来源：Dynamic flux regulation for high-titer anthranilate production by plasmid-free, conditionally-auxotrophic strains of Pseudomonas putida（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
邻氨基苯甲酸是莽草酸途径的重要中间代谢物，广泛用于染料、香料、塑料和制药工业。传统微生物生产策略依赖营养缺陷型菌株，需在培养基中添加芳香族氨基酸或复合添加剂，推高了生产成本。本研究将Pantoea stewartii的Esa群体感应系统元件重塑于土壤细菌恶臭假单胞菌中，构建了无质粒的条件营养缺陷型菌株，在摇瓶培养72小时后实现3.8 ± 0.3 mM邻氨基苯甲酸产量——较已有报道提高2倍以上。
研究背景
芳香族化合物是一类含有六碳共轭环状结构的大宗化学品，在化工、食品、化妆品、材料和制药工业中应用广泛。目前市售芳香族化合物主要来源于石油基原料（苯、甲苯、二甲苯）或植物次生代谢物。利用丰富的碳源进行微生物芳香族化合物生产，已成为满足市场对可再生、可持续工艺需求的重要替代方案。
邻氨基苯甲酸（邻氨基苯甲酸盐，C₆H₄(NH₂)(CO₂H)）是一种工业相关芳香胺，目前主要来源于石油，预计2024年全球市场达1.2亿欧元。其甲基化衍生物O-甲基邻氨基苯甲酸是天然植物源化合物，作为食品香料和化妆品成分需求旺盛。微生物和植物均天然产生邻氨基苯甲酸，作为色氨酸生物合成的中间体。
传统微生物邻氨基苯甲酸生产策略依赖删除或失活trpD基因造成的营养缺陷型菌株，需要在培养基中补充芳香族氨基酸或化学诱导剂，不仅增加成本，也使工业规模放大困难重重。群体感应系统元件构建的遗传电路可在细胞密度依赖方式下重新平衡代谢，为规避上述问题提供了新途径。
研究方法
2.1 菌株与常规培养条件
本工作使用的所有菌株和质粒列于原文表1。E. coli DH5α常规用于克隆和质粒维持。遗传操作期间，E. coli和P. putida菌株在LB培养基（10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物和5 g L⁻¹ NaCl）中于轨道摇床200 rpm振荡培养，温度分别为37°C和30°C。基因表达、QS电路表征和邻氨基苯甲酸生产实验中，E. coli和P. putida的野生型及工程菌株均在M9基本培养基（Green和Sambrook, 2012）中培养，添加20 mM葡萄糖作为唯一碳源（MaxQ™ 8000培养箱；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA），并根据各实验需要添加相应添加剂。对于L-色氨酸营养缺陷型P. putida菌株（即携带ΔtrpDC缺失），M9基本培养基中补充0.1 mM L-色氨酸（Kuepper等，2015）。需要时，抗生素按以下终浓度添加：卡那霉素（Km），50 μg L⁻¹；链霉素（Str），100 μg L⁻¹；庆大霉素（Gm），10 μg L⁻¹。细菌生长通过Genesys 20分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量600 nm光密度（OD₆₀₀）估算。除非另有说明，摇瓶培养在250 mL锥形瓶中进行，含50 mL补充20 mM葡萄糖作为唯一碳源的M9基本培养基。定期取样并在正文中说明。
【数据】培养基：LB（10 g L⁻¹胰蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物、5 g L⁻¹ NaCl）及M9基本培养基；碳源：20 mM葡萄糖；转速：200 rpm；温度：E. coli 37°C / P. putida 30°C；抗生素浓度：Km 50 μg L⁻¹、Str 100 μg L⁻¹、Gm 10 μg L⁻¹；L-Trp补充：0.1 mM；培养体积：50 mL / 250 mL锥形瓶
2.2 DNA操作与测序
