来源：Refactoring the upper sugar metabolism of Pseudomonas putida for co-utilization of cellobiose, xylose, and glucose（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素水解物中含有葡萄糖、木糖及纤维二糖等多种糖类，微生物能否同时利用这些底物直接决定生物转化的经济性。本研究以基因组编辑菌株恶臭假单胞菌EM42为底盘，通过植入异源β-葡萄糖苷酶BglC和木糖代谢模块（XylE转运蛋白+XylA/XylB酶），并敲除gcd基因阻断木糖向木糖酸的"死端"氧化，成功实现了该菌对纤维二糖、木糖与葡萄糖的共利用。工程菌在24小时内完全消耗5 g/L纤维二糖，性能超越此前最优的工程大肠杆菌。
研究背景
恶臭假单胞菌KT2440是经GRAS认证的非致病土壤细菌，对工业污染物、木质纤维素水解副产物（糠醛、乙酸等）具有天然耐受性，这些特性使其成为恶劣生物转化反应的理想宿主。然而，该菌的天然营养谱集中于有机酸、芳香族化合物及部分己糖（葡萄糖、果糖），缺乏利用二糖和戊糖的能力。为拓展其生化网络，研究者向EM42菌株（KT2440的基因组编辑衍生物）植入了D-纤维二糖与D-木糖代谢的异源遗传模块。纤维二糖经由天然ABC转运复合体主动运输进入细胞，由来源于褐色热裂孢菌的β-葡萄糖苷酶BglC胞内裂解为葡萄糖；木糖的利用则需敲除编码广谱底物醌依赖性葡萄糖脱氢酶的gcd基因，防止木糖被氧化为木糖酸这一代谢死端产物，再表达大肠杆菌质子偶联同向转运蛋白XylE完成胞内摄入，由木糖异构酶和木酮糖激酶导向磷酸戊糖途径。最终获得的菌株可实现木糖与葡萄糖或纤维二糖的同步消耗至完全耗竭。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于原文表1。用于克隆或三亲本杂交的大肠杆菌菌株常规培养于LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）中，170 rpm振荡，37°C。辅助菌株HB101的培养基中添加氯霉素（Cm，30 μg/mL）。恶臭假单胞菌重组菌株常规于2.5 mL LB培养基中过夜预培养，30°C、300 rpm振荡（Heidolph Unimax 1010及Heidolph Incubator 1000；Heidolph Instruments，德国）。P. putida异源基因表达的初步测试中，细胞转移至含25 mL新鲜LB培养基的锥形瓶中，按2.4节所述条件培养。不同碳水化合物的生长实验中，过夜培养物经离心收集（4000 g，室温，5 min），用M9极限培养基（每升含：4.25 g Na₂HPO₄·2H₂O、1.5 g KH₂PO₄、0.25 g NaCl、0.5 g NH₄Cl）洗涤，添加MgSO₄至终浓度2 mM，并添加2.5 mL/L微量元素溶液（Abril et al., 1989）。大肠杆菌重组菌株的培养在极限培养基中添加盐酸硫胺素（1 mM）。细胞重悬至OD₆₀₀为0.1，加入25 mL含卡那霉素（Km，50 μg/mL）的上述培养基（含pSEVA2213或pSEVA238质粒的重组菌株），或含链霉素（Sm，60 μg/mL）的培养基（P. putida EM42 Δgcd bglC），并添加正文或相应图注中规定浓度的碳源（葡萄糖、木糖或纤维二糖）。所有固体培养基（LB和M9）含15 g/L琼脂。M9固体培养基配制时添加2 mM MgSO₄、2.5 mL/L微量元素溶液（Abril et al., 1989），并以0.2%（w/v）柠檬酸盐、0.4%木糖或0.4%纤维二糖作为唯一碳源。
【数据】LB培养基配方：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl；氯霉素：30 μg/mL；卡那霉素：50 μg/mL；链霉素：60 μg/mL；MgSO₄：2 mM；微量元素：2.5 mL/L；盐酸硫胺素：1 mM；琼脂：15 g/L；预培养温度：30°C；振荡：300 rpm
2.2 质粒与菌株构建
