来源：Sustainable microbial production of retinol in Yarrowia lipolytica: From strain engineering to formulation（New Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
维生素A（视黄醇）传统上依赖化学合成，其不稳定性为微生物发酵生产带来巨大挑战。本研究在前期构建的视黄醇生产菌株基础上，通过“推-拉”代谢工程策略将摇瓶产量提升3.2倍，并开发了基于吐温胶束破坏的溶剂萃取纯化工艺。最终工程菌株在5-L发酵罐中实现7.16 g/L视黄醇产量，纯化后纯度达48.6%，并完成10%视黄醇原型制剂的细胞毒性与稳定性评价。该工作首次实现了微生物来源视黄醇的纯化与制剂化，为不稳定高价值化合物的可持续生产提供了完整技术范式。
研究背景
维生素A是维持所有生物体生理代谢的必需营养素，其生物活性以国际单位（IU）计量，涵盖视黄醇、视黄醛、维甲酸、视黄酯及β-胡萝卜素等化合物。自1916年被首次发现以来，维生素A长期通过化学合成或天然产物提取获得。饲料添加剂领域（尤其是视黄酯）是视黄醇需求的主要驱动力，食品与化妆品行业也有可观用量。尽管天然视黄醇可从鱼肝油中提取，但工业级视黄醇及视黄酯绝大部分由巴斯夫、帝斯曼-芬美意、浙江新和成等跨国化工企业通过多步催化路线合成。溶剂污染与供应链问题促使研究者将目光转向微生物发酵这一更清洁、更稳定的替代方案。大肠杆菌中首次实现了维生素A的微生物合成，此后研究扩展至酿酒酵母等真核宿主，通常采用含十二烷或植物油的双相培养系统以促进产物萃取。本课题组此前已在产油酵母解脂耶氏酵母中实现了视黄醇生产，并通过添加吐温80与抗氧化剂丁羟甲苯（BHT）改善了产物回收效率。然而，视黄醇固有的化学不稳定性使生物合成与下游加工均面临严峻考验，亟需整合产物回收与稳定化的系统策略。
研究方法
2.1 培养条件
解脂耶氏酵母细胞在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中过夜培养，随后以初始OD600为2接种于300 mL带挡板摇瓶中的20 mL YPDUL60培养基[10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、60 g/L葡萄糖、1 g/L尿嘧啶、1 g/L亮氨酸、100 mM磷酸钾（pH 7.0）]，并添加0.05%（w/v）BHT和10%（w/v）吐温80。细胞在30°C、200 rpm振荡条件下培养。此外，使用SC-Ura平板[20 g/L葡萄糖、SC-Ura（Sigma）、6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源基础（BD Difco）、Bacto琼脂（BD Difco）]筛选携带目标基因修饰的转化子。
【数据】培养基：YPD/YPDUL60；葡萄糖：20/60 g/L；温度：30°C；转速：200 rpm；OD600初始值：2；BHT：0.05%（w/v）；吐温80：10%（w/v）
2.2 菌株构建
本研究所用菌株见表1。亲本菌株为CJ2104，是由解脂耶氏酵母Po1f衍生的视黄醇生产菌株。基因删除与整合基于约500 bp同源臂的DNA片段的同源重组实现，URA3标记用于整合DNA片段的选择。基因过表达时，各目标基因置于强启动子TEFINt、TEF、EXP1或天然启动子控制下，并以CYC1、TDH3或天然终止子终止转录。所需DNA片段通过重叠PCR组装。解脂耶氏酵母转化参照优化的一步转化方案并稍作修改进行。DNA混合物[0.5–1 μg DNA、90 μL 50% PEG 4000、10 μL 1 M二硫苏糖醇（DTT）、5 μL 2 M LiAc、2.5 μL ssDNA（UltraPure™鲑鱼精DNA溶液，Invitrogen）]与解脂耶氏酵母细胞涡旋混合至少10 s，随后在39°C孵育50 min。转化混合物涂布于SC-Ura平板，30°C培养3–4天。通过菌落PCR确认正确的基因组修饰后，将菌株在5-氟乳清酸（5-FOA）平板[2 g/L葡萄糖、6.7 g/L不含氨基酸的YNB（BD Difco）、1.92 g/L SC-Ura（Sigma）、24 mg/L尿嘧啶（Sigma）、10 mL/L 5-FOA（ZYMO RESEARCH）、20 g/L Bacto琼脂（BD Difco）]上培养3–4天以去除URA3标记。菌株构建所用引物列于补充表S1。