DNA操作及其他分子生物学技术基本按照Green和Sambrook（2012）所述方法进行。寡核苷酸、双链DNA片段（gBlocks™）和密码子优化的合成基因购自Integrated DNA Technologies（IDT; Leuven, Belgium），序列见补充数据（原文表S1和S2）。DNA扩增在C1000 Touch™热循环仪（Bio-Rad Corp., Hercules, CA, USA）上进行，使用Thermo Fisher Scientific的Phusion U Hot Start DNA聚合酶或Phusion Hot Start II DNA聚合酶。DNA片段用NucleoSpin™凝胶和PCR纯化试剂盒（Macherey-Nagel, Düren, Germany）纯化。限制性内切酶和T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific，按供应商规格使用。USER组装基本按照Nour-Eldin等（2010）所述方法，使用New England BioLabs（NEB; Ipswich, MA, USA）的USER酶。Gibson组装按照Gibson等（2009）所述方法，使用NEB提供的Gibson Assembly Master Mix。质粒DNA用NucleoSpin™质粒EasyPure试剂盒（Macherey-Nagel）制备纯化。化学感受态E. coli细胞使用Zymo Research（Irvin, CA, USA）的Mix & Go E. coli转化试剂盒制备。单菌落DNA扩增（即菌落PCR）使用OneTaq 2 × Master Mix（NEB）。电感受态P. putida细胞制备方法为：将P. putida过夜培养物（LB培养基中）的生物量用过滤灭菌的300 mM蔗糖溶液洗涤两次（Choi等，2006）。所有克隆插入片段和DNA片段均通过Sanger DNA测序确认（Eurofins Genomics, Ebersberg, Germany）。P. putida缺失和插入突变体（原文表1）通过可治愈质粒辅助的无抗生素等位基因交换方法获得，如前所述（Volke等，2020b; Wirth等，2020）。其他分子生物学技术按已有文献执行（Kozaeva等，2021; Nikel等，2008, 2009; Ruiz等，2006）。质粒构建程序和DNA操作技术的详细描述见补充数据。
【数据】感受态制备：300 mM蔗糖溶液洗涤两次；PCR聚合酶：Phusion U Hot Start / Phusion Hot Start II；组装方法：USER组装（NEB USER酶）、Gibson组装（NEB Gibson Assembly Master Mix）；测序：Sanger测序；突变体构建：无抗生素等位基因交换
2.3 96孔微量滴定板细菌生长谱分析与荧光测定
合成QS电路校准和表征的标准生长实验中，细菌细胞在96孔微量滴定板（平底，Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany）中培养，使用含20 mM葡萄糖作为唯一碳源的M9基本培养基。培养营养缺陷型菌株（即携带ΔtrpDC缺失）时，按正文说明补充0.1 mM L-色氨酸。生长动力学通过Synergy™ MX微量滴定板读数器（BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA）每5分钟测量OD₆₀₀（带光程校正）跟踪。荧光实验中，细胞在96孔黑底/透明底微量滴定板中培养。细菌生长（以OD₆₀₀估算）和GFP荧光（λ激发/λ发射 = 485 nm/516 nm）均每5分钟连续测量。荧光读数（任意单位，A.U.）以细菌生长归一化（A.U. OD₆₀₀⁻¹）。
【数据】培养板：96孔微量滴定板（平底/黑底透明底）；测量间隔：5 min；GFP荧光波长：485 nm/516 nm；归一化方式：A.U. OD₆₀₀⁻¹；M9培养基葡萄糖：20 mM；L-Trp补充：0.1 mM
