来源：Metab Eng Commun | 编译：DNA Lab Space
导语
N,N-二甲基色胺（DMT）是一种具有强致幻活性的天然色胺类化合物，近年来在难治性抑郁症等精神疾病的临床研究中备受关注。然而，DMT的天然来源有限，化学合成又存在步骤繁琐、产率低等问题。近期，研究人员在大肠杆菌中成功重构了DMT生物合成的两步酶促途径，打通了从色氨酸到DMT的微生物合成路线，为DMT的绿色、可持续生产提供了新思路。
研究背景
DMT属于内源性色胺衍生物，广泛存在于多种植物和动物体内，也是南美传统致幻剂死藤水的主要活性成分。作为一种5-HT2A受体激动剂，DMT能够在短时间内诱发深刻的意识状态改变，近年来在精神疾病治疗领域显示出巨大潜力，尤其是针对难治性抑郁症和创伤后应激障碍的快速缓解效应，已进入多阶段临床试验。然而，DMT的获取方式仍然面临挑战：植物提取效率低、周期长，且受地理和季节限制；化学全合成则需要昂贵试剂和多步保护/脱保护操作，总收率不理想。因此，利用合成生物学手段，在微生物底盘细胞中异源重建DMT生物合成途径，有望实现其低成本、高纯度、可规模化的生产。
DMT在植物体内的生物合成途径早已阐明：首先，L-色氨酸经芳香族氨基酸脱羧酶（TDC）催化脱羧生成色胺；随后，色胺在吲哚乙胺-N-甲基转移酶（INMT）的催化下，依次接受两个S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基，生成N-甲基色胺（NMT），进而生成DMT。尽管该途径仅涉及两个酶，但此前在微生物中的异源表达研究依然有限，尤其是负责双甲基化的INMT酶在细菌中的功能性表达存在困难，导致DMT的微生物合成产量极低甚至无法检出。因此，如何在细菌中高效重构这一“两步途径”，并实现各酶的可溶性表达与协同催化，是该研究要解决的核心问题。
研究方法
在该研究中，作者采用合成生物学的标准化模块化策略，对DMT生物合成途径进行设计、构建与优化。实验技术路线主要包括以下几个关键环节。
首先是途径设计与基因合成。作者选择来源于植物的TDC和INMT基因为目标功能元件。为了避免密码子偏倚影响异源表达，研究人员根据大肠杆菌的密码子使用频率，对植物来源的基因序列进行了密码子优化，并交由商业公司合成全长基因。之后，利用标准化的BsaI/BsmBI酶切位点，通过Golden Gate组装方法，将目的基因分别克隆至具有不同复制起点和抗性标记的质粒中，形成独立的TDC表达载体和INMT表达载体。这种双质粒共表达系统允许独立调控两个基因的转录水平，便于后续优化。
其次，作者在转录层面引入了多种表达调控元件。为了筛选最佳表达强度，他们将TDC和INMT分别置于不同的启动子控制之下，包括强组成型启动子（如T7启动子）和诱导型启动子（如araBAD、lacUV5等），同时测试不同核糖体结合位点（RBS）序列对翻译效率的影响。通过组合不同强度的启动子和RBS，构建了一系列表达强度各异的重组质粒，并逐一转入大肠杆菌宿主菌株中。
第三，研究人员对培养条件与诱导策略进行了系统优化。他们在含有适量色氨酸的M9最小培养基中培养重组菌株，于对数期加入诱导剂（如IPTG或阿拉伯糖），并考察了不同诱导温度（16℃、25℃、37℃）、诱导时间（6至48小时）、辅因子前体（如甲硫氨酸）添加量以及底物色氨酸的浓度对产物积累的影响。培养结束后，离心收集发酵上清液和菌体破碎液，用于产物提取。
第四，产物检测采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法。作者以DMT、NMT和色胺的标准品建立校正曲线，通过多反应监测模式（MRM）对培养液中的目标代谢物进行定性和定量分析。同时，利用衍生化处理方法提高色胺类化合物的色谱分离度，确保DMT与NMT、色胺等结构类似物能够准确区分。此外，为验证酶在细菌内的实际催化功能，作者还进行了体外酶活实验：将纯化的重组TDC和INMT蛋白与相应底物在体外反应体系中孵育，通过检测产物的生成来确认酶的催化活性和特异性。
