MnO₂对应0.4 mmol/L KMnO₄）定义为细胞悬液的Mn(II)氧化活性值。
【数据】检测波长：620 nm；换算关系：1 mmol/L MnO₂ = 0.4 mmol/L KMnO₄
4.4 基因操作
本研究中用于PCR扩增目标DNA的所有寡核苷酸引物列于表S6。Pseudomonas sp. MB04B基因组序列可在DDBJ/ENA/GenBank数据库获取，登录号为JALLPP000000000。假单胞菌和大肠杆菌的基因组DNA使用"细菌基因组DNA提取试剂盒"（天根生化科技（北京）有限公司，北京，中国）制备和纯化。DNA浓度使用NanoDrop™ 2000 UV–Vis分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定。嵌合基因装配采用标准Gibson一步克隆方案。基因破坏、mini-Tn7介导的染色体整合以及大肠杆菌与假单胞菌之间的质粒接合转移按照先前描述的方案进行。hmfH和hmfH′基因序列经计算机模拟优化以匹配假单胞菌最优密码子，并使用聚合酶循环组装法合成。序列经Sanger测序确认。实验室未发表的质粒pMBCP211用作大肠杆菌与Pseudomonas sp. MB04B之间的穿梭载体。PMP00-hmfH和PJ23119-hmfH′基因盒经EcoR I和Sac I双酶切后连接到同样酶切的pMBCP211中，产生重组质粒pMBCP211-HMF。
具体而言，使用双sgRNA靶向切割提升大片段删除效率，sgRNA序列列于表S7。含不同启动子与gfp基因的报告基因通过mini-Tn7转座系统插入glmS基因上游25核苷酸位点以评估启动子强度。
CRISPR关联转座酶系统用于构建含单拷贝和多拷贝大片段外源基因整合至染色体的各种工程化底盘细胞。首先，按照技术路线构建pEFF系列载体（图S14）。简言之，将来自亲本质粒pSPIN的Cascade-TnsA/B/C（转座子）片段经PCR扩增，然后与PCR扩增的线性化pBBR1质粒片段通过Gibson一步组装法无缝连接。由此产生一系列含不同启动子的重组pEFF质粒，通过类似方案替换启动子以提升转座效率。随后，pSPIN中的CRISPR阵列、货物及转座左右臂区段经PCR扩增。这些片段连接到PCR扩增的线性化pSGRNA上，产生一系列pDonor载体（图S15），每个载体含有类似克隆的启动子以产生CRISPR RNA（crRNA）（表S7）和货物。其中，crRNA-0用于CRISPR关联转座酶系统的优化，crRNA-1和crRNA-2用于基因盒整合至MB04C-6基因组。
为构建pGDonor系列载体，首先将PCR扩增的线性化pDonor片段（不含pRO1600 Rep区）与来自pUCP18R6KT-miniTn7-TetR的PCR扩增线性化R6K gamma复制起点片段通过Gibson一步组装法连接，产生pGDonor载体（图S16）。随后，采用类似克隆策略将pGDonor中转座子左右臂之间的区域替换为四环素抗性（Tcʳ）基因或红霉素抗性（Eryʳ）基因，两侧翼接FRT位点，分别形成衍生载体pGDonorTet和pGDonorE。此外，衍生载体pGDonorG由pGDonorE经先删除庆大霉素抗性（Gmʳ）基因、再将FRT位点内的Eryʳ基因替换为Gmʳ基因而生成（图S16）。
为构建含大片段外源基因整合至染色体的重组菌株，将pEFF系列载体通过电转化导入特定假单胞菌受体菌株。随后将含CRISPR阵列和货物的pDonor及pGDonor载体接合转移至所得受体菌株。在含适当抗生素的VBMM培养基中培养48小时后，对生长出的菌落进行PCR扩增，通过靶向相应插入片段验证设计的转座事件，随后进行测序分析。之后，通过在无Kan的LB肉汤中培养48小时消除pEFF载体，并通过引入pFLP质粒去除FRT位点内的抗性基因，但Gmʳ基因除外——该基因使用特异性pFLP-Km去除。最后，利用基于sacB基因的反选择方法去除引入的pFLP质粒，最终获得不含抗生素抗性基因的整合菌株。
【数据】基因组数据库登录号：JALLPP000000000；限制性内切酶：EcoR I、Sac I；VBMM培养时间：48 h；pEFF消除时间：48 h
4.5 全细胞催化与FDCA产量检测
