来源：Decoding key genes of Pseudomonas sp. HNGD-T31 involved in citrus flavor (+)-valencene biotransformation to (+)-nootkatone by integrated genomics and transcriptomics（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
(+)-圆柚酮是一种具有持久强烈柑橘果香特征的倍半萜化合物，在食品、医药和农业领域具有重要应用价值。本研究从柑橘产区土壤中分离到一株新型假单胞菌 Pseudomonas sp. HNGD-T31（CCTCCM 20251583），该菌株能够高效将(+)-戊烯酮生物转化为(+)-圆柚酮，最高产量达 418.31 ± 1.83 mg/L。研究者整合基因组学与转录组学手段，揭示了参与该生物转化过程的关键基因与代谢通路，为(+)-圆柚酮的微生物法生产提供了新菌株和分子层面的机制认知。
研究背景
倍半萜类化合物是一类具有多种生物活性的风味物质，广泛应用于食品、香料、化工和制药行业。(+)-圆柚酮是一种含氧倍半萜，最初从阿拉斯加黄柏心材中提取，后来在柑橘类植物果皮（如甜橙、葡萄柚、柠檬）及益智仁中发现。因其强烈持久的柑橘果香和极低的感知阈值，在食品和化妆品行业中应用广泛。此外，(+)-圆柚酮还具有抗纤维化、抗炎、抗血小板聚集和抗癌细胞增殖等多种生物活性，并可通过抗氧化和抗乙酰胆碱酯酶活性抑制阿尔茨海默病，同时具有抑制淀粉样β-肽积累的作用。
然而，天然含量有限制约了植物提取法的应用。商业上，每个葡萄柚仅能提取 100 mg，高纯度食品级(+)-圆柚酮价格高达约每升 4000 美元。尽管其结构相对简单，工业规模的化学合成涉及多步工艺和危险物质。因此，微生物生物转化法成为极具潜力的替代途径。
研究方法
2.1 材料与试剂
(+)-戊烯酮（纯度 >70.0%）购自 Sigma Chemical Co. Ltd.（美国密苏里州圣路易斯）。(+)-圆柚酮（纯度 >97.0%）购自 TCI Development Co., Ltd.（日本东京）。NaCl、葡萄糖、蛋白胨、FeSO₄·7H₂O、MgSO₄、MnSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、CaCl₂、甲醇、乙醇、丙酮、甘油、乙酸乙酯、DMSO、10-邻菲啰啉、8-羟基喹啉、EDTA、SKF-525A、Metiranone 和 2,2′-联吡啶均购自中国医药集团化学试剂有限公司（中国上海）。样品采集自：橙园（中国武汉）土壤（S1）、橘子洲柑橘产区土壤（中国长沙）（S2）、柚子岛柑橘产区土壤（中国长沙）（S3）、白若铺乡村葡萄柚树土壤（中国郑州）（S4）、玉米田土壤（中国郑州）（S5）、腐烂甜橙（Citrus sinensis Osbeck）（S6）和腐烂柚子（Citrus grandis (L.) Osbeck）（S7）。
【数据】(+)-戊烯酮纯度：>70.0%；(+)-圆柚酮纯度：>97.0%；样品来源：7处（S1-S7）
2.2 耐(+)-戊烯酮微生物的筛选
将适当样品先在 0.85% 生理盐水中于 37°C、200 rpm 条件下培养 4 小时。随后，将培养物用于接种添加了 0.1%（v/v）(+)-戊烯酮的 LB 培养基，发酵 48 小时。通过平板划线分离单菌落，保存对(+)-戊烯酮具有高耐受性的菌株。将这些菌株选择性培养于 M9 培养基（Na₂HPO₄ 6 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、NH₄Cl 1 g/L、1 mol/L MgSO₄ 2 mL）中，并加入 100 μL（0.2% v/v）(+)-戊烯酮。37°C 培养 48 小时后评估培养物生长情况。对 0.2% (+)-戊烯酮的耐受性定义为菌株维持良好生长的能力。
