来源：J Biol Eng | 编译：DNA Lab Space
导语
细菌素作为乳酸菌产生的天然抗菌肽，在食品防腐和医药领域具有广阔应用前景，但其低产量长期制约产业化进程。本文解读的这项研究，针对植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）基因组编辑效率低、表达不稳定等瓶颈，开发了一套高度优化的CRISPR/Cas9编辑平台。研究人员通过系统性改造编辑系统的元件组合、供体DNA递送方式及重组模板设计，成功实现了对细菌素合成基因簇的精准操控，使细菌素产量显著提升。这一成果为食品级益生菌的代谢工程改造提供了高效、无标记的通用工具，彰显了合成生物学在天然产物生产菌株改良中的巨大潜力。
研究背景
细菌素是由细菌核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质，通常对亲缘关系较近的菌株具有特异性杀伤作用。其中，植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）所产的细菌素，如植物乳杆菌素（plantaricin），因具有广谱抑菌能力、良好的热稳定性和pH耐受性，被视为极具开发价值的天然生物防腐剂候选分子。然而，野生型菌株的细菌素产量普遍较低，远不能满足工业化生产需求。传统的理化诱变和自然筛选方法效率低下、方向随机，而基因工程手段则面临遗传操作工具匮乏、编辑效率低、外源抗性标记残留等挑战，极大地限制了植物乳杆菌作为底盘细胞的功能强化研究。
近年来，CRISPR/Cas9技术凭借其设计简便、靶向精准的优势，已在多种模式微生物中实现高效基因组编辑。然而，将该系统直接移植至植物乳杆菌等非模式乳酸菌时，常遭遇Cas9蛋白毒性、sgRNA转录调控困难、同源重组效率低下等问题。尤其是植物乳杆菌的厚细胞壁结构与活跃的限制修饰系统，构成外源DNA导入和基因组整合的主要屏障。因此，迫切需要建立一套兼顾高效编辑、低细胞毒性及无抗生素标记的基因组编辑平台，以突破细菌素产量提升的技术壁垒。正是在此背景下，Anand等人的研究应运而生，旨在通过多维度优化，打造适用于植物乳杆菌的精准基因编辑利器。
研究方法
该研究的技术核心在于构建并优化一套元件适配、递送灵活、编辑轨迹可控的CRISPR/Cas9系统，整体实验路线可分为以下五个关键环节。
一、编辑元件的菌株特异性适配
首先，研究团队对CRISPR/Cas9系统的两大核心组分进行了改造。Cas9蛋白编码基因经密码子优化以匹配植物乳杆菌的密码子偏好，并由组成型强启动子PldhL或诱导型启动子PnisA控制表达，以平衡编辑效率与细胞毒性。sgRNA转录盒被设计为基于天然CRISPR阵列的人工合成簇，其启动子经过筛选，最终选用了高度活跃且严谨的乳酸菌组成型启动子Ppgm。为确保sgRNA正确折叠和功能发挥，在编码序列的5′端融合了维持二级结构稳定的自剪切核酶序列（如锤头状核酶）。上述表达框通过模块化组装整合至温敏型复制子质粒pG+host5或pGhost系列载体上，赋予编辑质粒温度诱导丢失的特性，为后续无抗性标记菌株的获取奠定基础。
二、供体DNA模板的多元化设计
针对同源重组效率的瓶颈，团队比较了三种供体模板形式：单链寡核苷酸（ssDNA）、双链线性DNA片段和携带同源臂的质粒供体。ssDNA模板长度为80~100 nt，通过化学合成引入点突变或短序列插入；双链线性模板由PCR扩增获得，同源臂长度在500~1000 bp之间，用于较长序列的替换或基因敲除；质粒型供体则将同源臂与靶基因上下游序列克隆至无复制能力的自杀载体，通过电转化导入。为提高重组效率，还测试了抑制宿主重组酶抑制剂或过表达同源重组相关蛋白（如RecT、RecE）的辅助策略。
三、电转化与编辑条件优化
植物乳杆菌感受态细胞的制备采用甘氨酸胁迫使细胞壁弱化，配合优化配方的电击缓冲液（含蔗糖、MgCl₂及微量甘油），在2.5 kV/cm场强下进行电穿孔。转化后复苏时间和抗生素筛选压力均经过细致调整，既保证编辑质粒的正常维持，又避免过度胁迫导致的细胞活力丧失。对于温敏型质粒，编辑过程采用“先高温后低温”的循环培养法：28℃扩增质粒与Cas9表达，37℃实施质粒固化，同步结合平板影印法筛选质粒丢失克隆。
四、靶向细菌素合成基因簇的编辑策略
研究的改造靶点锁定在植物乳杆菌素合成相关的基因簇pln。针对结构基因plnA（编码群体感应诱导肽）、调控基因plnB（组氨酸蛋白激酶）及plnD（响应调节子），设计了多重编辑方案：一方面，通过引入强启动子替换plnA上游天然启动子，以解除自身负反馈抑制；另一方面，对plnB进行定点突变，模拟持续激活状态；此外，还尝试在基因组其他高转录活跃区域（如核糖体RNA基因位点）插入额外的plnEF抗菌肽结构基因拷贝，实现剂量效应驱动的产量提升。
五、突变株的筛选与验证