DNA操作采用标准实验室方案（Sambrook and Russell, 2001）。基因组DNA使用GenElute细菌基因组DNA试剂盒（Sigma-Aldrich，美国）提取。质粒DNA使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（Qiagen，美国）提取。本研究所用寡核苷酸引物（原文表S1）购自Sigma-Aldrich（美国）。目的基因通过聚合酶链式反应（PCR）扩增，使用Q5高保真DNA聚合酶（New England BioLabs，美国），按制造商方案进行。反应混合物（50 μL）另含聚合酶HF或GC缓冲液（New England BioLabs，美国）、dNTPs混合物（各0.2 mM；Roche，瑞士）、相应引物（各0.5 mM）、水、模板DNA及DMSO。GC缓冲液和DMSO用于P. putida基因的扩增。PCR产物用NucleoSpin Gel和PCR Clean-up试剂盒（Macherey-Nagel，德国）纯化。DNA浓度用NanoVue分光光度计（GE Healthcare，美国）测定。菌落PCR使用2× PCR Master Mix溶液（含Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液；Promega，美国）。所用限制酶均购自New England BioLabs（美国）。消化的DNA片段使用Quick Ligation试剂盒（New England BioLabs，美国）连接。PCR产物和酶切质粒经0.8%（w/v）琼脂糖凝胶电泳分离，用Molecular Imager VersaDoc（Bio-Rad，美国）显像。质粒构建经DNA测序确认（Macrogen，韩国）。化学感受态大肠杆菌Dh5α细胞用连接混合物或完整质粒转化，在含Km（50 μg/mL）的LB琼脂平板上筛选单克隆，并制备甘油（20% w/v）保存管。构建的质粒通过三亲本杂交从大肠杆菌Dh5α供体转移至P. putida EM42，使用含pRK600质粒的大肠杆菌HB101辅助菌株（原文表1）。或采用电穿孔法（2.5 kV，4–5 ms脉冲）转化P. putida细胞，使用MicroPulser电穿孔仪和0.2 cm间距Gene Pulser电转杯（Bio-Rad，美国）。P. putida电感受态细胞制备及电穿孔程序按已发表方案执行（Aparicio et al., 2015）。P. putida转接合子或转化子分别在含柠檬酸盐的M9琼脂平板或LB琼脂平板上筛选，添加Km（50 μg/mL），30°C过夜培养。
【数据】PCR体系：50 μL；dNTPs：各0.2 mM；引物：各0.5 mM；电穿孔参数：2.5 kV，4–5 ms脉冲；琼脂糖凝胶：0.8%（w/v）；甘油保存浓度：20%（w/v）
纤维二糖代谢模块的构建。 来源于解纤维素梭菌的ccel_2454基因（编码β-葡萄糖苷酶，EC 3.2.1.21）与共有核糖体结合位点（RBS；GeneArt/Thermo Fisher Scientific，德国）一同合成，从传递载体pMA_ccel2454经KpnI和PstI双酶切亚克隆至pSEVA238，获得pSEVA238_ccel2454。编码β-葡萄糖苷酶的bglX基因以bglX fw和bglX rv引物从P. putida KT2440基因组DNA经PCR扩增，用NdeI和HindIII消化后克隆至经修饰的pSEVA238相应限制性位点，获得pSEVA238_bglX。NdeI位点和共有RBS此前已引入pSEVA238的标准SEVA多克隆位点（未发表质粒）。来源于褐色热裂孢菌、带N端6×His标签的bglC基因（编码β-葡萄糖苷酶）从pET21a_bglC构建体亚克隆至经修饰pSEVA238的NdeI和HindIII限制性位点。含RBS和His标签的bglC基因随后以bglC fw和bglC rv引物PCR扩增，PCR产物经SacI和PstI酶切，亚克隆至pSEVA2213，获得pSEVA2213_bglC。
【数据】限制酶：KpnI、PstI、NdeI、HindIII、SacI；来源菌株：Clostridium cellulolyticum、Thermobifida fusca、P. putida KT2440
bglC基因插入P. putida染色体。 含共有RBS的bglC基因亚克隆至mini-Tn5载体pBAMD1–4（Martínez-García et al., 2014a）的SacI和PstI位点。原始pBAMD1–4质粒带有亚克隆至AvrII和EcoRI位点的pEM7启动子。P. putida EM42 Δgcd细胞（100 μL）与质粒DNA（200 ng）电穿孔，在5 mL改良Terrific Broth（TB）培养基（酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨20 g/L，KH₂PO₄ 0.017 M，K₂HPO₄ 0.072 M）中30°C、170 rpm振荡恢复7小时。细胞经离心收集（4000 rpm，10 min），重悬于100 mL含5 g/L纤维二糖和链霉素（50 μg/mL）的选择性M9培养基中。