构建假单胞菌KT2440中香豆酸/阿魏酸自动调控系统

📅 2026-09-03 📰 Bioresource Technology 2022-01-31 📂 研究进展 👁 15

来源：Construction of a p-coumaric and ferulic acid auto-regulatory system in Pseudomonas putida KT2440 for protocatechuate production from lignin-derived aromatics（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

木质素是地球上储量丰富但长期未被充分利用的芳香族杂聚物。本研究在恶臭假单胞菌KT2440中开发了响应对香豆酸（p-CA）的生物传感器，并进一步构建了自动调控系统——在生物传感器元件控制下共表达4-羟基苯甲酸羟化酶（PobA）、香草酸O-脱甲基酶（VanAB）和转运蛋白HcnK，将p-CA与阿魏酸（FA）混合物高效转化为高价值平台化合物原儿茶酸（PCA），产量达12.7 g/L。该系统无需外加诱导剂，为木质素增值利用提供了经济有效的解决方案。

研究背景

石油资源短缺、全球人口增长与温室气体排放加剧，使木质纤维素作为地球上最大体量的可再生原料备受关注。木质素占天然木质纤维素15%-40%，被认为是最有前景的可持续芳香族聚合物。然而，现有物理化学方法存在环境污染、操作繁琐、反应条件苛刻和能耗高等缺陷。基于工程微生物的生物法凭借优异特异性和经济性，成为木质素增值利用的理想手段。近年来，合成生物学已成功利用木质素衍生单体或预处理木质素生产苯乙烯、粘康酸、香草醛、尼龙、琥珀酸等多种高值化学品。然而，低生物转化率、高工艺成本、低产量和底物高毒性仍制约其应用。本研究旨在通过构建自动调控系统破解上述瓶颈。

研究方法

2.1 菌株、质粒与化学试剂

大肠杆菌DH5α用作克隆宿主。野生型恶臭假单胞菌KT2440用于木质素单体利用。卡那霉素、p-CA、FA、PCA、4-HBA、肉桂酸、没食子酸、香草酸和原儿茶醛均购自北京索莱宝科技有限公司。所有构建的质粒和菌株见表1。

【数据】菌株：E. coli DH5α、P. putida KT2440；试剂来源：Solarbio Technology Co. (Beijing, China)

2.2 DNA操作

padR序列经密码子优化后由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。mCherry、Prpsh、PrpsJ16、Pem72和PpadC通过PCR扩增获得。PCR产物片段通过重叠延伸PCR融合。p-CA生物传感器最终序列构建至低拷贝RK2载体EcoRⅠ和HindIII酶切位点。PadR点突变按照北京全式金生物技术有限公司定点突变试剂盒说明书进行。工程质粒按照天根生化科技（北京）有限公司质粒提取试剂盒说明书提取。所得重组载体按Li和Ye（2021）报道的方法电转化至P. putida KT2440。为获得fcs敲除的P. putida KT2440突变株，按照Johnson和Beckham（2015）报道的方法进行双交换同源重组。所有DNA操作经Sanger测序和菌落PCR确认。

【数据】载体：低拷贝RK2载体；酶切位点：EcoRⅠ/HindIII；方法：电转化、双交换同源重组

2.3 培养条件

所有p-CA生物传感器菌株和大肠杆菌DH5α均在LB培养基中培养。为测试p-CA生物传感器性能，挑取含正确质粒的生物传感器单菌落，接种于0.8 mL含卡那霉素（50 mg/L）的新鲜无菌LB培养基中，30°C、220 rpm过夜培养。随后将培养物接种至含0.8 mL LB（含特定卡那霉素和诱导剂浓度）的24孔板中。冷冻保藏菌株在LB琼脂培养基上活化，然后接种于种子培养基中，220 rpm、30°C过夜培养。培养物随后接种于摇瓶发酵培养基中，250 rpm、30°C培养。初始接种量设为OD600=0.05。种子培养基组成：5 g/L葡萄糖、3 g/L K2HPO4、2 g/L NH4Cl、5 g/L酵母提取物、6 g/L Na2HPO4，pH 7.0。摇瓶发酵培养基含10.0 mM葡萄糖、6.0 g/L K2HPO4、2 g/L NH4Cl、5 g/L酵母提取物、13.56 g/L Na2HPO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O和1 mL/L微量元素溶液，pH 7.0。接种后每12小时向摇瓶补加10.0 mM葡萄糖。在发酵4小时时加入p-CA（20 mM）或FA（20 mM）诱导生物转化。补料分批培养基含6.0 g/L葡萄糖、6.0 g/L K2HPO4、2.25 g/L (NH4)2SO4、25.0 g/L酵母提取物、13.56 g/L Na2HPO4、1.0 g/L NaCl和1 mL/L微量元素溶液。补料溶液含4.5 g/L葡萄糖、19.4 g/L FA、65.6 g/L p-CA和5.0 g/L酵母提取物。p-CA初始补料速率设为4.0 mM/h。通过自动添加氨水（25%，w/w）和磷酸溶液（10%，w/w）维持发酵液pH为7.0。通过控制搅拌速度（350–1000 rpm）使发酵液溶解氧维持在30%。通气速率和温度分别保持在2 vvm和30°C。

