来源：Macromol Biosci | 编译：DNA Lab Space
导语
在人造细胞与合成生物学的交叉前沿，如何构建具有类细胞结构和响应功能的微隔室一直是研究热点。近期，Gao等人在《Macromolecular Bioscience》上报道了一种基于天然蛋白与温敏聚合物偶联物自组装形成的蛋白质体，并在其内部成功实现了无细胞蛋白质表达。该策略将牛血清白蛋白等天然蛋白质与聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）共价连接，制备出兼具蛋白质体膜基本特征和温度响应性的杂合微囊泡，为人造细胞系统的构筑提供了新的材料平台。
1. 研究背景
自下而上构建具有生命特征的人工细胞是合成生物学的重要目标之一。在众多仿生隔室中，由蛋白质-聚合物偶联物自组装形成的蛋白质体（proteinosomes）因其结构可调、功能可设计的特点而备受关注。传统的蛋白质体多通过化学交联或基因工程改造的蛋白质与合成高分子偶联来制备，其中所用的蛋白质往往需要复杂的纯化、修饰或重组表达过程，在一定程度上限制了其制备的便捷性和广泛应用。
聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）是一种典型的温敏性聚合物，其低临界溶解温度（LCST）约为32°C，接近生理温度。当温度低于LCST时，PNIPAAm链呈伸展亲水状态；高于LCST时，链段发生急剧的构象坍缩并疏水化。这一特性已被广泛用于水凝胶、药物递送和生物传感等领域。若能将未经基因改造的天然蛋白质直接与PNIPAAm偶联，并利用这些偶联物构建蛋白质体，则有望在简化制备流程的同时，将温度响应的动态调控功能引入人造细胞隔室。
与此同时，无细胞蛋白质表达（cell-free protein expression, CFE）系统作为一种只保留转录翻译核心机器而不依赖活细胞的体外合成体系，近年来在人造细胞研究中发挥了关键作用。将CFE系统封装到脂质体、聚合物囊泡或蛋白质体内，能够在微隔室中原位合成功能蛋白，赋予隔室“活”的功能。然而，如何在温和条件下将CFE系统有效包裹进蛋白质体，并使蛋白质体膜具备可控的通透性以允许小分子营养物质或底物的跨膜扩散，仍然是一个挑战。
针对上述问题，Gao等人提出了一种简单、通用的策略：直接利用商品化的天然蛋白（如牛血清白蛋白，BSA）与PNIPAAm-COOH进行共价偶联，获得天然蛋白-PNIPAAm偶联物，然后通过乳液转移法将其组装成蛋白质体。该蛋白质体不仅能封装CFE系统并实现内部绿色荧光蛋白（eGFP）的高效合成，还可通过改变温度调控膜的通透性，从而控制物质交换。这一工作为快速构建刺激响应型人造细胞提供了简洁有效的新思路。
2. 研究方法
本研究的实验路线主要分为三大部分：天然蛋白-PNIPAAm偶联物的合成与表征、蛋白质体的制备与封装、以及无细胞表达功能验证。
偶联物合成：作者首先合成了末端为羧基的PNIPAAm（PNIPAAm-COOH）。以N-异丙基丙烯酰胺为单体，通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合得到分子量分布窄的聚合物，随后对端基进行改性引入羧基。之后，在1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）的活化下，将PNIPAAm-COOH的羧基与天然蛋白质（主要是BSA）表面的伯胺基团发生酰胺化反应，得到BSA-PNIPAAm偶联物。通过调节投料比，可以控制每个蛋白分子上连接的PNIPAAm链的数目。偶联物经透析或超滤纯化后，采用凝胶电泳、动态光散射（DLS）和浊度法等对其大小、LCST行为等进行表征。
蛋白质体制备：采用经典的油包水乳液转移法。首先将BSA-PNIPAAm偶联物溶于磷酸盐缓冲液中作为水相，以含表面活性剂的2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）的油相为连续相，通过超声波或手摇振荡形成油包水（W/O）乳液。此时偶联物自发富集在水-油界面，形成一层蛋白-聚合物膜。然后，通过向乳液中加入乙醇或离心破乳，将包覆有偶联物膜的水滴转移到另一水相中，形成水包水结构的蛋白质体。通过荧光标记偶联物或跨膜染料，在共聚焦激光扫描显微镜下确认蛋白质体的形成及膜完整性。此外，通过调节偶联物浓度、油水比和乳化方式，可调控蛋白质体的大小和膜厚度。
无细胞系统封装与表达：将大肠杆菌来源的商品化无细胞蛋白质表达试剂盒（包含RNA聚合酶、核糖体、氨基酸、能量再生系统等）与编码增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的质粒DNA混合后，作为内水相用于制备蛋白质体。封装完成后，将蛋白质体分散在合适的缓冲液中，在适宜温度（通常为29-30°C，略低于LCST）下孵育。通过荧光显微镜、共聚焦成像和流式细胞术监测整个群体的荧光强度变化，以评估eGFP在蛋白质体内部的表达水平。为验证温度响应性，实验还对比了不同温度下的表达效率和膜通透性变化，以及利用温控循环来调节小分子底物或产物的跨膜扩散。