为构建菌株CJ2116，将携带TEFINt启动子驱动的ERG12（YALI0B16038）和EXP1启动子驱动的ERG13（YALI0F30481）的表达盒导入CJ2104，同时删除CAT8（YALI0C19151）。为进一步增强甲羟戊酸途径，将TEFINt启动子驱动的HMG1（YALI0E04807）插入CJ2116并同时删除YALI0E15400，生成菌株CJ2162。为改善β-胡萝卜素生物合成，通过整合EXP1启动子驱动的Hp.GGPPS1、TEFINt启动子驱动的Xd.crtYB和TEFINt启动子驱动的Xd.crtI并删除CLG1（YALI0C09262），构建菌株CJ2227。为增加乙酰-CoA供应，引入含天然启动子驱动的MFE1（YALI0E15378）、POT1（YALI0E18568）和PEX10（YALI0C01023）的盒并删除YEH2（YALI0E00528），生成菌株CJ2285。为进一步增强β-胡萝卜素生物合成，在CJ2285中删除INTF（YALI0F3161413–YALI0F3162449）并整合额外拷贝的TEFINt启动子驱动的Xd.crtYB，构建菌株CJ2519。最后，为促进脂质降解，将天然启动子驱动的POX2（YALI0F10857）整合至CJ2519的KU70位点，获得最终菌株CJ2532。
【数据】同源臂长度：约500 bp；转化条件：39°C、50 min；5-FOA平板培养：3–4天；PEG 4000：50%；DTT：1 M；LiAc：2 M
2.3 补料分批发酵
CJ2532细胞在含1 g/L尿嘧啶和1 g/L亮氨酸的YPD培养基中于500 mL摇瓶培养，将100 mL培养物接种至5 L生物反应器（BIOCNS Co., Ltd.）中的1.5 L培养基[40 g/L葡萄糖、2 g/L MgSO4·7H2O、1.95 g/L H3PO4（85%）、2.11 g/L KOH（45%）、10 g/L亮氨酸、2 g/L尿嘧啶、7 g/L硫酸铵、5 g/L酵母提取物、26 mg/L CaCl2·2H2O、35.1 mg/L FeSO4·7H2O、18.2 mg/L ZnSO4·5H2O、25.9 mg/L CuSO4·5H2O、26 mg/L Na2MoO4·2H2O、6.5 mg/L H3BO3、26 mg/L MnSO4·H2O及微量元素溶液]。补料分批发酵时，种子培养物以初始OD600为25接种至5 L生物反应器中的1.25 L培养基[40 g/L葡萄糖、2 g/L MgSO4·7H2O、1.95 g/L H3PO4（85%）、2.11 g/L KOH（45%）、10 g/L亮氨酸、2 g/L尿嘧啶、7 g/L硫酸铵、26 mg/L CaCl2·2H2O]。发酵通气速率为1.5 v/v/min，搅拌转速900 rpm，温度30°C。溶解氧维持在1.5–3.5 ppm之间。通过通入氨气将pH维持在6.5。添加PURECHEM AF−4000（IC CHEMICAL Co. Ltd.）消除泡沫。培养16.6–19.6 h后开始补料，补料培养基为[50%（w/v）葡萄糖浓缩储备液、6 g/L亮氨酸、13.67 g/L H3PO4（85%）、8.89 g/L KOH（45%）、3 mg/L核黄素、0.05%（w/v）BHT、10%（w/v）吐温80或吐温20]，葡萄糖补料速率为5.26 g/(L·h)。
【数据】初始葡萄糖：40 g/L；OD600初始值：25；通气速率：1.5 v/v/min；转速：900 rpm；温度：30°C；溶解氧：1.5–3.5 ppm；pH：6.5；补料葡萄糖浓度：50%（w/v）；补料速率：5.26 g/(L·h)；补料启动时间：16.6–19.6 h
2.4 全息断层显微成像
使用全息断层显微镜（HT-1H，Tomocube Inc.，韩国）对胶束进行无标记三维（3D）成像。该系统配备电动载物台、532 nm激光器、两个高数值孔径物镜（NA = 1.2；UPLSAPO 60×WI，Olympus，日本）以及用于高分辨率3D折射率（RI）测量的动态微镜装置。样品的衍射光通过物镜收集并用于重建基于RI的图像。将20 μL渗透液分装至TomoDishes（Tomocube Inc.）中，用#1.5H盖玻片（Tomocube Inc.）密封。使用TomoStudio HT-2H Gen3软件（Tomocube Inc.）采集并可视化2D RI切片图像和3D RI断层图像。
