来源：Funneling lignin hydrolysates into β-ketoadipic acid by engineered Pseudomonas putida KT2440（Industrial Crops and Products）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素是自然界中储量丰富的芳香族异质聚合物，其生物转化利用长期受限于底物异质性与代谢途径缺乏。本研究通过阻断β-酮己二酸（β-KA）降解途径、鉴定并强化限速酶PobA与VanAB、组合基因工程改造，成功构建了高效转化木质素衍生芳香族单体的恶臭假单胞菌工程菌株HE65。在摇瓶水平上，该菌株以混合芳香族底物实现了14.80 g/L的β-KA产量纪录；以真实玉米秸秆木质素水解液为底物时，无需分离脱毒即获得2.48 g/L的产量。
研究背景
木质素占陆地植物生物量的15%–45%，是极具潜力的可再生芳香族原料。通过酶法或化学法解聚可获得低分子量芳香族化合物，进而合成多种高附加值产品。然而，木质素的固有顽抗性及其解聚产物的高度异质性，使得传统分离纯化流程成本高昂。以微生物将混合芳香族化合物定向转化为单一产物，是应对上述挑战的可行策略。恶臭假单胞菌KT2440天然具备将多种木质素衍生芳香族单体汇入β-酮己二酸代谢节点的"生物漏斗"途径。本研究旨在通过系统的代谢工程改造，打通由H型和G型木质素衍生单体到β-KA的高效合成路线。
研究方法
2.1 菌株与培养基配制
本研究所用恶臭假单胞菌菌株与质粒详见表1。细菌在30°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，该培养基含1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和1% NaCl。大肠杆菌用于质粒构建与扩增，在37°C的LB培养基中培养。抗生素添加浓度如下：卡那霉素50 μg/mL，庆大霉素50 μg/mL，四环素25 μg/mL。化学感受态大肠杆菌Top10菌株（擎科生物技术有限公司）用于质粒操作，质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。对香豆酸（p-CA）、阿魏酸（FA）、香草酸（VA）、4-羟基苯甲酸（4-HBA）和原儿茶酸（PCA）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，乙酰丙酸购自Meryer（上海）。抗生素购自Solarbio（北京）。恶臭假单胞菌菌株在M9基本培养基中培养，每升溶液含：6.78 g Na₂HPO₄、3 g K₂HPO₄、0.5 g NaCl、1 g NH₄Cl、0.24 g MgSO₄及1×微量元素。10000×微量元素溶液每升含：1 mol/L HCl、6 g FeSO₄·7H₂O、2.7 g CaCO₃、2 g ZnSO₄·H₂O、1.16 g MnSO₄·H₂O、0.37 g CoSO₄·7H₂O、0.33 g CuSO₄·5H₂O、0.08 g H₃BO₃。种子培养时，M9培养基中添加20 g/L葡萄糖。β-KA生产时，M9培养基中添加指定浓度的木质素衍生芳香族化合物或真实木质素流。
【数据】培养基：LB及M9基本培养基；温度：30°C（大肠杆菌37°C）；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、四环素25 μg/mL；M9组分：6.78 g/L Na₂HPO₄、3 g/L K₂HPO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、0.24 g/L MgSO₄；种子培养基葡萄糖：20 g/L
2.2 质粒与菌株构建