【数据】生理盐水浓度：0.85%；温度：37°C；转速：200 rpm；时间：4 h；LB培养基(+)-戊烯酮浓度：0.1%（v/v）；发酵时间：48 h；M9培养基成分：Na₂HPO₄ 6 g/L、NaCl 0.5 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、NH₄Cl 1 g/L、1 mol/L MgSO₄ 2 mL；(+)-戊烯酮添加量：100 μL（0.2% v/v）；培养时间：48 h；温度：37°C
2.3 (+)-戊烯酮生物转化产物的检测
生物转化在 M9 培养基中进行，接种细菌预培养物后于 37°C、200 rpm 培养 36 小时。细菌预培养物先转接至 LB 培养基培养 6 小时。加入(+)-戊烯酮（920 mg/L）后，使用 SPME/GC-MS 在 24、48 和 72 小时监测生物转化过程。柱温程序为：40°C 保持 3 分钟，以 3°C/min 升至 160°C（保持 2 分钟），再以 8°C/min 升至 220°C（保持 3 分钟）。进样口和 FID 检测器温度均设为 250°C。MS 条件：离子源 230°C，四极杆 150°C，EI 模式（70 eV），m/z 45-550。同时设置不含(+)-戊烯酮和不含微生物的空白测定。
【数据】M9培养基培养温度：37°C；转速：200 rpm；时间：36 h；LB预培养时间：6 h；(+)-戊烯酮添加浓度：920 mg/L；GC-MS监测时间点：24、48、72 h；柱温程序：40°C（3 min）→3°C/min→160°C（2 min）→8°C/min→220°C（3 min）；进样口/FID温度：250°C；离子源温度：230°C；四极杆温度：150°C；EI电离能：70 eV；m/z扫描范围：45-550
2.4 耐(+)-戊烯酮微生物的鉴定
通过菌落 PCR 使用通用引物（27F 和 1492R）扩增筛选菌株的 16S rDNA 基因，随后进行测序。所得序列提交至 NCBI GenBank 数据库，使用 BLAST 工具进行同源性分析。从比对搜索结果中选取同源性高的菌株，下载 16S rDNA 基因序列信息，使用 MEGA 7 软件构建系统发育树。革兰氏染色后，在光学显微镜下观察菌株形态。
【数据】16S rDNA引物：27F/1492R；系统发育树构建软件：MEGA 7；鉴定方法：菌落PCR+测序+BLAST比对
2.5 选定菌株的生长曲线与扫描电子显微镜（SEM）分析
选定菌株在 LB 肉汤中的生长通过每 2 小时间隔测定 OD600 值监测 48 小时。以时间对 OD600 绘制生长曲线。以未接种空白作为对照。细菌悬液通过 3000×g 离心 5 分钟收集，保留沉淀用于后续分析。固定后，细菌用 PBS 缓冲液（pH 7.2）洗涤三次，超纯水洗涤两次（每次洗涤 15 分钟），每次洗涤后离心（3000×g，5 分钟）保留沉淀。细菌样品经乙醇梯度脱水，冷冻干燥后转移至电子显微镜设施进行后续制备。菌株在扫描电子显微镜检查前经金溅射镀膜处理。
【数据】OD600测定间隔：2 h；监测时间：48 h；离心条件：3000×g，5 min；PBS缓冲液pH：7.2；洗涤次数：PBS 3次+超纯水2次；每次洗涤时间：15 min
2.6 单因素设计优化 Pseudomonas sp. HNGD-T31 生产(+)-圆柚酮