研究结果
研究结果表明，通过合理设计的两步酶促途径，大肠杆菌能够成功实现DMT的生物合成，并且通过系统优化显著提高了产物产量。
首先，在途径验证阶段，作者发现单独表达TDC的工程菌株能够将培养基中的L-色氨酸高效转化为色胺。在培养24小时后，胞外色胺浓度达到较高水平，证明植物来源的TDC在大肠杆菌中具有良好活性。然而，单独表达INMT的菌株并不能直接从色氨酸产生DMT，这是因为INMT的天然底物是色胺，而大肠杆菌自身缺乏合成色胺的能力。这一结果符合预期，也说明必须将两个酶串联起来才能完成从色氨酸到DMT的完整转化。
随后，在共表达TDC和INMT的双质粒工程菌中，作者成功检测到了DMT和中间产物NMT的生成。这表明INMT不仅在大肠杆菌中实现了可溶性表达，而且能够催化色胺发生连续的两次N-甲基化反应。值得注意的是，色谱图中DMT峰面积显著高于NMT，提示第一步甲基化产生的NMT被迅速转化为DMT，说明INMT对NMT的底物亲和力较高，途径中的限速步骤可能在于色胺的供给速率，而非甲基化反应本身。
为了进一步提高DMT产量，作者对表达系统进行了精细调控。他们发现，使用中等强度的组成型启动子表达TDC，同时使用诱导型启动子表达INMT，可以在两种酶之间实现更均衡的活性配比。当TDC表达过强时，色胺过度积累，反而抑制细胞生长并降低DMT产量；而当INMT表达过强时，甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）可能被大量消耗，导致甲基化循环压力增加。因此，平衡两个酶的表达水平是提高DMT产量的关键。
在最佳条件下（30℃诱导24小时，添加5 g/L色氨酸和1 g/L甲硫氨酸），重组菌株的DMT产量达到每升培养液数十毫克的水平，这是目前文献报道的微生物合成DMT的最高产量之一。同时，该菌株还表现出良好的传代稳定性，在连续传代50次后，DMT产量没有明显下降，说明异源途径的遗传稳定性良好。此外，规模化的摇瓶放大实验表明，在3 L发酵罐中，通过简单的补料分批策略，DMT产量可进一步得到提升，显示出一定的工业化应用潜力。
讨论与展望
该研究成功地在细菌中重构了DMT生物合成的两步途径，验证了植物来源TDC和INMT在大肠杆菌中的功能兼容性。这一结果不仅再次确证了DMT天然合成途径的酶学机理，也为其他色胺类衍生物的微生物异源合成提供了可借鉴的框架。研究还系统揭示了基因表达强度与代谢通量之间的平衡对最终产量的重要影响，对于合成生物学中多酶途径的优化具有普遍参考价值。
然而，目前DMT的微生物合成仍存在不足。例如，INMT对SAM的依赖导致发酵过程中需要外源添加甲硫氨酸，而大量补充甲硫氨酸会增加成本；同时，DMT本身对宿主细胞可能具有一定的毒性或反馈抑制作用，这限制了产物浓度的进一步提高。未来可通过定向进化改造INMT的催化活性和底物特异性，增强SAM再生通路以提升甲基供体供应，以及利用原位萃取技术及时移除DMT。此外，在更安全的GRAS级宿主（如酿酒酵母）中重构该途径，并探索全细胞催化合成DMT的连续流工艺，也将是下一步值得关注的研发方向。该研究为DMT的产业化生物制造奠定了一定的实验基础，有望推动其在精神疾病治疗领域中的实际应用。
参考来源
期刊：Metab Eng Commun
DOI：未提供（原文信息未标注DOI）
论文题目：Reconstituting a two-step pathway for N,N-dimethyltryptamine (DMT) biosynthesis in bacteria.
作者：Junges LH, Pontes FLD, Mota FJT, Passaglia Bruschi G, Bonaldi MPF