所有聚合酶链式反应使用Q5® Hot Start High-Fidelity 2×Master Mix（New England Biolabs）。无缝克隆使用ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme Biotech Co., Ltd, 南京），随后转化至大肠杆菌Top10。所有质粒经Sanger测序确认。质粒pCAS-RK2T和pSEVA-gRic6T由浙江大学惠赠。恶臭假单胞菌KT2440的基因操作通过CRISPR-Cas系统完成。质粒pCAS-RK2T、pSEVA-gRic6T及其衍生物通过电穿孔导入恶臭假单胞菌。首先，将恶臭假单胞菌KT2440接种至LB肉汤中，于30°C、220 rpm振荡培养至稳定期（约12 h）。随后室温下10,000 rpm离心2分钟，小心弃去上清液。细胞沉淀在室温下用1 mL 10%甘油重悬。重悬细胞再经历两轮离心、弃上清、10%甘油重悬。最后一次离心后，细胞以原培养物体积的1/50（v/v）重悬于10%甘油中。转化步骤中，将8 µL质粒DNA（200 ng至2 µg）加入100 µL电转感受态细胞中。混合物转移至0.2 cm电转杯，于2.5 kV进行电穿孔。电转后细胞重悬于700 µL LB培养基，转移至2.0 mL微量离心管中，于30°C、220 rpm振荡培养2 h。恢复培养物的稀释液涂布于含25 μg/mL四环素的LB琼脂培养基上。
【数据】PCR酶：Q5 Hot Start High-Fidelity 2×Master Mix；克隆试剂盒：ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit；电转条件：2.5 kV，0.2 cm电转杯；质粒DNA量：200 ng–2 µg；恢复培养：30°C、220 rpm、2 h；四环素浓度：25 μg/mL
2.3 芳香族单体与真实木质素水解液的发酵
重组恶臭假单胞菌菌株从甘油储备液接种至含5 mL LB培养基的12 mL试管中，于30°C、220 rpm培养12 h。随后将培养物转接至含50 mL LB培养基的250 mL摇瓶中，初始OD₆₀₀为0.5。二级种子液于30°C、180 rpm培养12 h，使OD₆₀₀达到约5.0。随后，将二级种子液接种至含50 mL M9基本培养基（添加特定浓度的p-CA、FA或p-CA与FA混合物）的250 mL摇瓶中，初始OD₆₀₀为1.0、2.0或5.0。混合底物中p-CA与FA的摩尔比固定为5:1，该比例对应碱预处理玉米秸秆水解液的组成。培养在30°C、180 rpm或250 rpm条件下进行。对于木质素衍生芳香族单体的补料分批发酵，使用500 mM p-CA和100 mM FA的浓缩溶液。以木质素水解液为底物发酵时，恶臭假单胞菌菌株在含不同量木质素的30 mL培养基中培养。木质素水解液添加量根据p-CA浓度调整。初始培养OD₆₀₀为2.0或5.0。为提高真实木质素流的β-KA产量，使用木质素水解液培养基进行补料分批发酵。含5 mM p-CA或10 mM p-CA的木质素水解液经冷冻干燥至恒重。真实木质素流补料分批发酵时，将冻干的木质素水解液加入250 mL锥形瓶中。培养期间采集样品，使用高效液相色谱测定芳香族化合物的消耗和β-KA的产生。
【数据】种子培养：LB培养基，30°C、220 rpm、12 h；二级种子：OD₆₀₀=0.5起始，30°C、180 rpm、12 h至OD₆₀₀≈5.0；发酵接种OD₆₀₀：1.0、2.0或5.0；p-CA:FA摩尔比：5:1；发酵温度：30°C；转速：180或250 rpm；补料浓缩液：500 mM p-CA、100 mM FA；木质素水解液培养体积：30 mL；补料用木质素水解液：含5 mM或10 mM p-CA
2.4 玉米秸秆生物质木质素水解液制备