将 Pseudomonas sp. HNGD-T31 接种于添加了不同金属离子源（Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺，浓度 0.4 g/L）或不同浓度(+)-戊烯酮的 LB 培养基中，培养 4 小时。对(+)-戊烯酮转化进行了助溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、甘油、乙酸乙酯、DMSO）的初步筛选。随后，将最优助溶剂的浓度分别调整为 0.2%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6% 和 2.0%（v/v）进行进一步优化。此外，培养物在不同转化温度（31°C、34°C、37°C 和 40°C）和转速（160、180、200、220 和 240 rpm）下进行培养。(+)-圆柚酮采用外标法定量，标准曲线为 y = 43587689x - 3109148.40，R² = 0.9949。环己酮作为内标用于其他香气成分的定量过程。使用 SPME/GC-MS 追踪生物转化过程 72 小时。设置了不含(+)-戊烯酮或不含微生物的空白对照。香气成分浓度（mg/L）根据公式（1）计算：
浓度（mg/L）= (Aa × Mi) / (Ai × S)
其中 Aa 代表组分的峰面积，Mi 代表内标的质量（mg），Ai 代表内标的峰面积，S 代表样品体积（L）。转化率（%）随后使用公式（2）确定：
转化率（%）= (+)-圆柚酮浓度 / (+)-戊烯酮浓度 × 100%
【数据】金属离子浓度：0.4 g/L；金属离子种类：Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺；助溶剂种类：甲醇、乙醇、丙酮、甘油、乙酸乙酯、DMSO；助溶剂浓度梯度：0.2%、0.6%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%（v/v）；温度梯度：31、34、37、40°C；转速梯度：160、180、200、220、240 rpm；标准曲线：y = 43587689x - 3109148.40，R² = 0.9949；内标：环己酮；监测时间：72 h
2.7 基因组 DNA 提取、文库构建与测序
Pseudomonas sp. HNGD-T31 在 LB 培养基中于 37°C 培养 24 小时。随后使用 Omega Fungal DNA Kit（北京方程生物技术，中国北京）从细菌细胞中提取基因组 DNA。提取的 DNA 质量和浓度通过 nanodrop2500 分光光度计和琼脂糖凝胶电泳评估。Illumina reads 用于估计基因组杂合度和整体复杂性，随后整合 PacBio 长 reads 以修饰和验证初始组装。来自 Illumina 和 PacBio 平台的测序输出被整合用于下游生物信息学处理。功能注释进一步比对到 KEGG、COG 和 GO 数据库进行功能分类。
【数据】培养温度：37°C；培养时间：24 h；DNA提取试剂盒：Omega Fungal DNA Kit；质控仪器：nanodrop2500分光光度计+琼脂糖凝胶电泳；测序平台：Illumina + PacBio；注释数据库：KEGG、COG、GO
2.8 Pseudomonas sp. HNGD-T31 的 CAZymes 和次级代谢物基因簇鉴定
通过使用 BLASTp 对 CAZy 数据库进行穷举搜索，系统鉴定了 Pseudomonas sp. HNGD-T31 的 CAZymes。低同一性的序列进行了人工验证，包括使用 InterProScan 进行催化残基分析和通过 HMMER 针对 Pfam-A 数据库进行结构域确认。次级代谢物生物合成基因簇（BGCs）使用 antiSMASH 7.0.0 默认参数进行鉴定。
【数据】CAZymes鉴定方法：BLASTp对CAZy数据库穷举搜索；验证工具：InterProScan + HMMER（Pfam-A数据库）；BGCs鉴定工具：antiSMASH 7.0.0（默认参数）
2.9 RNA 提取与转录组分析
