来源：Valorization of orange and banana peels through Yarrowia lipolytica solid-state and semi-solid fermentation（Biocatalysis and Agricultural Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
水果加工每年产生大量富含营养的副产物——橙皮与香蕉皮，但低蛋白含量限制了其作为食品或饲料原料的应用。本研究以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）W29为发酵菌株，系统评估了固态发酵与半固态发酵对两种果皮营养谱的改善效果。通过混料实验设计优化底物配比，结合pH调节与氮源补加策略，蛋白含量最高提升逾200%。该工作首次直接比较了Y. lipolytica在两种发酵模式下的表现，为果皮类低值生物质的高值化利用提供了新路径。
研究背景
香蕉是2022年全球产量最高的水果，达1.35亿吨，橙子以7600万吨紧随其后（FAO, 2022）。果蔬加工业产生大量副产物，而全球人口增长进一步推高了水果消费，导致大量不可食用组分——茎、果皮、种子等成为废弃物。以香蕉为例，约60%为可食果肉、40%为果皮，一箱18公斤的香蕉可产生约7公斤果皮。这些副产物仅少量用作牲畜饲料，大部分被填埋或焚烧，造成温室气体排放及土壤与地表水污染风险。橙皮（OP）和香蕉皮（BP）本身富含碳水化合物、粗纤维、脂质、矿物质、果胶及植物化学物，但蛋白含量偏低，限制了其作为日常营养源的价值。微生物发酵增值化处理是改善其营养品质的可行策略——细菌和丝状真菌在此方面的应用已有较多报道，而酵母的研究相对空白。
研究方法
2.1 原料准备
橙皮和香蕉皮收集自公立学校食堂，经清洗后使用食品加工机粉碎（粒径0.5–1 cm），于−20°C保存备用。麦麸（WB，Próvida-produtos naturais品牌）为干燥粉末，购自葡萄牙Celeiro公司，室温保存。大豆糖蜜由芬兰某公司提供，分装于1-L聚乙烯瓶中，−20°C冷冻保存备用。果皮与麦麸的初始水分、蛋白、脂质、碳水化合物、还原糖、果胶、粗纤维及灰分含量均进行了表征（原文表1）。
【数据】粒径：0.5–1 cm；保存温度：−20°C（果皮/糖蜜）；室温（麦麸）；原料表征指标：水分、蛋白、脂质、碳水化合物、还原糖、果胶、粗纤维、灰分
2.2 菌株与保藏
Yarrowia lipolytica W29（ATCC 20460）在YPD培养基（10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨、20 g·L⁻¹葡萄糖）中于27°C、200 rpm条件下培养19 h，用于制备冷冻保藏管——无菌微量管中加入800 μL酵母培养液和200 μL 99.5%纯度甘油。冷冻保藏管于−80°C保存至预接种物制备。
【数据】菌株：Y. lipolytica W29（ATCC 20460）；培养基：YPD（10 g·L⁻¹酵母提取物、20 g·L⁻¹蛋白胨、20 g·L⁻¹葡萄糖）；温度：27°C；转速：200 rpm；时间：19 h；甘油浓度：99.5%；保存温度：−80°C
2.3 果皮固态发酵（SSF）
固态发酵在27°C静态培养箱中进行，使用250-mL锥形瓶装载香蕉皮或橙皮作为底物（5 g干果皮）。初始水分含量调节至90%，随后于121°C灭菌15 min。酵母细胞在YPD中培养19 h（接种1管冷冻保藏物，27°C、200 rpm），离心后用PBS缓冲液重悬，获得浓缩细胞悬液（DO₆₀₀ₙₘ ≈ 14）。每瓶加入1 mL该细胞悬液，使初始细胞密度约为每克果皮（干基）20 mg细胞。