从LB或Lept平板上挑取Pseudomonas sp. MB04B或工程菌株的单菌落，在5 mL LB培养基中过夜培养。随后以1%（v/v）接种量转接至200 mL LB培养基中培养24小时。将细胞悬液离心，细胞重悬于含200 mmol L⁻¹ PB缓冲液（pH 7.0）的50 mL带挡板锥形瓶中，调整至特定600 nm光密度（OD600）。加入设定浓度的HMF……
【数据】接种量：1%（v/v）；培养时间：24 h；PB缓冲液浓度：200 mmol L⁻¹；pH：7.0；培养体积：200 mL
研究结果
2.1 通过自上而下策略构建工程化Pseudomonas sp. MB04B衍生底盘细胞
为鉴定MB04B基因组中可通过基因组编辑删除的潜在冗余基因，首先使用在线工具"Island Viewer 4"对MB04B基因组进行全基因组范围的基因岛预测。这些区域通常包含外源获得的基因，主要参与编码适应性相关表型。此外，MB04B的基因组注释表明其存在多个鞭毛基因，已有研究显示鞭毛消耗野生型P. putida菌株生命活动约2%的能量。鉴于MB04B可能存在类似的能量消耗，选择这些鞭毛基因及岛区基因（表S1），使用先前在MB04B中验证过的CRISPR-Cas9方法进行小规模基因组删除。为提升编辑效率，使用双sgRNA同时靶向两个不同位点（图S1），随后在MB04B中迭代编辑选定的删除区域（图1a）。由此构建了6个基因组删减程度不同的底盘细胞，命名为MB04C-1、-2、-3、-4、-5和-6（表S2）。
为评估基因组删除对生长和生理性能的影响，首先分析了各工程化底盘细胞的生长曲线。如图1b所示，与野生型MB04B及仅删除了prophage1的MB04C-1底盘相比，所有至少删除了prophage2区域的底盘细胞（MB04C-2、MB04C-3、MB04C-4和MB04C-5）在24小时培养期间均表现出显著的生长性能下降。此外，同时删除了prophage1和prophage2的工程化MB04C-2底盘，其代表性外源基因的转化效率（图1c）和表达强度（图1d）均显著低于MB04B和MB04C-1底盘。这些结果表明prophage2区域可能对宿主细胞的生长和代谢至关重要，不应删除——某些天然细菌可能已进化出适应环境的有利性状，而这些性状定位于原噬菌体区域或基因岛中。
因此，将prophage2区域重新引入通过最后一次迭代编辑获得的MB04C-5底盘基因组中，形成新的工程化底盘细胞MB04C-6。与预期一致，与野生型菌株MB04B及其他工程化底盘细胞相比，MB04C-6表现出最快的生长速度和最高的细胞数量（图1b）、转化效率（图1c）和外源基因表达强度（图1d）。MB04C-6的基因组与亲本菌株MB04B相比删除了约4.6%。进一步测定了MB04C-6和MB04B在以葡萄糖为唯一碳源的基础盐培养基中的生长速率（图S2a）和细胞干重（图S2b）。结果证实即使在寡营养培养条件下，工程化底盘细胞MB04C-6仍比野生型MB04B具有更强的生长性能。此外，由于鞭毛基因的删除，细胞运动性受损（图S3），可能在生长和代谢过程中重新分配了能量。鉴于这些优良性能，特别是外源基因的转化效率和表达强度较亲本MB04B分别显著提升了4.5倍和1.45倍，选择工程化MB04C-6作为本研究后续FDCA生物合成的底盘细胞。
【数据】基因组删除比例：约4.6%；转化效率提升：4.5倍；表达强度提升：1.45倍；培养时间：24 h
2.2 验证MB04B和MB04C-6底盘中的FDCA生物合成
FDCA的生物合成过程已通过图2a所示的催化途径阐明。该过程涉及HmfH以HMF为底物的酶催化。首先，呋喃环C2侧链上的醛基被氧化为羧基。随后，C5侧链上的羟基被氧化为醛基并进一步氧化为羧基，最终生成FDCA。然而，由于微生物代谢中的"糠醛分解代谢"，少量FDCA可被胞内蛋白UbiD和UbiX转化为2-糠酸和2-糠酰辅酶A，进而形成2-酮戊二酸进入三羧酸循环，影响转化率。在该生物合成过程中，会产生一定量的活性氧（ROS），主要为H₂O₂，对宿主细胞造成氧化胁迫。因此，底物毒性HMF与H₂O₂诱导的氧化胁迫的双重压力通常显著限制微生物细胞中通过生物催化氧化合成FDCA的可行性。