使用 TRIzol® 试剂（ThermoFisher，中国上海）从 P_V_48h（(+)-戊烯酮处理条件）和 P_48h（未处理空白）样品中提取总 RNA，并去除基因组 DNA。在第二链合成过程中，掺入 dUTP 替代 dTTP。所得 cDNA 随后按照 Illumina 方案进行末端修复、腺苷酸化和平滑头连接。使用 Illumina Stranded mRNA Prep、Ligation 试剂盒从总 RNA 制备 RNA-seq 转录组文库，随后在 Illumina NovaSeq X Plus 平台上以双端模式进行测序。对 Illumina 测序数据进行生物信息学分析。差异表达分析使用 DESeq2 进行。
【数据】RNA提取试剂：TRIzol®；处理组：P_V_48h（(+)-戊烯酮处理）；对照组：P_48h（未处理）；文库制备试剂盒：Illumina Stranded mRNA Prep, Ligation kit；测序平台：Illumina NovaSeq X Plus；测序模式：双端；差异表达分析工具：DESeq2
研究结果
3.1 耐(+)-戊烯酮菌株的筛选
本研究从 7 个样品中分离到 144 株潜在菌株，这些菌株能在 0.1% (+)-戊烯酮中良好生长。此外，13 株菌能在含 0.2% (+)-戊烯酮的 M9 培养基中生长，表明存在(+)-戊烯酮降解途径（图1A）。检测了这些菌株的发酵液，HNGD-T31 具有最强的(+)-圆柚酮生产能力，转化率达 11.08%。这表明菌株 HNGD-T31 可能具有将(+)-戊烯酮转化为含氧化合物的能力。此外，可以观察到 HNGD-T31 还获得了其他产物（α-松油醇、紫苏醇、α-紫罗兰酮、α-二氢卡拉曼、3,5,11-桉叶素、石竹烯氧化物和 α-香附酮）（表1）。在 48 小时观察到最大(+)-圆柚酮产量 102.32 ± 1.83 mg/L，此后浓度下降，可能归因于营养限制。在前 24 小时，主要香气成分为 α-松油醇、紫苏醇、α-二氢卡拉曼、3,5,11-桉叶素、石竹烯氧化物、α-香附酮和(+)-圆柚酮。随后，α-香附酮含量增加至 38.21 ± 2.82 mg/L，3,5,11-桉叶素达到 26.52 ± 5.51 mg/L，紫苏醇达到 13.78 ± 2.81 mg/L。这些含氧萜烯的共产生与先前报道的微生物萜烯底物降解途径一致。因此，HNGD-T31 显示出将(+)-戊烯酮生物转化为生物风味化合物的潜力。
【数据】分离菌株总数：144株；耐受0.2%(+)-戊烯酮菌株数：13株；HNGD-T31转化率：11.08%；最大(+)-圆柚酮产量：102.32 ± 1.83 mg/L（48 h）；α-香附酮含量：38.21 ± 2.82 mg/L；3,5,11-桉叶素含量：26.52 ± 5.51 mg/L；紫苏醇含量：13.78 ± 2.81 mg/L
3.2 菌株的鉴定与特性
采用 16S rDNA 测序方法鉴定菌株，构建了 HNGD-T31 的系统发育树（图1B）。菌株 HNGD-T31 的基因序列与 Pseudomonas putida 属具有 99% 的相似性，表明菌株 HNGD-T31 属于该属。此外，Pseudomonas sp. HNGD-T31 保藏于 CCTCC，保藏号为 CCTCC M 20251583。HNGD-T31 的生长曲线显示，OD600 值在 2 至 10 小时期间迅速增加，表明该菌株处于对数生长期（图1C）。形成的菌落呈圆形至略微不规则形、伞状，边缘波状-弥散型；表面光滑，灰白色（图1D）。菌株 HNGD-T31 的细胞在光学显微镜下呈直或稍弯曲的杆状（图1E）。菌株 HNGD-T31 的扫描电子显微镜图像显示其呈棒状或水滴状结构，大小 1.5~2 μm（图1E）。革兰氏染色和番红复染后，细胞呈红色，证实其为革兰氏阴性菌（图1F）。结果表明 Pseudomonas sp. HNGD-T31 适用于通过(+)-戊烯酮生物转化生产(+)-圆柚酮和生物风味化合物（图1G）。此外，Pseudomonas putida 是一种快速生长的细菌，具有强大的代谢功能，对具有抗菌活性的萜类化合物表现出良好的耐受性。