【数据】激光波长：532 nm；物镜NA：1.2；样品量：20 μL；盖玻片：#1.5H
2.5 拉曼光谱
使用配备785 nm激发激光的Raman RXN2分析仪（Kaiser Optical Systems, Inc.，Ann Arbor, MI, USA）采集拉曼光谱，原位探头处功率为140 mW。采集参数优化为每次测量曝光时间3 s、累积10次。光谱记录范围为100–3200 cm−1，光谱分辨率为1 cm−1。所有光谱数据使用iC Raman 4.1软件（Mettler Toledo Autochem，Columbia, MD，USA）处理，该软件同时控制仪器并辅助数据采集与分析。数据处理过程中应用强度校正和宇宙射线去除以确保光谱完整性。
【数据】激发波长：785 nm；激光功率：140 mW；曝光时间：3 s；累积次数：10次；波数范围：100–3200 cm−1；分辨率：1 cm−1
2.6 发酵液澄清
收获的发酵液使用自清洁碟片堆叠分离器（Alfa laval，瑞典）澄清。转鼓转速设为9000 rpm（转鼓半径处约8×10³ g），发酵液以75 L/h连续进料。分离器自动排渣（“charge”）循环每2 min排出浓缩固体，产生清澈的离心液（以下称渗透液）。渗透液无菌收集于预冷的硼硅酸盐玻璃瓶（DURAN®，Schott AG，Mainz，Germany）中，保持4°C。装满后立即用氮气吹扫瓶顶空以置换残余氧气，在萃取操作前尽量减少氧化降解。
【数据】转鼓转速：9000 rpm（约8×10³ g）；进料速率：75 L/h；排渣周期：2 min；温度：4°C
2.7 萃取操作
将澄清的渗透液转移至琥珀色带挡板烧瓶中，以溶剂与渗透液体积比5:1（v/v）加入单一疏水性溶剂（正己烷）。两相悬浮液在25 ± 1°C下搅拌30 min，然后倒入分液漏斗中静置分相。为去除溶剂层中的残余极性杂质，将无水乙醇以等于原始渗透液体积（1×V）的量直接加入漏斗中，轻轻倒置混合并定期排气，静置重新分层。待清晰界面重新形成后，排出并弃去下层乙醇相。纯化后的富含视黄醇的有机层进行浓缩……
【数据】溶剂与渗透液比：5:1（v/v）；温度：25 ± 1°C；搅拌时间：30 min；乙醇体积：1×V
研究结果
3.1 通过推-拉策略开发高产视黄醇菌株
本课题组此前报道，工程菌株CJ2104（携带3拷贝来源于Xanthophyllomyces dendrorhous的β-胡萝卜素生物合成基因Xd.crtYB-Xd.crtI、3拷贝来源于Haematococcus pluvialis的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）合酶基因Hp.GGPPS1，以及11拷贝来源于未培养海洋细菌66A03的BCO基因Mb.Blh，并附加其他基因修饰）在5-L生物反应器中产生4.86 g/L视黄醇。为进一步提高视黄醇产量，我们应用推-拉策略——通过增加乙酰-CoA可用性和甲羟戊酸（MVA）途径通量实现“推”，同时增强GGPP向β-胡萝卜素并最终向视黄醇的转化实现“拉”（图1）。
视黄醇产量在含60 g/L葡萄糖、补充0.05%（w/v）BHT和10%（w/v）吐温80的YPDUL60培养基的摇瓶培养中评估。尽管菌株CJ2104此前已针对MVA途径和β-胡萝卜素生物合成通量进行了工程改造，我们仍进一步增强了MVA途径中关键限速基因的表达。通过引入由强启动子驱动的额外基因组整合表达盒，内源ERG13（HMG-CoA合酶）、HMG1（HMG-CoA还原酶）和ERG12（甲羟戊酸激酶）基因被进一步过表达——ERG13置于EXP1启动子控制下，HMG1和ERG12置于TEFINt启动子控制下。所得菌株CJ2162产生557.4 ± 18.6 mg/L视黄醇，较CJ2104的458.1 ± 27.8 mg/L提高21.7%（图2a）。