3. 研究结果
研究团队成功合成了BSA-PNIPAAm偶联物并组装出结构明确的蛋白质体，进而证实了其内部可进行高效的无细胞蛋白质表达，同时展示了该蛋白质体的温度响应性行为。
首先，偶联物的DLS和浊度测试结果表明，BSA-PNIPAAm保留了PNIPAAm应有的温敏特性，其LCST大约在31-33°C之间。当温度升高至LCST以上时，偶联物水溶液迅速变浑浊，表明PNIPAAm链段发生坍塌并形成疏水性聚集体。凝胶电泳证明PNIPAAm链确实共价连接到了BSA分子上，且接枝密度可通过反应物配比进行调节。这些偶联物被成功用于蛋白质体的制备。
共聚焦显微镜图像清晰地显示出大小为数微米至数十微米的球形囊泡结构，膜层光滑且连续。通过对膜进行荧光标记（如用荧光染料标记偶联物或通过FITC-BSA偶联物），可以观察到一圈明亮的荧光环，证实蛋白质体膜主要由BSA-PNIPAAm偶联物构成。通过改变制备条件，蛋白质体的平均直径可以在5~50 μm范围内进行调节，并且可在室温下保持数天的结构稳定性。
无细胞表达实验是核心亮点。封装了eGFP表达质粒与CFE体系的蛋白质体在29°C孵育数小时后，共聚焦显微镜下观察到蛋白质体内部逐渐出现明亮的绿色荧光，且荧光仅局限于囊泡内腔，背景溶液中几乎检测不到荧光。这表明eGFP在蛋白质体内部被成功转录和翻译，且合成的eGFP蛋白分子由于尺寸较大，难以通过致密的蛋白质体膜泄漏到外部。随着孵育时间的延长，囊泡内荧光强度持续增加，动力学曲线类似于在管式反应器中的CFE反应，说明蛋白质体膜对小分子底物（氨基酸、NTP等）具有良好的通透性，而大分子产物则被有效截留。
温度响应性调控是本研究的另一个重要发现。当温度升高至约35°C（高于PNIPAAm的LCST）时，蛋白质体膜所在的PNIPAAm链段发生塌缩，导致膜的结构变得更加紧凑甚至出现部分微区收缩。利用小分子荧光染料的扩散实验观察到，此时跨膜通透性显著降低。这一性质被巧妙地应用于无细胞表达的控制：在29°C启动表达后，若将温度短暂升至35°C，则外部小分子营养物的进入受到抑制，从而可减缓甚至终止内部的蛋白质合成；而重新降温至29°C后，膜通透性部分恢复，表达又可重新启动。这种可逆的“开-关”调控为构建响应人造细胞提供了直接证据。此外，偶联物中蛋白部分保持了天然构象，这可以通过圆二色光谱等初步验证，表明天然蛋白在偶联和组装过程中并未完全变性，这对其未来的生物功能化拓展至关重要。
团队还考察了不同天然蛋白的适用性。除了BSA，他们还尝试了卵清蛋白、溶菌酶等几种商品化蛋白与PNIPAAm偶联，均能成功制备出蛋白质体，并可封装CFE系统实现蛋白质表达。这说明该策略具有一定的普适性。
4. 讨论与展望
该项研究的最大创新之处在于绕过了繁琐的蛋白质工程或重组表达步骤，直接使用成本低廉、来源丰富的天然蛋白质与温敏性PNIPAAm偶联，以简捷的乳液转移方法构筑出功能完备的蛋白质体。这大大降低了人造细胞隔室的制备门槛，也为高通量筛选和并行化实验提供了可能。
在材料设计层面，BSA-PNIPAAm偶联物同时发挥了蛋白质的结构支撑作用和聚合物的刺激响应特性。蛋白质组分使得膜具有类似细胞骨架的致密性和一定的半透性，能够截留大分子而允许小分子通过；PNIPAAm组分则赋予膜可逆的温度响应开关功能。这种双组分协同机制在以往的脂质体或纯聚合物囊泡中难以实现。未来，通过改变聚合物的种类（如引入pH响应、光响应链段）或采用具有特定结合功能的天然蛋白，可以定制化地实现多重刺激响应和底物选择性转运。
在应用前景方面，基于此类蛋白质体的无细胞表达平台有望作为微型生物反应器，用于合成毒性蛋白、膜蛋白或复杂代谢产物，因为隔室化避免了产物对宿主细胞的毒性并简化了纯化流程。同时，通过温度精确操控基因表达的开停，可在微流控环境下实现程序化的多步酶级联反应和信号传导。这一体系还有潜力作为人工细胞模型，用以研究拥挤环境下的基因表达动力学和蛋白质相分离等基础生物学问题。
当然，该体系仍面临若干挑战：蛋白质体膜的渗透性目前仍属于被动扩散，缺乏选择性通道；所表达蛋白质的功能和构象深入表征有待加强；内部无细胞系统的长期稳定性及重复利用性仍需优化。此外，如何在高表达量的情况下维持蛋白质体的完整性，以及如何实现蛋白质体之间的化学通讯，也是未来值得探索的方向。
总体而言，该研究为蛋白质体的简便构筑和温控无细胞合成提供了概念验证，将温敏聚合物与天然蛋白巧妙融合，为新一代刺激响应人造细胞系统的开发奠定了坚实的方法学基础。
参考来源
Gao M, Wang D, Wilsch-Bräuninger M, Leng W, Schulte J. Cell Free Expression in Proteinosomes Prepared from Native Protein-PNIPAAm Conjugates. Macromolecular Bioscience, DOI: 10.1002/mabi.2024xxxx（详询期刊官网最新卷期）.