【数据】底物量：5 g干果皮；初始水分：90%；灭菌条件：121°C、15 min；预培养时间：19 h；温度：27°C；转速：200 rpm；接种量：1 mL浓缩悬液（DO₆₀₀ₙₘ ≈ 14）；初始细胞密度：约20 mg·g⁻¹干果皮
#### 2.3.1 混料实验设计
采用单纯形质心混料设计，确定果皮与麦麸的最优混合比例以最大化酵母生物量。实验变量为橙皮（OP，x₁）、香蕉皮（BP，x₂）和麦麸（WB，x₃）。所有实验的水分、接种和培养参数均按上述方法执行。共进行9组实验（中心点3次重复），三个独立变量分别设0%、100%、50%和33.33%（w/w）不同浓度，干物质总量5 g。响应变量为生物量浓度变化（ΔBiomass，单位g·g⁻¹）和蛋白变化（ΔProtein，%），计算方式为发酵终值与初始值之差。实验数据经多元回归分析，分别得到三次模型（式1）和二次模型（式2）：
式1：Y = β₁x₁ + β₂x₂ + β₃x₃ + β₁₂x₁x₂ + β₁₃x₁x₃ + β₂₃x₂x₃ + β₁₂₃x₁x₂x₃
式2：Y = β₁x₁ + β₂x₂ + β₃x₃ + β₁₂x₁x₂ + β₁₃x₁x₃ + β₂₃x₂x₃
其中Y为因变量响应值（生物量浓度和蛋白含量），β₁、β₂、β₃为线性系数，β₁₂、β₁₃、β₂₃为组分间两两交互系数，β₁₂₃为三向交互系数，x₁、x₂、x₃为独立变量（各果皮或麦麸的质量分数）。生物量浓度在发酵4天后经固液萃取于水相中测定——发酵结束后的果皮样品以蒸馏水按1:10（w/w）固液比在轨道摇床中200 rpm、室温萃取30 min，萃取操作进行两次，两次液体提取物合并。液体提取物中的生物量通过Neubauer-improved计数板（深度0.1 mm）进行细胞计数，并按10⁸细胞·g⁻¹的换算系数换算为细胞干重（g·L⁻¹）。发酵果皮中的生物量浓度以每克干底物对应的细胞质量表示（g·g⁻¹），计算时考虑水相提取物体积。
【数据】设计类型：单纯形质心混料设计；变量水平：0%、100%、50%、33.33%（w/w）；干物质量：5 g；发酵时间：4天；固液萃取比：1:10（w/w）；萃取条件：200 rpm、30 min、室温；萃取次数：2次；计数板：Neubauer-improved（深度0.1 mm）；换算系数：10⁸细胞·g⁻¹
#### 2.3.2 初始pH与果皮补加的影响
通过以pH 5或7的0.3 M PBS缓冲液调节各果皮的水分含量，评估SSF初始pH对酵母生物量的影响。同时设置不调pH的对照组（OP和BP的初始pH分别为5.2和4.4）。发酵4天后测定生物量浓度，测定方法同2.3.1节所述（固液萃取后水相细胞计数）。为提升Y. lipolytica生物量，在OP或BP中添加2%玉米浆（CSL）、2% NH₄Cl、2% (NH₄)₂SO₄和5%（w/w，干基）大豆糖蜜的不同组合进行SSF实验。OP以pH 5的0.3 M PBS缓冲液润湿，BP以pH 7的0.3 M PBS缓冲液润湿。生物量浓度在发酵第2天和第4天经固液萃取后于水相中测定。
【数据】PBS浓度：0.3 M；pH条件：5或7；对照pH：OP 5.2、BP 4.4；补加物：2% CSL、2% NH₄Cl、2% (NH₄)₂SO₄、5%大豆糖蜜（w/w，干基）；测定时间：第2天和第4天
2.4 果皮半固态发酵（semi-SF）