玉米秸秆购自天津当地生物质供应商。木质素水解液按照前期研究采用组合预处理制备。简要流程如下：将15 g玉米秸秆装入1 L反应器中，加入含1 wt% H₂SO₄的溶液，固含量为10%（w/v）。反应体系在120°C维持30分钟。预处理后，预处理浆料经真空过滤分离预处理固体与液体流。预处理固体用蒸馏水洗涤至中性pH，于60°C干燥36 h。所得预处理固体进一步进行5 wt% NaOH预处理，固含量20%（w/v），于130°C处理45分钟。反应后，固液两相用纱布过滤分离，获得富含木质素的组分。随后，液体部分以12,000 rpm离心10分钟，从木质素水解液中分离悬浮细颗粒。木质素水解液中的芳香族单体用HPLC分析。富含木质素的流约含27 mM p-CA和1.33 mM FA。主要木质素衍生芳香族化合物浓度列于表S3。将含p-CA浓度为5 mM、10 mM和15 mM的木质素水解液添加至M9培养基中，进行真实木质素的批次发酵。种子细胞通过4,200 rpm离心10分钟收集，然后接种至木质素培养基中。发酵在pH 7.0、30°C、250 rpm条件下，于250 mL锥形瓶中进行，工作体积为30 mL。
【数据】酸预处理：1 wt% H₂SO₄、固含量10%（w/v）、120°C、30 min；固体干燥：60°C、36 h；碱预处理：5 wt% NaOH、固含量20%（w/v）、130°C、45 min；离心：12,000 rpm、10 min；木质素流组成：约27 mM p-CA、1.33 mM FA；发酵条件：pH 7.0、30°C、250 rpm、30 mL工作体积
2.5 分析方法
芳香族化合物及产物样品使用配备SPD-40A紫外检测器的Shimadzu LC-20AB高效液相色谱系统分析。样品使用Thermo Fisher C18色谱柱（15 cm × 2.1 mm，2.7 μm）分离，工作温度40°C。流动相由两种组分构成：流动相A为含0.1%甲酸的纯水，流动相B为甲醇。总流速1 mL/min，其中流动相A为0.2 mL/min，流动相B为0.8 mL/min。检测波长分别为254 nm、285 nm和325 nm。木质素衍生芳香族化合物产生的β-KA使用配备Aminex HPX-87 P碳水化合物分析柱（Bio-Rad Laboratories, CA）和示差折光检测器的Shimadzu Series系统分析，检测器温度65°C。
【数据】HPLC系统：Shimadzu LC-20AB，SPD-40A紫外检测器；色谱柱：Thermo Fisher C18（15 cm × 2.1 mm，2.7 μm）；柱温：40°C；流速：1 mL/min（A相0.2 mL/min + B相0.8 mL/min）；检测波长：254、285、325 nm；β-KA分析柱：Aminex HPX-87 P；检测器温度：65°C
研究结果
3.1 4-羟基苯甲酸羟基化是对香豆酸生产β-酮己二酸的瓶颈
恶臭假单胞菌KT2440具有天然的生物漏斗途径，可将多种木质素衍生芳香族单体同化为中心代谢中间产物β-KA。首先，通过删除恶臭假单胞菌KT2440的pcaIJ基因阻断β-KA降解途径，构建菌株HE01。p-CA是碱预处理木质素流中的重要芳香族化合物，最初被用于评估β-KA的生产（图1A）。结果表明，菌株HE01表现出将p-CA转化为β-KA的优异能力。在36 h内，该菌株从20 mM和30 mM p-CA分别产生19.65和30.80 mM β-KA（图1D）。在所测试的底物浓度中，菌株HE01在初始p-CA浓度为40 mM时达到最高β-KA浓度36.45 mM。然而值得注意的是，即使72 h后，4-HBA中间体仍持续积累，导致初始40 mM p-CA的最终β-KA产率仅为92.8%（图1C）。因此推测PobA是该转化过程中的限速酶。此外，使用20 mM p-CA时细胞密度增加了17%。同时，30 mM和40 mM p-CA的细胞密度分别增加了64%和82%（图1E）。20 mM和30 mM p-CA分别实现了98.3%和100.3%的高转化率。