【数据】培养基：LB、种子培养基、摇瓶发酵培养基、补料分批培养基；卡那霉素浓度：50 mg/L；温度：30°C；转速：220/250 rpm；pH：7.0；接种OD600：0.05；p-CA/FA添加浓度：20 mM；补料葡萄糖：10.0 mM/12h；p-CA补料速率：4.0 mM/h；氨水浓度：25% (w/w)；磷酸浓度：10% (w/w)；溶解氧：30%；搅拌速度：350–1000 rpm；通气速率：2 vvm

2.4 实时定量PCR分析

目标基因的相对mRNA水平按照本课题组先前报道的方法（Li和Ye, 2021）计算。

【数据】方法参照：Li and Ye, 2021（原文未详述具体参数）

2.5 分析方法

为表征工程生物传感器性能，使用酶标仪（BioTek，美国）测定OD600和荧光值。简要流程：0.5 mL培养物在4°C冷冻离心机（Eppendorf，德国）中以10,000 g离心5分钟。弃上清后，将沉淀轻轻悬浮于0.5 mL去离子蒸馏水中。最后，取0.2 mL所得悬浮液分别加入白色和黑色96孔板中，用于OD600（600 nm吸光度）和mCherry荧光（激发波长580 nm，发射波长610 nm）检测。荧光成像按照本课题组先前报道的方法进行。发酵液中PCA、4-HBA、p-CA、FA和香草酸浓度通过高效液相色谱（岛津，日本）分析，配备Diamonsil Plus 5 μm C18色谱柱（250 × 4.6 mm）。流动相为含0.1%甲酸的30%甲醇（v/v）。检测波长和温度分别为254 nm和30°C。

【数据】离心：10,000 g，5 min，4°C；激发波长：580 nm；发射波长：610 nm；色谱柱：Diamonsil Plus 5 μm C18 (250 × 4.6 mm)；流动相：30%甲醇+0.1%甲酸；检测波长：254 nm；温度：30°C

2.6 统计分析

所有实验均设三次重复。误差线代表标准差。

【数据】重复次数：3；误差线：标准差

研究结果

3.1 p-CA生物传感器的设计与构建

p-CA是碱性处理木质素产生的主要木质素衍生芳香族单体，对微生物具有高毒性，难以在木质素增值中利用。为克服这些缺点，p-CA被选作自动调控系统的诱导剂。为开发自动调控系统，选择调控机制明确的PadR（UniProt E0TW95）构建生物传感器元件。如图2A所示，在枯草芽孢杆菌168中，负调控因子可能结合PpadC启动子的dIR1-2bis/IR1-2共有回文序列，抑制其转录起始。同时，添加外源p-CA后，PadR与PpadC启动子解离，抑制被解除。

▲ Design and construction of p-CA biosensor system. (A) The operon structure of padR and coding sequence of promoter PpadC in wild type B. subtilis 168. The –10 and –35 boxes were marked in red. The IR1-2 and dIR1-2bis boxes were consensus dyad sequence in promoter PpadC for PadR dimer binding. (B) Co

p-CA生物传感器按图2B所示设计和构建。简言之，yveFG和padC天然启动子序列（定义为PpadC）经化学合成用于启动红色荧光蛋白mCherry的转录。同时，选择三个近期报道的组成型启动子Pem72、Prpsh和PrpsJ16控制密码子优化的p-CA调控因子PadR，分别构建质粒LRK-Pem72-padR、LRK-Prpsh-padR和LRK-PrpsJ16-padR。电转化至P. putida KT2440后，获得菌株KT01、KT02和KT03。如图2C所示，KT02对外源p-CA表现出明显响应，动态范围为16.7倍，不同于KT01和KT03菌株。然而，p-CA诱导后荧光强度相对较低。结果证明，调控蛋白PadR可被外源p-CA诱导，成功激活KT02细胞中mCherry靶基因的表达。