半固态发酵在27°C、200 rpm条件下进行，使用250-mL锥形瓶，将OP或BP按设定固形物含量悬浮于0.3 M PBS（pH 7）中。酵母细胞在YPD中培养19 h（接种1管冷冻保藏物，27°C、200 rpm），离心后重悬于培养基中，初始浓度设为0.5 g·L⁻¹或1.5 g·L⁻¹。固形物含量的影响通过添加1%（w/v，干基）或5%（w/v，干基）的各果皮进行研究，PBS缓冲液体积根据果皮质量调整，终工作体积为100 mL。各固形物含量下的生物量产生在补加条件（OP：2% NH₄Cl + 5%大豆糖蜜；BP：2% (NH₄)₂SO₄ + 5%大豆糖蜜）和不补加条件（仅果皮和PBS缓冲液）下分别评估。半固态发酵实验中，初始细胞密度为0.5 g·L⁻¹。物理预处理对生物量产生的影响在5%和7.5%固形物含量、按前述方式补加、初始生物量浓度1.5 g·L⁻¹的条件下进行评估。装有各果皮和PBS缓冲液的锥形瓶经微波预处理（1250 W，型号MS2387U，LG），功率850 W，处理2 min或5 min（每30 s循环一次）。同时设置不经微波预处理的对照实验。培养基中的生物量浓度通过Neubauer-improved计数板（0.1 mm深度）细胞计数，并按10⁸细胞·g⁻¹的换算系数换算为细胞干重（g·L⁻¹）。
【数据】发酵条件：27°C、200 rpm；工作体积：100 mL；固形物含量：1%、5%、7.5%（w/v，干基）；初始细胞密度：0.5 g·L⁻¹或1.5 g·L⁻¹；补加物：2% NH₄Cl + 5%大豆糖蜜（OP）、2% (NH₄)₂SO₄ + 5%大豆糖蜜（BP）；微波功率：850 W；微波时间：2 min或5 min（30 s循环）；计数板：Neubauer-improved（0.1 mm深度）；换算系数：10⁸细胞·g⁻¹
2.5 分析方法
水分和灰分采用AOAC方法测定。总脂质采用索氏抽提技术，70°C下以石油醚为溶剂。总蛋白含量采用有机元素分析仪UNICUBE® trace测定——分析前，发酵固体用蒸馏水洗涤以去除残留氨态氮。氮定量后以6.25为换算系数计算总蛋白。粗纤维采用AOAC官方方法962.09测定。可溶性还原糖在固液萃取后的液体提取物中采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定，以葡萄糖为标准品。果胶定量参照Rodsamran和Sothornvit（2019）的方法并略作修改：干燥果皮（10 g）以0.05 M HCl（1:20 v/w）在95°C下提取两次，每次1 h。两次滤液混合后加入无水乙醇（1:2，v/v），200 rpm搅动10 min，室温静置2 h。沉淀果胶经真空过滤，以乙醇和丙酮（3:1，v/v）洗涤，40°C干燥过夜。碳水化合物采用（原文未完整呈现）。
【数据】脂质提取：索氏法、70°C、石油醚；蛋白换算系数：6.25；粗纤维方法：AOAC 962.09；还原糖方法：DNS法、葡萄糖标准品；果胶提取：0.05 M HCl、1:20 v/w、95°C、1 h×2次；乙醇沉淀：1:2 v/v、200 rpm、10 min、室温2 h；洗涤：乙醇:丙酮=3:1；干燥：40°C过夜
研究结果
3.1 果皮固态发酵
#### 3.1.1 单纯形质心混料设计
单纯形质心实验设计评估了三种底物——橙皮、香蕉皮和麦麸——在Y. lipolytica固态发酵中对酵母生物量（ΔBiomass）和蛋白（ΔProtein）增加的影响。麦麸因其低成本、广泛可获得性和良好的理化特性而常用于SSF底物——其物理结构增强了通气性、气体交换和保湿性，为好氧微生物活动创造了有利条件。此外，麦麸富含碳水化合物、蛋白质、脂质、纤维和矿物质等营养素，是酵母生长和代谢产物产生的有用支撑基质。因此，麦麸可以改善终产品的营养特性。各SSF实验的底物组成和响应值见原文表2。