为应对菌株HE01在较高p-CA浓度下的中间体积累问题，设计了两种策略来强化推测的限速酶PobA。在菌株HE19中，将第二个pobA基因拷贝整合至染色体上，由tac启动子（Ptac）驱动，如图2A所示。该修饰使得第二个pobA拷贝在强组成型启动子控制下表达。在菌株HE61中，第二个pobA基因拷贝被整合至pcaIJ基因位点，受天然pcaIJ启动子调控。菌株HE19在36 h内从40 mM p-CA产生29.46 mM β-KA。由于4-HBA积累量较高，β-KA摩尔产率降至73.6%（图2E）。这归因于强组成型启动子Ptac驱动的第二个pobA拷贝引起的代谢失衡。采用天然pcaIJ启动子调控第二个pobA拷贝后，成功消除了4-HBA积累，在36 h内从40 mM p-CA产生40.50 mM β-KA，摩尔产率达100.1%（图2C、2D和2E）。相应地，工程菌株HE61和HE01表现出显著的细胞密度增长，超过其他工程菌株，分别提高80%和86%（图2F）。这一成功归因于PpcaIJ启动子的代谢物响应特性，使其能够适应p-CA到4-HBA以及4-HBA到β-KA的代谢速率，最终实现代谢平衡。
Crc是公认的分解代谢途径调控因子，通过靶向编码转运蛋白、转录调控因子和酶的mRNA发挥影响。此外，Crc被认为是全局代谢抑制因子。删除crc基因被认为可以解除对PobA的抑制。由此从HE01和HE19菌株中删除crc基因，分别构建了菌株HE08和HE21。然而，在40 mM p-CA条件下的评估显示，删除crc基因几乎没有进一步改善β-KA产量，如图2C和2D所示。
【数据】HE01产β-KA：20 mM p-CA→19.65 mM（36 h）、30 mM p-CA→30.80 mM（36 h）、40 mM p-CA→36.45 mM（72 h产率92.8%）；转化率：20 mM为98.3%、30 mM为100.3%；细胞密度增加：20 mM p-CA为17%、30 mM为64%、40 mM为82%；HE19产β-KA：29.46 mM（40 mM p-CA，36 h，产率73.6%）；HE61产β-KA：40.50 mM（40 mM p-CA，36 h，产率100.1%）；细胞密度增加：HE61为80%、HE01为86%
3.2 香草酸O-脱甲基是阿魏酸生产β-酮己二酸的瓶颈
阿魏酸是碱处理玉米秸秆木质素流中另一种主要芳香族化合物。恶臭假单胞菌KT2440具有FA和p-CA的降解途径，共享相同的PCA代谢节点，如图1A和图3A所示。从另一种木质素衍生组分生产β-KA可以提高木质素转化效率。接下来评估了已阻断β-KA降解途径的菌株HE01从FA生产β-KA的能力。结果表明，菌株HE01表现出优异的FA转化为β-KA的积累能力。在24 h内，菌株HE01从20 mM和30 mM FA分别产生19.28 mM和29.50 mM β-KA（图3D）。转化率分别高达96.4%和98.3%。菌株HE01在36 h内还从40 mM FA产生40.3 mM β-KA。值得注意的是，30 mM FA在24 h内的平均β-KA生产率为1.23 mM/L/h，超过了20 mM FA在24 h内的0.80 mM/L/h以及40 mM FA在36 h内的1.17 mM/L/h。此外，使用20 mM FA时细胞密度增加了19%。然而，30 mM和40 mM FA的细胞密度分别增加了140%（图3E）。这些结果强调，阻断β-KA降解途径有效促进了木质素衍生FA的β-KA积累。
然而，随着FA浓度从20 mM增加到40 mM，VA的瞬时积累在24 h内从2 mM增加到8 mM。结果表明VanAB可能在转化过程中充当限速酶，尤其是在较高FA浓度下。为解决菌株HE01的代谢瓶颈，对限速酶VanAB进行了强化。菌株HE20通过将额外拷贝的vanAB基因（由tac启动子Ptac驱动）整合至HE01基因组的fpvA与PP_4218位点之间构建而成（图4A）。如图4C所示，与亲本菌株HE01相比，菌株HE20有效减少了VA积累。VA的瞬时积累保持在1 mM以下，并可在36 h内完全代谢。
Crc蛋白作为全局代谢抑制因子，已知可能抑制VanAB。从菌株HE01中删除crc基因获得菌株HE08。如图4C所示，菌株HE08表现出快速的底物利用速率，在30 h内达到最高β-KA产量40.2 mM，相当于6.43 g/L。值得注意的是，其摩尔产率达100.3%（mol/mol）。这些结果表明，删除crc基因提高了FA的β-KA产量，生产率比亲本菌株HE01（1.11 mM/L/h）增加了20%，达到1.33 mM/L/h。菌株HE08在整个发酵过程中VA积累量低于3 mM。