【数据】16S rDNA同源性：与Pseudomonas putida 99%相似；保藏号：CCTCC M 20251583；对数生长期：2-10 h；菌体大小：1.5~2 μm；革兰氏染色：阴性（红色）
3.3 单因素设计优化 Pseudomonas sp. HNGD-T31 生产(+)-圆柚酮
为获得更好的生物转化效果，考察了一系列影响 Pseudomonas sp. HNGD-T31 将(+)-戊烯酮转化为(+)-圆柚酮的因素。Zn²⁺ 对(+)-戊烯酮生物转化表现出显著的抑制作用，(+)-圆柚酮含量下降（P < 0.05），表明 Zn²⁺ 对催化该生物转化的酶具有抑制作用。相反，Fe²⁺ 补充同时将(+)-圆柚酮浓度和底物转化率提升至最大值（P < 0.05）（图2A）。此外，CYP450 酶催化(+)-戊烯酮羟基化为(+)-圆柚酮的关键步骤，CYP450 超家族含有必需的铁-原卟啉 IX（血红素）辅基。因此，外源 Fe²⁺ 可能通过作为血红素生物合成的前体或通过稳定酶处于催化活性构象来增强 CYP450 活性。因此，向发酵培养基中精确添加 Fe²⁺ 构成了定向强化(+)-戊烯酮生物转化效率的合理策略。(+)-圆柚酮含量随(+)-戊烯酮浓度升高先增加，在底物 920 mg/L 时达到峰值 289.98 mg/L，随后下降（图2B）。这一结果与另一项关于解脂耶氏酵母优化(+)-戊烯酮生物转化为(+)-圆柚酮的研究一致，较低底物量可获得较高转化产量。甲醇、乙醇、丙酮、甘油和乙酸乙酯抑制了(+)-戊烯酮的生物转化，可能是由于它们对菌株 HNGD-T31 的不利影响，说明溶剂辅助体系中底物溶解度与酶活性之间存在常见的权衡关系。此外，DMSO 作为助溶剂时提高了生物转化效率（图2C）。当 DMSO 浓度为 0.8%（v/v）时，(+)-圆柚酮含量达到最大值（323.14 mg/L）（图2D）。这一有益效果与低浓度 DMSO 可增强疏水性底物与细胞色素 P450 的可及性而无显著酶抑制的报道一致，而较高浓度则有害。温度通过调节酶动力学、蛋白质稳定性、底物溶解度和营养吸收在微生物生长和代谢产物生产力中发挥关键作用。(+)-圆柚酮产量在 37°C 时出现最适值，在测试的 31-40°C 范围内，较高和较低温度下均出现下降（图2E）。此外，搅拌通过调节溶解氧水平直接影响生物转化效率，进而影响微生物生长。如图2F 所示，(+)-圆柚酮产量随搅拌速度增加至 220 rpm 而增加，达到最大产量 418.71 mg/L，超过该转速后下降。该结果表明，优化催化条件显著提高了 HNGD-T31 的(+)-圆柚酮产量。
【数据】Zn²⁺效应：抑制（P < 0.05）；Fe²⁺效应：促进，(+)-圆柚酮浓度和转化率达最大值（P < 0.05）；最佳(+)-戊烯酮浓度：920 mg/L；峰值产量：289.98 mg/L；最佳助溶剂：DMSO；最佳DMSO浓度：0.8%（v/v）；最大产量：323.14 mg/L；最适温度：37°C（测试范围31-40°C）；最适转速：220 rpm（测试范围160-240 rpm）；最大产量：418.71 mg/L
3.4 Pseudomonas sp. HNGD-T31 的基因组分析
结果表明，Pseudomonas sp. HNGD-T31 基因组中预测到 5255 个蛋白质编码基因，基因组大小为 5,922,574 bp（表2）。HNGD-T31 基因组共产生 473,228,394 bp PacBio 数据和 1,288,584,170 bp Illumina HiSeq 数据。HNGD-T31 基因组组装为 5.25 Mb 序列，鉴定到 73 个 tRNA 和 22 个 rRNA 基因（图3A 和 B）。功能注释显示 NR 数据库匹配 5245 个基因，Swiss-Prot 匹配 4080 个，Pfam 匹配 4679 个。GO 注释在 HNGD-T31 中鉴定到 2761 个基因，其中 2,299、1,789 和 1,646 个分别归属于 MF（分子功能）、CC（细胞组分）和 BP（生物学过程）类别。