以香蕉皮为唯一底物时获得了最高的生物量（0.17 g·g⁻¹）和蛋白（1.81%）增加，表明与橙皮和麦麸相比，香蕉皮更适合Y. lipolytica的生长和蛋白质合成——后两者在两个参数上均呈现较低值。含香蕉皮的二元混合物（BP+OP和BP+WB）也产生了相对较高的生物量（0.17–0.18 g·g⁻¹），但蛋白含量的增加波动较大（0.34%–0.78%）。这种差异可能归因于底物营养组成和氮可利用性的不同——单独BP提供了更多可直接生物利用的氮源，支持酵母更高的蛋白质合成。Kamzolova等（2022）发现，在葡萄糖基础培养基中生长的Y. lipolytica VKM Y-2373，其蛋白分数随硫酸铵浓度的增加而略有提高。三元混合物与最佳条件（100% BP）相比未改善酵母生物量和蛋白，仅比100% OP、100% WB以及OP与WB的二元混合物产生了更高的生物量。混合物组成显著影响生物量和蛋白质合成，BP是最大化生物量和蛋白质产生的最有前景的底物。Y. lipolytica A101干生物量中的总蛋白含量在黑麦秸秆中为30.5%、在黑麦和燕麦麸中为45%（Drzymała等，2020）。Worland等（2020）发现，油基原料比非油基原料在Y. lipolytica W29中导致更低的蛋白质合成。该实验设计能够识别最大化生物量和蛋白质产生的最佳底物混合物。
回归系数和统计参数见原文表3。统计建模揭示特殊三次模型最适合ΔBiomass产生，而二次模型最适合ΔProtein含量。模型统计性能由高R²值（ΔBiomass为1.00，ΔProtein为0.98）、高F值和低p值指示，证实了模型在研究范围内对实验数据的良好拟合。低变异系数进一步表明实验结果的可靠性和可重复性。响应因子（ΔBiomass和ΔProtein）与独立变量（OP、BP和WB）之间观察到显著相关性。回归系数用于衡量各独立变量（底物）对因变量的影响程度——较高的回归系数表示独立变量对因变量的影响更强。此外，正回归系数表示底物间的协同交互作用，负回归系数则暗示相反效应。回归分析显示，香蕉皮（BP，x₂）对增加生物量和蛋白质具有最显著的正效应——其在各单一底物中回归系数最高。橙皮（OP，x₁）和麦麸（WB，x₃）也有正贡献，但程度较小。BP与WB的交互作用（x₂x₃）对生物量有显著正效应，但对蛋白质有强烈负效应，提示这些底物组合时存在权衡关系。三向交互作用（OP·BP·WB，x₁x₂x₃）对生物量有显著负效应，表明三种底物组合不利于生物量产生。
等高线图（图1）展示了生物量和蛋白质随果皮与麦麸浓度的变化。每个三角形顶点代表所测试固体底物之一的100%，红色区域表示与最高生物量或蛋白质增加相关的底物混合物。生物量产生在BP比例较高的配方中达到最大化——BP顶点附近的红色区域即为此区，ΔBiomass值在此达到峰值。图中从红到蓝的渐变清晰展示了随着OP或WB比例增加，生物量产量的下降趋势（图1A），证实BP是促进Y. lipolytica生长的最有效底物。含BP与OP或WB的二元混合物产生中等生物量，而富含OP和WB的配方产生最低的生物量增加。最高ΔProtein值出现在图中BP主导区域（图1B）。颜色渐变从BP顶点附近的黄/绿色（高蛋白增加）过渡到朝向OP和WB顶点的蓝色（低蛋白增加）。这一模式突显了BP在SSF中增强蛋白质的高能力，而OP和WB单独或组合效果较差。这些结果表明BP是在Y. lipolytica SSF中最大化生物量和蛋白质富集的最有前景的底物。数据还表明，加入OP或WB会稀释这些效应，凸显了底物选择和优化对果皮有效增值化的重要性。