为进一步增强β-胡萝卜素生物合成通量，将编码从异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）合成GGPP的三功能酶的Hp.GGPPS1在EXP1启动子控制下整合至CJ2162，同时以TEFINt启动子驱动Xd.crtYB和Xd.crtI，生成CJ2227。该修饰将视黄醇滴度提升至675.9 ± 10.2 mg/L，额外增加21.3%（图2a）。
在前期构建菌株CJ2104时，β-氧化途径的关键组分PEX10、MFE1和POT1基因被删除以增强脂滴中视黄醇的储存。然而，在视黄醇可被吐温80有效萃取的实验条件下，增加脂质产量可能与视黄醇生物合成途径竞争共享前体乙酰-CoA。因此，我们将PEX10、MFE1和POT1以单盒形式在其天然启动子下恢复，通过脂肪酸β-氧化增加乙酰-CoA可用性。所得菌株CJ2285产生949.3 ± 22.2 mg/L视黄醇，较CJ2227高40.5%。值得注意的是，恢复β-氧化并未损害生长——摇瓶培养条件下CJ2285的OD600高于CJ2227（134 vs. 118）（表S3）。与CJ2227相比，CJ2285还表现出更高的胞内视黄醇浓度（19.0 ± 2.1 vs. 10.9 ± 1.6 mg/L）、β-胡萝卜素浓度（16.2 ± 2.9 vs. 4.7 ± 1.7 mg/L）和角鲨烯浓度（241.9 ± 9.0 vs. 120.7 ± 4.6 mg/L），而胞内视黄醛降低（2.6 ± 1.6 vs. 5.3 ± 1.3 mg/L）。两种菌株的总视黄醛水平相近。这些结果表明，恢复β-氧化增强了乙酰-CoA来源的通量流向甲羟戊酸途径并改善了视黄醇生物合成，而非简单消耗胞内脂质储备。
在TEFINt启动子控制下引入额外拷贝的Xd.crtYB（菌株CJ2504）将视黄醇滴度提升至1266.2 ± 24.1 mg/L，提高33.4%。最后，POX2——一种优先氧化C18脂肪酸（解脂耶氏酵母中主要脂质种类）的酰基辅酶A氧化酶，此前在CJ2104中被删除——在其天然启动子下恢复表达，以通过β-氧化进一步增强乙酰-CoA供应。所得菌株CJ2532达到1464.2 ± 32.0 mg/L视黄醇，较CJ2504提高15.6%（图2a）。碳分配的变化反映在胞内角鲨烯水平上：在MVA或β-氧化通量增强的菌株中升高，而在β-胡萝卜素生物合成加强的菌株中降低（图S1）。在摇瓶培养中，CJ2532实现0.024 g/g葡萄糖的比产率，视黄醇产量较初始菌株CJ2104提高3.2倍（从458.1增至1464.2 mg/L）。
在补充0.05%（w/v）BHT和10%（w/v）吐温80的5-L发酵罐中培养时，CJ2532分泌了大部分产生的视黄醇。122.2 h后，胞外和胞内视黄醇水平分别达到6.28 g/L和0.28 g/L，总产量为6.56 g/L，大幅超过此前CJ2104的报告值（4.86 g/L）。视黄醇产率为0.026 g/g葡萄糖，生产率为0.054 g/(L·h)（图2b）。5-L发酵过程中pH、空气流量、温度和溶解氧（DO）等关键操作参数的时间曲线见图S9。
【数据】CJ2104产量：458.1 ± 27.8 mg/L；CJ2162产量：557.4 ± 18.6 mg/L（+21.7%）；CJ2227产量：675.9 ± 10.2 mg/L（+21.3%）；CJ2285产量：949.3 ± 22.2 mg/L（+40.5%）；CJ2504产量：1266.2 ± 24.1 mg/L（+33.4%）；CJ2532产量：1464.2 ± 32.0 mg/L（+15.6%）；OD600：134 vs. 118；胞内视黄醇：19.0 ± 2.1 vs. 10.9 ± 1.6 mg/L；β-胡萝卜素：16.2 ± 2.9 vs. 4.7 ± 1.7 mg/L；角鲨烯：241.9 ± 9.0 vs. 120.7 ± 4.6 mg/L；视黄醛：2.6 ± 1.6 vs. 5.3 ± 1.3 mg/L；比产率：0.024 g/g葡萄糖；5-L发酵：胞外6.28 g/L、胞内0.28 g/L、总计6.56 g/L；产率：0.026 g/g葡萄糖；生产率：0.054 g/(L·h)；时间：122.2 h
3.2 从发酵液中萃取视黄醇
显微分析显示，胞外视黄醇分散在培养上清液中的吐温80胶束内（图3a）。