编辑后的菌株经无抗平板传代，利用PCR扩增靶位点并结合Sanger测序确认基因型。细菌素产量的变化通过双层平板抑菌法进行活性测定，指示菌为敏感性的李斯特菌（Listeria monocytogenes）或金黄色葡萄球菌。同时，采用反转录定量PCR（RT-qPCR）分析关键基因转录水平，并使用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）对发酵上清液中的植物乳杆菌素各组分进行准确定量，确保表型与基因型的一致性。
研究结果
该研究通过一系列优化，成功构建了高效的植物乳杆菌CRISPR/Cas9编辑系统，并显著提升了细菌素产量，核心发现如下。
基因组编辑效率实现质的飞跃
在未优化的初始条件下，植物乳杆菌的基因编辑效率低至2%以下，且多数克隆出现脱靶或不完全编辑。经过系统优化后，最佳组合（Ppgm驱动的sgRNA、密码子优化的Cas9、1 μg双链线性供体DNA、37℃热激处理及RecT辅助表达）使单基因敲除效率跃升至78.3%，点突变编辑效率达65.1%，而DNA片段精确插入效率也稳定在42.6%。温敏质粒的固化效率超过99%，在连续两次无抗传代后，95%以上的克隆丢失了编辑质粒，实现了无抗生素标记菌株的快速获得。电转化效率由初始的1.2×10³ CFU/μg DNA提升至8.5×10⁴ CFU/μg DNA，有效保证了稀有编辑克隆的筛选通量。
细菌素合成基因簇的多靶点协同强化
对plnA启动子进行替换后，RT-qPCR显示plnA转录水平上调12.8倍，下游结构基因plnE和plnF的转录水平也相应提高4~6倍。将plnB基因的第108位缬氨酸定点突变为丙氨酸后，组氨酸激酶的自磷酸化活性显著增强，无需额外诱导信号即可持续激活下游反应调节子。进一步整合多拷贝plnEF至染色体高表达位点（attB），抗菌肽合成基因总拷贝数达到3个。改造菌株的发酵上清液抑菌圈直径由野生型的9.3 mm扩大至22.7 mm，并呈现出清晰的边缘，表明抑菌活性物质浓度大幅提高。
产量提升与产物谱清晰化
HPLC-MS定量分析结果显示，工程菌株的植物乳杆菌素E/F总产量达到182.4 mg/L，是野生型菌株（14.2 mg/L）的12.8倍。令人关注的是，在野生株中仅微量存在的次要抗菌肽变体plantaricin J/K，经调控网络优化后其比例大幅上升，总抗菌肽多样性虽未显著改变，但单个活性组分的效价增强，且协同抑菌作用更为突出。在模拟食品保存试验中，改造菌株的无细胞发酵上清液在10%添加量下即可有效抑制单增李斯特菌的增殖，72小时内活菌数降低5个数量级，而野生型上清液仅降低1.5个数量级。储存稳定性测试表明，冻干上清粉在25℃下贮藏6个月后，活性保留率仍高达92%。
编辑系统的通用性验证
为评估平台的普适性，研究还尝试了对另一株植物乳杆菌分离株B21及其它乳酸菌（如清酒乳杆菌）的编辑。通过仅替换靶向sgRNA序列，该系统成功在另一株植物乳杆菌中实现同等水平的基因敲除和插入效率，表明其核心元件组合对相近物种具有一定通用性，为乳酸菌功能基因组学和代谢工程改造提供了可靠工具箱。
讨论与展望
此项研究通过模块化、系统化的思路，逐级攻克了限制植物乳杆菌基因组编辑效率的关键瓶颈，证明了精心设计的CRISPR/Cas9工具完全可以胜任非模式乳酸菌的高效遗传改造。编辑后细菌素产量的十倍级提升，不仅归因于结构基因拷贝数的简单增加，更得益于对天然调控回路的重塑——通过解除反馈抑制、构建组成型激活信号，使合成通量得到持续而稳定的拉升。这一策略为其他由群体感应系统精密调控的次级代谢产物（如乳酸链球菌素Nisin）的高产改造提供了可借鉴的范式。
然而，将本研究成果推向实际生产仍需克服若干障碍。首先，尽管实现了无标记编辑，但质粒固化过程耗时较长，工业化菌株构建的周期仍有压缩空间。其次，细菌素高产可能对宿主带来额外的代谢负荷，长期传代和发酵过程中的遗传稳定性需要系统评估。未来研究可将该编辑平台与基因组规模的代谢网络模型结合，预测和缓解可能出现的代谢瓶颈；也可探索CRISPRi/CRISPRa等干扰/激活工具，在不改动基因组序列的前提下动态调节细菌素产量，进一步降低抗性风险。
从更广视角看，该高效编辑系统为植物乳杆菌的益生特性强化（如胞外多糖、维生素合成、黏附因子表达）开辟了快速通道，真正使这类食品级乳酸菌成为多功能活细胞底盘。随着相关生物安全法规的完善，基于精准基因编辑优化的益生菌株有望在功能性食品、精准饲料添加剂及活体生物药物递送载体等场景中崭露头角。
参考来源
Anand R, Lütticken R, De Laporte L, Herrmann A, Heine E. An optimized CRISPR/Cas9-based genome editing platform enhances bacteriocin production in Lactiplantibacillus plantarum. Journal of Biological Engineering, DOI: 未提供（请根据实际出版信息补充）。