在生物学过程和分子功能类别下鉴定到多个基因，包括 ATP 结合（268）、金属离子结合（206）、DNA 结合（189）、ATP 水解活性（116）、DNA 模板化转录调控（72）和翻译（60），这些促进了菌株的生长和代谢。此外，在细胞组分方面，更多基因被分配到质膜（476）、胞质溶胶（405）、膜（336）、细胞质（288）和 ATP 结合盒（ABC）转运复合体（47）（图3C）。KEGG 分析将 4082 个基因注释到功能通路中（图3D），其中基因最丰富的类别为“氨基酸代谢（385）”、“碳水化合物代谢（337）”、“信号转导（323）”、“辅因子和维生素代谢（254）”、“能量代谢（239）”和“脂质代谢（125）”。这些结果表明 HNGD-T31 中强大的蛋白质、脂质和能量代谢支持了高效的营养同化。
【数据】基因组大小：5,922,574 bp（5.92 Mb）；蛋白质编码基因数：5255；PacBio数据量：473,228,394 bp；Illumina数据量：1,288,584,170 bp；组装大小：5.25 Mb；tRNA数：73；rRNA数：22；NR匹配：5245；Swiss-Prot匹配：4080；Pfam匹配：4679；GO注释基因数：2761（MF 2299/CC 1789/BP 1646）；KEGG注释基因数：4082；氨基酸代谢基因：385；碳水化合物代谢：337；信号转导：323；辅因子和维生素代谢：254；能量代谢：239；脂质代谢：125
讨论与解读
4.1 参与(+)-戊烯酮生物转化的 ABC 转运蛋白相关 DEGs
ABC 转运蛋白是几乎在所有生命形式中发现的进化上古老且广泛的膜蛋白家族。底物(+)-戊烯酮是强疏水性的倍半萜化合物，ABC 转运蛋白能及时将过量底物泵出细胞，从而降低对细胞的毒性。在酿酒酵母中异源表达特定的 ABC 转运蛋白（来自蝴蝶兰的 PbABCG1 和 PbABCG2）已被证明可通过促进单萜的外排显著增强对其的耐受性。此外，产物(+)-圆柚酮对细胞膜具有脂溶性胁迫，胞内浓度升高可抑制酶活性。ABC 转运蛋白由 ATP 水解驱动，主动将胞内(+)-圆柚酮排泄至胞外或细胞间隙，使胞内产物浓度保持在抑制阈值以下，从而延长催化时间并提高整体转化效率。(+)-戊烯酮显著上调了 ABC 转运蛋白（cysA、afuC、cysW、sbp、cysU 和 lapB）的转录，表明它们在 Pseudomonas sp. HNGD-T31 中参与底物识别和外排以减轻(+)-戊烯酮及其产物(+)-圆柚酮的细胞毒性。
编译者解读
本研究从土壤筛选到一株天然具有(+)-戊烯酮转化能力的 Pseudomonas 菌株，通过单因素优化将(+)-圆柚酮产量推至 418.71 mg/L，展示了"先筛菌、再优化、后解析"的经典合成生物学研究路径。值得关注的是 Fe²⁺ 对转化效率的显著促进——这为 CYP450 酶系统的金属离子调控提供了直接的工程抓手。基因组与转录组的整合分析则把菌株优势落到具体基因上，为后续在工业底盘菌中异源表达关键转运蛋白和代谢酶提供了靶点清单。不过，该研究对关键酶基因的体内功能验证尚显不足，若能在后续工作中结合基因敲除或异源重构实验加以闭环验证，将更具说服力。
参考来源
Li, Xiao. Decoding key genes of Pseudomonas sp. HNGD-T31 involved in citrus flavor (+)-valencene biotransformation to (+)-nootkatone by integrated genomics and transcriptomics. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119504
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119504