30°C、170 rpm振荡孵育四天后，细胞离心（4000 rpm，15 min），涂布于含5 g/L纤维二糖和链霉素（50 μg/mL）的选择性M9琼脂平板。三个生长最快的克隆在含链霉素或含链霉素（50 μg/mL）和氨苄青霉素（500 μg/mL）的新鲜M9琼脂平板上重新划线，以排除整个pBAMD1–4质粒的插入。三个候选克隆在含纤维二糖的液体极限培养基中的生长得到验证。生长最快克隆的染色体中表达盒（pEM7启动子、bglC基因、T500转录终止子和aadA基因）的插入位点通过两轮任意引物PCR确定，使用Arb6、Arb2、ME-O-Sm-Ext-F和ME-O-Sm-Int-F引物（表S1），按此前发表的方案进行（Martínez-García et al., 2014a）。ME-O-Sm-Int-F用作PCR产物的测序引物。bglC表达盒在P. putida染色体中的位置通过菌落PCR反向验证，使用bglC check fw和xerD check rv引物。
【数据】电穿孔DNA量：200 ng；恢复时间：7 h；恢复培养基：改良TB（酵母提取物24 g/L，胰蛋白胨20 g/L，KH₂PO₄ 0.017 M，K₂HPO₄ 0.072 M）；恢复温度：30°C；振荡：170 rpm；选择培养基：M9 + 5 g/L纤维二糖 + 链霉素50 μg/mL；孵育时间：4天；氨苄青霉素：500 μg/mL
木糖代谢模块的构建。 大肠杆菌xyl操纵子中编码木糖异构酶（EC 5.3.1.5）XylA和木酮糖激酶（EC 2.7.1.17）XylB的xylAB部分以xylAB fw和xylAB rv引物从大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA扩增。PCR产物经EcoRI和BamHI消化，连接至pSEVA2213，获得pSEVA2213_xylAB。木糖-质子同向转运蛋白基因（xylE）以两步PCR方案从大肠杆菌BL21（DE3）基因组DNA扩增。第一步，基因以xylE fw 1和xylE rv 1引物扩增。含PCR产物的反应混合物样品（1 μL）转移至第二步反应，使用xylE fw 2和xylE rv 2引物。最终PCR产物经BamHI和HindIII消化，克隆至下游……
（方法部分后续内容原文未完整提供，包括xylE克隆至pSEVA2213的具体操作、pSEVA2213_xylABE的构建步骤及P. putida突变株构建细节等，原文此处截断。）
【数据】来源菌株：E. coli BL21（DE3）；限制酶：EcoRI、BamHI、HindIII；PCR模板量：1 μL（第一步产物）
研究结果
3.1 纤维二糖代谢模块的工程化
P. putida EM42在含纤维二糖的极限培养基中的初步测试显示，该平台菌株不能在二糖上生长（图2A）。在纤维二糖上不生长意味着要么缺乏跨膜转运，要么缺乏二糖水解或磷酸解的酶学机制。由于在培养上清液或与纤维二糖共孵育的细胞裂解物中未检测到β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）活性，研究初期聚焦于后一瓶颈。研究者测试了两种不同胞内β-葡萄糖苷酶的功能表达：来自革兰氏阳性中温细菌解纤维素梭菌的Ccel_2454，以及来自革兰氏阳性嗜热细菌褐色热裂孢菌的BglC（所有酶的核苷酸序列见支撑信息）。两种酶均在大肠杆菌中成功表达，且与中等温度和中性或微酸性pH兼容（Desai et al., 2014; Fan et al., 2012; Spiridonov and Wilson, 2001）。此外，还过表达了EM42内源bglX基因（PP_1403），该基因在Pseudomonas Genome Database（www.pseudomonas.com/）中注释为周质β-葡萄糖苷酶。该酶与已充分表征的大肠杆菌β-葡萄糖苷酶BglX具有较高的氨基酸序列一致性（61%）（Yang et al., 1996）。每个基因均克隆至pSEVA238质粒的诱导型XylS/Pm启动子下游。研究者测试了基因表达对EM42活力的影响，以及无细胞提取物（CFE）中可溶性蛋白产量和酶活性。三种酶均在LB培养基中生长的P. putida底盘的可溶部分中产生（图S1A），但仅Ccel_2454和BglC表现出可测量的β-葡萄糖苷酶活性。含内源BglX的CFE中未检测到活性，且BglX的过表达对宿主有明显的毒性效应（图S2）。从P. putida菌株克隆的bglX基因序列与Pseudomonas Genome Database中现有序列一致。已有更多研究探讨P. putida KT2440的纤维素分解活性（Tozakidis et al., 2016），但据研究者所知，目前尚无工作证明该菌株中BglX的β-葡萄糖苷酶活性。