然而，Mn(II)氧化细菌能在高ROS胁迫水平下维持正常生长代谢，且MB04C-6底盘保持与其亲本菌株MB04B相似的Mn(II)氧化活性（图S4）。通过检测MB04B和MB04C-6在含30 mmol L⁻¹ HMF条件下的细胞生长来测试其对HMF细胞毒性的耐受性。与预期一致，MB04B和MB04C-6细胞生长旺盛，生长性能甚至超过对照菌株P. putida KT2440，培养24小时后细胞数量更高（图2b）。此外，MB04C-6能在24小时内将25 mmol L⁻¹ HMF转化为1.44 mmol L⁻¹ FDCA（图2c）。这些结果表明MB04C-6底盘能从HMF合成FDCA，但转化率相对较低。
【数据】HMF耐受浓度：30 mmol L⁻¹；培养时间：24 h；HMF转化：25 mmol L⁻¹ → FDCA 1.44 mmol L⁻¹；时间：24 h
2.3 全细胞催化合成FDCA
为提升MB04C-6底盘中将HMF转化为FDCA的性能，首先优化了来自Cupriavidus basilensis菌株的hmfH和hmfH′基因的密码子使用，以更好地适配假单胞菌。hmfH基因编码的酶已被鉴定为糠醛氧化还原酶，能氧化HMF、HMF酸、糠醛和糠醇；hmfH′基因编码膜结合转运蛋白，促进HMF从胞外培养基摄取至胞质中。随后将这两个基因分别与强组成型启动子PMP00和中强度组成型启动子PJ23119融合构建基因表达盒。两个表达盒均连接到载体pMBCP211中生成pMBCP211-HMF（图3a），进一步转化至MB04C-6产生重组MB04C-6/pHMF底盘。这使得hmfH和hmfH′得以表达，分别催化HMF的羟基和醛基转化为羧基以及增强HMF的转运。
与预期一致，表达优化后的hmfH/hmfH′后，MB04C-6/pHMF中HMF到FDCA的转化率显著提升。在24小时内从25 mmol L⁻¹ HMF获得14.3 mmol L⁻¹ FDCA，较引入hmfH/hmfH′前的MB04C-6转化率提升约9.9倍。然而，转化产物的高效液相色谱分析显示，除FDCA外还存在两种明显副产物（图3b）。这表明尽管hmfH/hmfH′在MB04C-6/pHMF底盘中的表达提升了转化率，但HMF并未完全转化为FDCA。液相色谱-串联质谱分析确认副产物为5-羟甲基呋喃-2-羧酸（HFCA）（[M−H]⁻ m/z 141.06）和呋喃-2,5-二甲酸（FFCA）（[M−H]⁻ m/z 139.04）……
【数据】FDCA产量：14.3 mmol L⁻¹（25 mmol L⁻¹ HMF，24 h）；提升倍数：约9.9倍；副产物：HFCA（m/z 141.06）、FFCA（m/z 139.04）
讨论与解读
FDCA被认为是开发"未来材料"的基础单体。本研究采用自上而下的技术策略，开发了首个经基因组编辑的Mn(II)氧化细菌底盘，以高效从HMF合成FDCA。与基于基因组删除的一般设计底盘不同，本研究构建的底盘细胞必须维持高Mn氧化活性。尽管基因组删除过程中避开了参与细胞生长和代谢的基因区域，但删除prophage2区域后底盘MB04C-5的生长性能仍显著下降。推测野生型细菌prophage2区域可能存在与生长间接相关的基因，或大基因簇的删除可能因三维基因组结构的损伤或功能障碍导致非基因型相关的表型变化。因此，通过重新引入prophage2区域构建了底盘MB04C-6，恢复了正常细胞生长并维持了与野生型MB04B相当的Mn(II)氧化活性。
【编译者解读】本研究亮点在于将Mn(II)氧化这一独特生理特性与基因组精简工程相结合，巧妙利用Mn(II)氧化细菌固有的ROS耐受能力应对HMF生物转化中的氧化胁迫。63.4倍的产量提升和1.26 g L⁻¹h⁻¹的产率展示了该底盘的应用潜力。但值得注意的是，基因组删减过程中prophage2区域的意外重要性提示了基因组精简策略的复杂性——并非所有"冗余"区域都可安全删除。CRISPR关联转座酶系统实现的无抗性标记染色体整合为工业菌株开发提供了更洁净的遗传操作工具。
参考来源
Liu Y. Engineering an Mn(II)-oxidizing Pseudomonas whole-cell catalyst chassis to efficiently biosynthesize 2,5-furandicarboxylic acid from hydroxymethylfurfural. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132036
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132036