2.4 定量PCR（qPCR）分析与蛋白质组学分析
细菌菌株在摇瓶中培养至指数中期（即培养物OD₆₀₀达到约0.4–0.6），取样后洗涤生物量并重悬于磷酸盐缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄和2 mM KH₂PO₄，pH = 7.4）中，使每样品含1 × 10³个细胞（E. coli或P. putida），细胞悬液随后储存于−20°C。qPCR扩增在96孔光学反应板中使用QuantStudio™ 5 Dx实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific）进行，条件如下：50°C 2分钟，95°C 10分钟；随后40个循环的95°C 15秒、60°C 1分钟和72°C 30秒，使用补充数据表S1中列出的寡核苷酸。qPCR结果用内置QuantStudio™设计和分析软件分析。每个独立实验均包含无模板对照（即引物混合物），每个样品设三个技术重复。数据采用2^−ΔΔCt方法评估（Livak和Schmittgen, 2001），应用比较Ct方法通过分析实验ΔΔCt值计算基因拷贝数（Rao等，2013）。反应特异性和扩增子身份通过熔解曲线分析验证。基因表达水平以rpoB基因（编码RNA聚合酶β亚基，在E. coli和P. putida中高度保守）归一化（Follonier等，2013）。转录水平倍性变化及相关标准误差按Livak和Schmittgen（2001）所述方法获得。质粒拷贝数（PCN）由编码抗生素抗性决定因子的基因表达水平推导（Jahn等，2016; Lee等，2006）。空载体pSEVA221和pSEVA631作为参考；这些质粒使用NucleoSpin™质粒EasyPure试剂盒（Macherey-Nagel）按制造商说明纯化，稀释至1–5 ng μL⁻¹构建校准曲线（Lee等，2006）。PCN按每个样品重复中质粒抗生素抗性标记浓度（[pDNA]，即Gm抗性的aac或Km抗性的neo）与基因组编码的管家标记浓度（[gDNA]，即rpoB）的比值（即[pDNA]/[gDNA]）计算，方法依据Jahn等（2016）所述。蛋白质组学分析用于定量部分工程菌株50 mL摇瓶培养物样品中选定蛋白的相对水平。取样时间点与qPCR分析相同（早期和晚期指数生长期分别为5小时和10小时），每个培养物取1 mL等分试样，10,000×g离心10分钟，液氮速冻。沉淀储存于−80°C，直至按Bongers等（2020）的方法处理。
【数据】qPCR条件：50°C 2 min、95°C 10 min、40循环（95°C 15 s、60°C 1 min、72°C 30 s）；取样OD₆₀₀：0.4–0.6；PBS缓冲液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na₂HPO₄、2 mM KH₂PO₄，pH 7.4；细胞数：1 × 10³ cells/样品；蛋白质组学取样时间：5 h和10 h；离心：10,000×g 10 min
研究结果
3.1 用于革兰氏阴性菌基因表达动态调控的群体感应电路设计
天然QS系统控制细菌中多种细胞密度依赖过程。QS系统元件已被重新用于动态调控重组蛋白生产、细胞群体平衡和细菌裂解（Balagaddé等，2008; Ge等，2020; Saeidi等，2011; Tsao等，2010）。来自P. stewartii的Esa QS系统（Beck von Bodman和Farrand, 1995; von Bodman等，2003）已被用于介导靶基因的转录激活和抑制（Dinh等，2020; Dinh和Prather, 2019; Gu等，2020; Gupta等，2017; Shen等，2019b; Shong和Collins, 2013; Wu等，2020b）。Esa QS系统由三个主要组分构成：（i）EsaI，即N-(3-氧代己酰)-L-高丝氨酸内酯合酶，负责合成信号分子（即AHL）；（ii）EsaR，识别并结合AHL的转录调控因子，从而与多个QS响应启动子（包括P_esaS或P_esaR）内的esa box序列相互作用，控制靶基因的表达（图2A）。