因此很可能该基因在很久以前细菌不再受益于该酶时获得了功能丧失突变（Hottes et al., 2013），此类突变现已传播至全球实验室使用的KT2440菌株及其衍生菌中。Ccel_2454的活性（CFE中0.03 ± 0.01 U/mg总蛋白，以比色底物对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷在37°C、pH 7.0条件下测定）有限。相比之下，表达bglC基因的P. putida EM42的CFE表现出高活性（4.57 ± 0.50 U/mg）。培养上清液中也检测到微量BglC活性（2.76 ± 0.24 U/L），表明少量过表达酶可在生长期间通过未知机制逸出细胞，或部分酶在死细胞裂解后释放至培养基中。含His标签BglC的CFE样品及培养上清液样品的Western blot分析（图S1B）仍证实绝大多数蛋白在胞内表达。经0.2 mM 3-甲基苯甲酸（3MB）诱导后，强烈的BglC表达和活性使宿主菌株能够在含5 g/L纤维二糖作为唯一碳源的极限培养基中生长。在此初步摇瓶实验中，48小时时的OD₆₀₀为3.6（图S3）。
bglC基因随后被亚克隆至含组成型启动子pEM7的低拷贝质粒pSEVA2213中，该启动子在P. putida和大肠杆菌中均能良好工作（Zobel et al., 2015）。携带pSEVA2213_bglC构建体的P. putida EM42在含5 g/L纤维二糖的极限培养基中快速生长，仅约2小时适应期，比生长速率为0.35 ± 0.02 h⁻¹（图2B，原文表2）。底物消耗速率和生物量产量参数分别比在含葡萄糖的极限培养基中培养的P. putida EM42 pSEVA2213低约40%和20%（原文表2）。由于所有二糖在培养24小时内被完全消耗，该P. putida菌株优于最佳工程大肠杆菌菌株CP12CHBASC30——后者在可比条件下32小时后仅利用3.3 g/L纤维二糖（Vinuselvi and Lee, 2011）。用pSEVA2213_bglC转化的大肠杆菌Dh5α在相同条件下培养未观察到生长（图S4），尽管这些细胞中检测到相对较高的β-葡萄糖苷酶活性（1.51 ± 0.12 U/mg）。这一结果突显了所选BglC纤维素酶与P. putida宿主之间的优良匹配性。
【数据】Ccel_2454活性：0.03 ± 0.01 U/mg总蛋白（CFE）；BglC活性：4.57 ± 0.50 U/mg（CFE）；上清液BglC活性：2.76 ± 0.24 U/L；诱导剂：0.2 mM 3MB；OD₆₀₀（48 h）：3.6；适应期：约2 h；比生长速率：0.35 ± 0.02 h⁻¹；底物消耗速率：比葡萄糖对照低约40%；生物量产量：比葡萄糖对照低约20%；纤维二糖消耗：24 h内完全消耗；大肠杆菌Dh5α中BglC活性：1.51 ± 0.12 U/mg
3.2 P. putida EM42中纤维二糖的转运
为解析P. putida中纤维二糖（一种葡萄糖二聚体）的转运途径，研究者首先聚焦于已充分描述的单体葡萄糖的摄入（del Castillo et al., 2007）。P. putida KT2440中存在两条葡萄糖摄取途径。第一条途径包括葡萄糖分子通过ATP依赖性ABC转运体（由gtsABCD操纵子（PP_1015-PP_1018）编码）从周质直接转运至细胞质，随后己糖被葡萄糖激酶磷酸化为葡萄糖-6-磷酸（del Castillo et al., 2007）。第二条是周质途径，由膜结合的PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶Gcd（PP_1444）组成。该酶将D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸-1,5-内酯，后者自发或在葡萄糖酸内酯酶Gnl（PP_1170）作用下水解为D-葡萄糖酸。葡萄糖酸可进一步被周质葡萄糖酸脱氢酶（Gad）氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。葡萄糖酸和2-酮基葡萄糖酸均可穿过外膜或被输入细胞质，氧化途径在6-磷酸-D-葡萄糖酸水平与直接磷酸化途径汇合（del Castillo et al., 2007）。纤维二糖及其他不同长度纤维糊精通过ABC型转运体的摄取在纤维素分解细菌中很常见，因为这些系统具有相对广泛的底物特异性（Nataf et al., 2009; Parisutham et al., 2017）。为测试该机制与EM42菌株纤维二糖摄取的相关性，研究者删除了编码ABC葡萄糖转运体的gtsABCD操纵子。