将删除crc基因与过表达vanAB的有利基因干预相结合。菌株HE22通过同时过表达vanAB和删除crc基因构建，在30 h内实现40.11 mM β-KA的产量。值得注意的是，菌株HE22中VA的瞬时积累保持在1 mM以下。
【数据】HE01产β-KA：20 mM FA→19.28 mM（24 h，产率96.4%）、30 mM FA→29.50 mM（24 h，产率98.3%）、40 mM FA→40.3 mM（36 h）；生产率：30 mM FA为1.23 mM/L/h（24 h）、20 mM FA为0.80 mM/L/h（24 h）、40 mM FA为1.17 mM/L/h（36 h）；细胞密度增加：20 mM FA为19%、30 mM和40 mM FA为140%；VA瞬时积累：2 mM→8 mM（FA从20 mM增至40 mM，24 h内）；HE20产β-KA：VA积累<1 mM，36 h内完全代谢；HE08产β-KA：40.2 mM（6.43 g/L，30 h，产率100.3%，生产率1.33 mM/L/h）；HE01生产率：1.11 mM/L/h；HE22产β-KA：40.11 mM（30 h），VA积累<1 mM
3.3（续）工程菌株的整合与发酵优化
将上述有利的基因操作整合至染色体中，构建了菌株HE65。采用该菌株，通过补料分批策略在摇瓶实验中从混合木质素衍生芳香族化合物中实现了创纪录的β-KA产量14.80 g/L。实验表明，在以40 mM p-CA与8 mM FA为初始底物，并按1:1:2比例分三次补加40 mM p-CA和8 mM FA的条件下，工程菌株HE65达到最高β-KA产量92.01 mM，相当于14.8 g/L。在真实木质素水解液发酵中，工程菌株在无需分离或脱毒处理的情况下，从玉米秸秆木质素水解液中获得了创纪录的2.48 g/L β-KA产量（15.5 mM）。
【数据】HE65最高β-KA产量：92.01 mM（14.8 g/L）；底物条件：初始40 mM p-CA + 8 mM FA，分三次补加40 mM p-CA + 8 mM FA（比例1:1:2）；真实木质素水解液产量：15.5 mM（2.48 g/L）
讨论与解读
本研究系统展示了恶臭假单胞菌KT2440作为木质素转化底盘菌株的潜力。通过阻断β-KA降解途径，该菌株天然具备的"生物漏斗"途径得以将H型和G型木质素衍生单体汇入目标产物。研究的关键突破在于精准识别了两条途径各自的限速酶——p-CA途径中的PobA和FA途径中的VanAB，并采用天然启动子驱动的额外基因拷贝策略实现代谢平衡，避免了强组成型启动子带来的代谢紊乱。值得注意的是，删除crc基因对p-CA途径无显著改善，却显著提升了FA途径的生产率，这提示不同底物途径的调控机制存在差异。在真实木质素水解液中的成功应用，验证了该策略无需繁琐的分离脱毒步骤即可实现木质素增值转化。
编译者解读：该研究的核心价值在于提供了"限速酶精准识别—启动子适配强化—染色体整合"的系统代谢工程范式。使用天然代谢物响应启动子（PpcaIJ）而非强组成型启动子来驱动限速酶表达，是维持代谢平衡的关键设计，对同类芳香族化合物生物转化研究具有借鉴意义。从应用角度看，直接在未脱毒的真实木质素水解液中获得2.48 g/L产量，显著降低了过程成本。但摇瓶水平的结果距离工业规模化仍有距离——高浓度木质素的毒性耐受、更高效的低成本木质素解聚技术，以及生物反应器中的放大验证，将是后续产业化探索的主要方向。
参考来源
Liu, H. (2024). Funneling lignin hydrolysates into β-ketoadipic acid by engineered Pseudomonas putida KT2440. Industrial Crops and Products. DOI: 10.1016/j.indcrop.2024.118956
DOI: 10.1016/j.indcrop.2024.118956