▲ 用于木质素增值生产高附加值平台产品的木质素水解芳香底物自调控系统开发。vanABopt编码香草酸-O-脱甲基酶（VanAB）；pobA编码4-羟基苯甲酸羟化酶（PobA）；hcnK编码对香豆酸/阿魏酸转运蛋白HcnK；关键限速步骤——

研究者推测，P. putida KT2440中p-CA的胞内浓度较低——p-CA被木质素生物转化的完全代谢和分解途径所催化分解——导致响应较弱。如图2D所示，p-CA首先在Fcs和4-羟基肉桂酰辅酶/裂解酶催化下转化为4-羟基苯甲醛，然后通过一系列生化反应进入TCA循环。为阻断p-CA代谢，通过同源重组从基因组中敲除fcs基因（PP_3356），获得菌株KTΔfcs。将质粒LRK-Pem72-padR、LRK-Prpsh-padR和LRK-PrpsJ16-padR分别电转化至KTΔfcs菌株，获得KT04、KT05和KT06菌株。KT05生物传感器菌株在p-CA诱导下mCherry荧光强度变化达29.2倍，高于其他菌株（KT04和KT06）（图2E）。结果表明，敲除fcs可显著阻断p-CA分解代谢，进一步提高红色荧光蛋白mCherry的表达。同时，也表明细胞内PadR浓度可显著影响p-CA生物传感器的性能。因此，在构建生物传感器元件时，建议使用不同表达强度的校准启动子优化调控因子的转录水平。

【数据】动态范围：KT02为16.7倍，KT05为29.2倍；基因：fcs (PP_3356)；菌株：KT01–KT06

3.2 P. putida KT2440中p-CA生物传感器的改进

上述结果表明p-CA生物传感器已成功构建并在P. putida KT2440中发挥功能。然而，为增强荧光强度和扩大动态范围以适应生物工业应用，p-CA生物传感器系统需要进一步优化。为此，以逐步方式开发了六个杂合生物传感器菌株。σ因子识别的−35和−10盒序列以及−35区域上游的UP元件对启动子强度至关重要。为优化性能，将PpadC的−10区序列替换为TATAGT，构建并表征了KT07。如图3A-B所示，与对照相比，KT07的p-CA诱导倍数增加了81.2%。随后，在−35盒上游区域插入更强的UP元件获得KT08。与KT07相比，工程菌株的荧光强度增加了2.1倍（图3B）。

▲ Improvement and characterization of the p-CA biosensor strains. (A) The sequences of engineered biosensors. The − 10 and − 35 boxes were shown in green and blue. The red UP represents up sequences of promoter PpadC. The repressor PadR was marked with gray background. (B) The fluorescence intensity o

生物传感器系统中转录因子与启动子操纵基因之间的结合亲和力影响响应动态范围。Yoon等人分析了PadR结合位点，确定K64和S39为关键氨基酸残基。为进一步增强红色荧光输出强度，将K64和S39分别点突变为丙氨酸，获得生物传感器菌株KT09和KT10。如图3B所示，与KT08相比，两个工程菌株的荧光输出分别进一步增强了22.8%和55.5%，诱导倍数也得到提高。总体而言，KT10生物传感器元件在外源p-CA诱导时表现出最高的荧光表达水平。然而，在不含p-CA的培养基中观察到高渗漏噪声。在启动子中放置额外转录因子结合位点的方法已被证明可有效降低砷响应生物传感器的渗漏。为降低背景表达，在PpadC启动子的−10和−35区之间插入PadR结合盒，生成生物传感器菌株KT11和KT12，其动态范围分别增至134.6倍和121.1倍（图3B）。综上所述，开发了一系列p-CA响应生物传感器元件，其中KT10具有最高荧光输出，可用于诱导和过表达产物生物合成的限速酶以增强代谢通量；而KT11具有最高动态范围，可能适用于p-CA有毒中间体衍生产物生物合成途径的动态调控。

【数据】KT07诱导倍数增加：81.2%；KT08荧光强度增加：2.1倍；KT09荧光增强：22.8%；KT10荧光增强：55.5%；KT11动态范围：134.6倍；KT12动态范围：121.1倍；突变位点：K64A、S39A

3.3 P. putida KT2440中p-CA生物传感器的表征

为评估工程生物传感器的底物特异性，向KT10培养物中添加结构相似的木质素衍生分子，如FA、PCA、肉桂酸、没食子酸和原儿茶醛。如图3C所示，KT10荧光蛋白mCherry在FA存在下也被激活。结果表明FA也能诱导KT10菌株中的生物传感器表达。野生型和两个突变体的剂量-响应曲线也表明KT10具有更高的诱导强度（图3D）。优化后的生物传感器菌株也观察到显著更高的荧光强度（图S1-S2）。因此，KT10中的生物传感器元件可被p-CA和FA（木质素水解液中的主要成分）诱导，被选用于开发P. putida KT2440木质素增值自动调控系统。