在缺乏AHL时（或信号分子浓度极低时，即低细胞密度下），转录调控因子EsaR结合P_esaS或P_esaR启动子，分别激活或抑制置于这些启动子控制下的基因转录（Dinh和Prather, 2019; Shong和Collins, 2013）。AHL积累超过阈值浓度（在天然背景下即细菌细胞密度升高时）介导EsaR调控因子从QS响应启动子上释放，导致P_esaS启动子随后失活或P_esaR启动子激活（图2A）。因此，可采纳单个Esa QS组件构建合成遗传电路，响应培养细胞密度变化控制靶基因的转录抑制或过表达。
为了在革兰氏阴性菌中实现基于Esa QS的遗传电路，我们首先严格遵循SEVA（Standard European Vector Architecture）规则（Silva-Rocha等，2013）构建了两个广宿主范围质粒家族。这些用于合成QS调控的质粒被命名为pSensor和pResponse（图2B和原文表1）。pSensor质粒预期检测并转导细菌细胞密度的变化，而pResponse质粒应通过改变克隆在P_esaS或P_esaR启动子转录控制下的靶基因表达来响应这些环境线索。pSensor质粒pSensor1-3通过USER组装构建，详见补充数据。这些标准载体含有由组成型启动子（不同强度：P_lac、P_EM7和P_14f；图2B和补充数据表S2）控制下的密码子优化版esaI和esaRI70V组成的合成操纵子。突变体EsaRI70V变体在QS电路中常用作转录调控因子，因为它响应比野生型EsaR蛋白更高的AHL阈值浓度（Shong等，2013）——从而增大系统的动态范围。pResponse质粒pResponse2和4分别携带P_esaR或P_esaS启动子控制下的荧光报告基因[即gfp或gfp(LVA)]（图2B）。遗传gfp(LVA)变体编码的荧光GFPmut3蛋白在E. coli和P. putida中的半衰期较野生型GFPmut3蛋白缩短（Andersen等，1998）。质粒pResponse1和3用于对照实验，它们携带相同的荧光报告基因，但受P_lacIq启动子转录控制，该启动子在P. putida中组成型活性（图2B）。注意pSensor和pResponse质粒系列均携带相容的复制起点[即oriV(RK2)和oriV(pBBR1)]和抗生素抗性标记[即Kmᴿ和Gmᴿ]，便于按需测试不同的质粒配置。有了这套QS工具箱，我们开始测试Esa QS系统在两种革兰氏阴性菌宿主中的输出，详见下节。
【数据】QS组件：EsaI（AHL合酶）、EsaR（转录调控因子，含I70V突变变体）、P_esaS/P_esaR启动子；质粒骨架：SEVA标准（pSensor/pResponse系列）；复制起点：oriV(RK2)和oriV(pBBR1)；抗性标记：Kmᴿ和Gmᴿ；启动子：P_lac、P_EM7、P_14f（组成型，不同强度）、P_lacIq（P. putida中组成型活性）
3.2 pSensor和pResponse质粒在E. coli和P. putida中的表征
为研究合成Esa QS系统在革兰氏阴性菌中动态调控靶基因的应用，构建了一套E. coli DH5α和P. putida KT2440重组菌株（图3A）。R组菌株同时携带质粒pResponse2（含P_esaR→gfp）和pSensor质粒1至3。根据Esa QS系统在天然背景中的转录调控机制，这些元件应介导荧光输出随培养物细胞密度升高而增加（即抑制→激活）。R0菌株（E. coli或P. putida）携带空pSEVA221载体和质粒pResponse2，因缺乏Esa QS系统的传感组件而用作对照实验。类似地，S组工程菌株同时携带质粒pResponse4[含P_esaS→gfp(LVA)]和pSensor质粒1至3。此配置下，Esa QS装置预期介导随细胞密度增加而发生的激活→抑制转变。注意在此情况下我们采用了源自gfpmut3的不稳定GFP(LVA)变体（Andersen等，1998）。