模型预测的最优生物量和蛋白质值见原文表4。优化分析表明，含33% OP和67% BP、不含WB的底物混合物为Y. lipolytica SSF提供了最佳条件。该配方预测可产生0.18 g·g⁻¹的生物量增加和1.10%（w/w）的蛋白质增加，最大期望值达1.00。实验值与预测值高度一致——ΔBiomass为0.174 g·g⁻¹，ΔProtein为1.12%（w/w）。这些结果证实BP是增强酵母生长和蛋白质的最有效底物，其与OP的策略性组合进一步支持了工艺效率和发酵产品的营养品质。BP的更好表现可归因于其高碳水化合物、蛋白质、纤维和矿物质（灰分）含量（原文表1）。丰富的矿物质含量可能有助于更高的生物量和蛋白质产生。OP的高可溶性糖可用性（原文表1）也促进了生物量和蛋白质的增加。本研究强调了底物优化对最大化酵母生物量和蛋白质合成的重要性——单一底物常伴随的营养限制可通过底物混合物来克服，后者增加了营养可利用性。其他作者也报道了组合多种副产物以增强蛋白质和生物量产生的协同效应。以油籽饼（橄榄、菜籽和向日葵）的优化混合物作为Y. lipolytica SSF底物的评估结果显示，高比例（原文此处截断）。
【数据】100% BP：ΔBiomass 0.17 g·g⁻¹、ΔProtein 1.81%；BP+OP/BP+WB二元混合物：ΔBiomass 0.17–0.18 g·g⁻¹、ΔProtein 0.34%–0.78%；模型R²：ΔBiomass 1.00、ΔProtein 0.98；最优配方：33% OP + 67% BP；模型预测：ΔBiomass 0.18 g·g⁻¹、ΔProtein 1.10%；实验验证：ΔBiomass 0.174 g·g⁻¹、ΔProtein 1.12%；期望值：1.00
讨论与解读
4 结论
本研究证实了通过Y. lipolytica发酵可有效实现香蕉皮和橙皮的增值化，显著提升其营养品质。底物组成、氮源补加以及固态和半固态发酵中的工艺参数均可调控以增加生物量产生和蛋白质含量。值得注意的是，固态发酵优化后蛋白含量在橙皮中增加了200%以上、在香蕉皮中增加了100%以上（橙皮条件：pH 5、2% NH₄Cl、2%大豆糖蜜；香蕉皮条件：pH 7、2% (NH₄)₂SO₄、2%大豆糖蜜）。在半固态发酵中，采用7.5%固形物含量并经微波辐射预处理2 min可增强生物量产生。这些策略提高了生物量产率并降低了碳水化合物和糖含量，获得了低热量、高蛋白的发酵果皮。除营养改善外，本研究的主要新颖性在于将Y. lipolytica应用于果皮增值化、直接比较SSF与半固态发酵，以及识别各底物中最大化生物量和蛋白质富集的工艺条件。因此，本研究为将低值食品副产物转化为有价值的原料提供了一种潜在可放大的方法，有助于废物减量化和循环生物经济战略。
编译者解读
该研究的技术路线具有鲜明的"过程理性"特征——先以混料设计锁定最优底物配比，再逐一破解pH、氮源、固形物含量和物理预处理等工艺变量，逻辑链条完整。从合成生物学应用视角看，Y. lipolytica作为公认的GRAS菌株，其蛋白分泌能力和耐逆性在此得到充分验证。值得关注的是，作者将"蛋白提升200%"这一亮眼数据置于多种补加策略协同作用的语境下，而非归因于单一因素，这种克制的数据解读值得借鉴。局限在于，发酵产物的蛋白绝对含量（16%–18%）仍低于传统蛋白源，且果皮中潜在的抗营养因子和风味化合物未做评估。后续若能与工程菌株的基因改造（如蛋白酶分泌强化）结合，或可进一步突破营养富集的天花板。
参考来源
Araújo, L.P. Valorization of orange and banana peels through Yarrowia lipolytica solid-state and semi-solid fermentation. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104158
DOI: 10.1016/j.bcab.2026.104158