【数据】底物：p-CA、FA、PCA、肉桂酸、没食子酸、原儿茶醛；KT10可被p-CA和FA诱导

3.4 基于自动调控系统从木质素衍生单体p-CA和FA生产PCA

作为木质素衍生单体响应型生物传感器，该元件具有感知底物并智能开启关键基因过表达以增强木质素增值代谢通量的潜力。为构建将p-CA生物转化为PCA的自动调控系统，将pobA（PP_3537）和hcnk（PP_3349）基因——分别编码p-CA利用途径中的限速酶4-羟基苯甲酸羟化酶和芳香酸转运蛋白——置于KT14菌株中的生物传感器元件控制下（图4A）。如图4B所示，发酵12小时后KT14培养物中产生了大量PCA。同时，几乎未检测到4-HBA中间产物积累。

▲ PCA production under the auto-regulatory system from lignin-relevant standard model aromatic p-CA. (A) Schematic of the auto-regulatory system for the biotransformation of p-CA into PCA through coexpression of pobA and hcnk under the biosensor element in strain KT14. (B) PCA production of strains KT

为构建将FA生物转化为PCA的自动调控系统，将vanABopt（编码香草酸O-脱甲基酶VanAB）和hcnk基因置于KT16菌株中的生物传感器元件控制下（图5A）。如图5B所示，KT16在FA诱导下实现了PCA的高效生产。

▲ PCA production under the auto-regulatory system from lignin-relevant standard model aromatic FA. (A) Schematic of the auto-regulatory system for the biotransformation of FA into PCA through coexpression of vanABopt and hcnk under the biosensor element in strain KT16. (B) PCA production of strains KT

为模拟真实木质素水解液组成，进一步构建了能够同时转化p-CA和FA混合物的自动调控系统。将vanABopt、pobA和hcnk三个基因共同置于生物传感器元件控制下（图6A）。如图6B所示，该菌株以p-CA和FA混合物为底物时，PCA产量达到12.7 g/L。

▲ PCA production under the auto-regulatory system from a mix of model lignin monomers p-CA and FA. (A) Schematic of the auto-regulatory system for the biotransformation of a mixture of p-CA and FA into PCA through coexpression of vanABopt , pobA, and hcnk under the biosensor element. (B) PCA productio

【数据】PCA产量：12.7 g/L（p-CA+FA混合物底物）；基因：pobA (PP_3537)、hcnk (PP_3349)、vanABopt；菌株：KT14、KT16

讨论与解读

本研究成功在P. putida KT2440中设计并开发了功能性p-CA响应生物传感器。通过敲除fcs基因阻断p-CA分解代谢，显著提高了传感器响应灵敏度。通过启动子工程（−10区替换、UP元件插入）和调控蛋白工程（K64A、S39A点突变）逐步优化，最终获得高荧光输出（KT10）和高动态范围（KT11）两类传感器元件。进一步在生物传感器元件控制下共表达限速酶PobA、VanAB和转运蛋白HcnK，构建的自动调控细胞工厂有效将p-CA和FA混合物转化为高价值平台化学品PCA。该系统可提高转化效率、避免添加昂贵的外源诱导剂，为木质素增值利用提供了有前景的范式。此外，该生物传感器元件在p-CA和FA衍生产物生物合成的动态调控中展现出潜在应用价值。

编译者解读：本研究展示了合成生物学中"传感-调控-生产"一体化的经典设计逻辑。亮点在于利用底物自身作为诱导剂实现自动调控，免除外源诱导剂成本，同时通过敲除竞争代谢途径和蛋白工程优化传感器性能，体现了系统性的工程思维。12.7 g/L的PCA产量在木质素增值领域具有竞争力。值得关注的是，该自动调控策略可推广至其他有毒芳香族底物的生物转化——以底物为信号、以限速酶为输出，形成自适应的代谢通量调节回路。局限在于目前仍以标准模型单体混合物为底物，真实木质素水解液的复杂成分对系统稳定性的影响有待验证。

参考来源

Li J. Construction of a p-coumaric and ferulic acid auto-regulatory system in Pseudomonas putida KT2440 for protocatechuate production from lignin-derived aromatics. Bioresource Technology, 2022.

DOI: 10.1016/j.biortech.2021.126221

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