野生型GFP在其成熟荧光形式中是非常稳定的蛋白质，其突变体GFPmut3衍生物在488 nm激发时荧光强度比野生型GFP高约20倍（Tombolini等，1997），可实现与其他荧光团的高效光谱分离。然而我们认为GFP的极高稳定性可能妨碍监测Esa QS系统带来的动态变化。因此，在涉及P_esaS启动子的实验中采用了短寿命、不稳定的GFP(LVA)变体，该变体携带短的C端氨基酸延伸（RPAANDENYALVA）。RPAANDENYALVA肽标签使原本稳定的蛋白质易被细胞内尾部特异性蛋白酶降解，导致成熟GFP(LVA)的体内半衰期约40分钟（Andersen等，1998）。合成SsrA降解标签的添加先前已在P. putida中作为代谢工程策略用于利用天然蛋白水解机制调节蛋白质水平（Volke等，2020c）。同样构建了一套E. coli和P. putida菌株用于对照实验。此情况下，S0菌株同时携带空pSEVA221载体和质粒pResponse4，即缺乏Esa QS系统的传感组件。空载体与pSensor/pResponse质粒的其他组合列于图3A，携带这些质粒的E. coli和P. putida菌株同样用于对照实验。
接下来，我们在96孔微量滴定板中培养重组细菌细胞，每5分钟连续测量OD₆₀₀值和GFP荧光，持续20小时，覆盖E. coli和P. putida直至稳定期的完整生长曲线。为避免复合培养基对荧光测量的干扰，所有重组菌株均在含20 mM葡萄糖作为唯一碳源的M9基本培养基中培养。为评估合成Esa QS系统的整体行为，我们计算了各培养物整个生长曲线中归一化荧光最大值（即GFP荧光OD₆₀₀⁻¹）（图3B）。同时，分别绘制E. coli和P. putida重组菌株的GFP荧光随时间变化谱，以评估动态变化特征。
【数据】培养时间：20 h；测量间隔：5 min；培养基：M9基本培养基 + 20 mM葡萄糖；GFP(LVA)半衰期：约40 min（体内）；GFPmut3荧光强度：约为野生型GFP的20倍（488 nm激发）；归一化荧光：GFP OD₆₀₀⁻¹
讨论与解读
微生物邻氨基苯甲酸生产有潜力替代当前依赖不可再生石油衍生物的化学合成工艺。邻氨基苯甲酸对大多数微生物具有毒性，选择对芳香族化合物耐受性高的宿主是满足工业生产和成本双重挑战的关键。P. putida对多种化学品表现出高耐受性，已被证明是多种芳香族化合物生物合成的有前景的平台菌株（Kuepper等，2015, 2020; Nikel等，2016; Schwanemann等，2020）。此前细菌细胞工厂邻氨基苯甲酸生物生产策略需要删除或失活trpD，这天然导致L-色氨酸营养缺陷（Balderas-Hernández等，2009; Sun等，2013）。大量遗传操作——加上氨基酸补充——对优化芳香族化合物生产必不可少。在发酵培养基中补充化学诱导剂和芳香族氨基酸增加了生产成本，使这些生物工艺的工业规模实施尤为困难。基于QS元件构建的遗传电路可帮助规避这些问题，因为这些装置能够以细胞密度依赖方式在发酵过程中重新平衡代谢（Cui等，2019; Long等，2020; Yang等，2021）。本研究代表了在P. putida中实施合成QS电路用于代谢工程目的的首次案例。
【编译者解读】
本研究巧妙地将群体感应系统的"密度感知"特性转化为代谢通量的动态开关——无需外源诱导剂即可实现从生长到生产的自动切换。相比传统组成型敲除策略，这种条件营养缺陷设计兼顾了生物量积累与产物合成两个阶段的不同需求。3.8 mM的产量虽在绝对数值上仍有提升空间，但2倍以上的增幅证明了动态调控策略在莽草酸这类严格调控途径中的有效性。值得注意的是，无质粒设计规避了抗生素维持压力，更贴近工业应用场景。后续若能将QS响应阈值与产物毒性耐受协同优化，有望进一步释放该平台菌株的生产潜力。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2022
DOI: 10.1016/j.ymben.2022.05.008
DOI: 10.1016/j.ymben.2022.05.008