由于胶束包裹阻碍了直接溶剂萃取，我们开发了一种将视黄醇分配至有机相的高效方法。发酵结束后，通过机械分离去除细胞，获得视黄醇纯度为4.9 ± 0.5%的渗透液。使用自清洁碟片堆叠分离器进行发酵液澄清导致约8–10%的视黄醇损失（基于过程质量平衡分析）。值得注意的是，澄清前后视黄醇浓度保持相近，仅从发酵液中刚收获时的7.1 g/L略微下降至澄清渗透液中的7.0 g/L。为萃取亲脂性组分，将500 mL正己烷与100 mL渗透液混合，25°C振荡30 min，用分液漏斗分相（图3b）。有机相蒸发后得到纯度为11.2 ± 0.7%、回收率为36.8 ± 0.9%的视黄醇组分（图3d）。回收率偏低表明相当一部分视黄醇仍留在水层中。该损失归因于吐温80的高亲水-亲油平衡值（HLB = 15.0），使其对水相的亲和力强于对正己烷的亲和力。因此，吐温80/视黄醇胶束保留在水相中，限制了视黄醇向正己烷的萃取（图3c）。
我们假设破坏胶束可使吐温80保留在水相，而游离视黄醇分配至溶剂中。乙醇能够扰动水结构并增加吐温80的亲水性，可穿透界面膜并使胶束解体（图3c）。初步试验表明，向渗透液/正己烷混合物中添加乙醇促进了视黄醇从下层水相转移至有机相（图3e）。基于该结果，向100 mL渗透液和500 mL正己烷的混合物中加入100 mL乙醇，随后分相（图3b）。在此条件下，视黄醇回收率显著提高至94.4 ± 0.4%，纯度提升15.3 ± 0.8%，证实大部分视黄醇迁移至正己烷层（图3d）。
还使用乙酸乙酯（一种被认为比正己烷更环保的溶剂）进行了视黄醇萃取。不添加乙醇时视黄醇回收率约为46.3 ± 0.7%，与单独使用正己烷萃取相当，但添加乙醇后升至97.3 ± 0.5%（图S2a）。然而，正己烷被认为更适合实现更高的视黄醇纯度，因此后续研究使用正己烷作为萃取溶剂。
【数据】渗透液纯度：4.9 ± 0.5%；澄清损失：约8–10%；浓度变化：7.1→7.0 g/L；正己烷/渗透液比：5:1；萃取纯度：11.2 ± 0.7%；回收率：36.8 ± 0.9%；加乙醇后回收率：94.4 ± 0.4%；纯度提升：15.3 ± 0.8%；乙酸乙酯回收率：46.3 ± 0.7%（无乙醇）、97.3 ± 0.5%（加乙醇）；HLB：15.0
3.3 通过视黄醇发酵改善视黄醇纯度
（后续结果内容——原文节选在此处截断，后续部分未提供，以下内容忠实呈现原文已给出的信息）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究展示了涵盖菌株构建、下游加工、原型制剂、产品评价和生命周期评估（LCA）的整合示范，证实了生物视黄醇在技术上的可行性与环境上的优势。通过对前期开发的视黄醇生产菌株CJ2104施加协调的推-拉代谢工程策略，代谢通量被有效重定向至视黄醇生物合成。“推”策略聚焦于通过增强MVA途径和增加GGPP可用性来强化前体供应，同时恢复脂质降解进一步扩大了乙酰-CoA库。在下游，“拉”通过加强β-胡萝卜素生物合成途径实现，促进中间体向视黄醇的高效转化。这些组合工程策略凸显了在视黄醇生产中平衡前体供应、途径容量和竞争性代谢汇的重要性。所得菌株CJ2532在摇瓶条件下较亲本菌株CJ2104视黄醇产量提高约3.2倍。通过在培养基中补充非离子表面活性剂吐温20，5-L生物反应器中实现了7.16 g/L视黄醇滴度（6.79 g/L胞外和0.37 g/L胞内）和0.029 g/g葡萄糖产率，代表了解脂耶氏酵母中视黄醇生产具有竞争力的滴度与产率。
编译者解读
该研究的核心价值在于将代谢工程与下游加工视为一个耦合系统进行协同设计——吐温80虽有利于发酵过程中的产物回收，却因高HLB值阻碍了后续溶剂萃取，而改用更亲水的吐温20后纯化效率显著提升。这种“发酵条件与下游工艺共设计”的思路对不稳定化合物的生物制造具有普适借鉴意义。从合成生物学应用角度看，7.16 g/L的滴度已达到工业化竞争区间，但48.6%的最终纯度距离商业级视黄醇（通常>95%）仍有较大距离，后续纯化步骤的能耗与成本将是产业化落地时需要重点考量的因素。此外，LCA量化碳足迹的做法值得推广——生物制造不能只追求滴度，还需用全生命周期视角审视过程的环境负担。
参考来源
期刊：New Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.06.003
DOI: 10.1016/j.nbt.2026.06.003