该突变体经pSEVA2213_bglC质粒转化后仍能在纤维二糖上生长，但表现出显著延长的适应期（约7小时）（图2C），且与P. putida EM42 pSEVA2213_bglC相比，三个测定的生长参数均降低（原文表2）。因此推测葡萄糖ABC转运体在纤维二糖摄取中发挥作用，但并非P. putida中该二糖的唯一进入途径。通过删除P. putida EM42中的葡萄糖脱氢酶基因gcd来关闭第二条葡萄糖摄取途径，对纤维二糖上的生长没有显著影响，但略微延长了迟滞期（约3小时；图2D）。然而，生长最初12小时内的底物消耗显著减少（原文表2）。这表明Gcd也可能参与纤维二糖摄取，而底物消耗减少可能源于ABC转运体组分（EM42 Δgcd突变体中纤维二糖的剩余转运途径）的初始表达较慢——该转运体通常由单体葡萄糖诱导（del Castillo et al., 2007）。值得注意的是，编码三种碳水化合物选择性孔蛋白中两种（oprB-1和oprB-2，分别邻近gtsABCD和gcd）的基因及其调控序列均未受无痕缺失的影响。当直接磷酸化和氧化途径中的缺失组合时，二糖上的生长被完全消除（图2E，原文表2）。这似乎证实了葡萄糖摄取途径对P. putida EM42中纤维二糖代谢的重要性。尽管如此，目前可获得的数据尚不……
（结果部分后续内容原文未完整提供，包括木糖代谢模块工程化、XylE定位分析及混合糖共利用等内容，原文此处截断。）
【数据】gtsABCD缺失后适应期：约7 h；gcd缺失后迟滞期：约3 h；底物消耗减少时段：初始12 h
3.3 木糖代谢模块的工程化
（原文此节内容在提供文本中未完整呈现，包括P. putida EM42在木糖上的生长测试、xylAB/xylABE模块的表达验证及Δgcd突变对木糖氧化的影响等实验数据。）
【数据】原文未详述
3.4 XylE-GFP融合蛋白的膜定位
（原文此节内容在提供文本中未完整呈现，包括XylE-GFP翻译融合构建、荧光显微镜观察及膜定位验证等实验。）
【数据】原文未详述
3.5 P. putida重组菌株对D-木糖与D-葡萄糖或D-纤维二糖的共利用
（原文此节内容在提供文本中未完整呈现，包括混合糖培养实验、糖消耗曲线分析及共利用效率评估等。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究在P. putida EM42中实现了纤维二糖与木糖代谢模块的功能整合。表达胞内β-葡萄糖苷酶BglC的重组菌在极限培养基中24小时内利用5 g/L纤维二糖，性能超越迄今构建的最佳纤维二糖利用大肠杆菌菌株。这一结果凸显了选择与目标宿主高度兼容的纤维素酶的重要性。研究证明P. putida利用其天然转运途径完成纤维二糖摄取，无需植入异源转运蛋白——这使P. putida KT2440及其衍生菌与解纤维素梭菌、产酸克雷伯菌、粗糙脉孢菌及链霉菌属等具备纤维糊精转运系统的微生物并列。虽然葡萄糖ABC转运体在纤维二糖摄取中的功能清晰且得到文献类似案例支持，Gcd和外周氧化途径的作用则较难解释。研究者推测Gcd可能具有纤维二糖脱氢酶活性（EC 1.1.99.18），可将纤维二糖转化为纤维二糖酸内酯——但此推测需进一步酶学验证。
在木糖利用方面，敲除gcd基因消除了木糖向木糖酸（代谢死端产物）的氧化，异源表达XylE转运蛋白和XylA/XylB酶后实现了木糖代谢。最终菌株能以木糖与葡萄糖或纤维二糖的混合底物同步生长至完全耗竭。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究的方法论亮点在于"最小化异源元件植入"策略——纤维二糖的跨膜运输完全依赖宿主内源转运系统，仅需敲入一个胞内水解酶即解锁了二糖利用能力。这种"少即是多"的模块化设计降低了宿主负担，也避免了异源转运蛋白表达不当引发的膜毒性问题。木糖模块中通过敲除gcd规避副反应而非额外引入氧化还原酶的思路同样简洁高效。局限在于，纤维二糖转运依赖葡萄糖ABC转运体意味着葡萄糖存在时可能存在底物竞争，混合糖浆中三糖同时利用的动态分配仍需系统评估。此外，BglC在培养上清中的微量检出提示细胞裂解或分泌现象，对工业连续生产的酶稳定性可能构成潜在影响。整体而言，该工作为木质纤维素水解物的全糖利用提供了一个元件精简、可即插即用的底盘改造范式。
参考来源
Dvořák P. Refactoring the upper sugar metabolism of Pseudomonas putida for co-utilization of cellobiose, xylose, and glucose. Metabolic Engineering, 2018. DOI: 10.1016/j.ymben.2018.05.019
DOI: 10.1016/j.ymben.2018.05.019