来源：Secretion peptide-guided ELK16 aggregation enables column-free protein production and purification in Yarrowia lipolytica（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
重组蛋白生产的下游纯化长期依赖多步层析，成本高、放大难。本研究在非常规酵母解脂耶氏酵母中，将天然分泌肽与自组装ELK16标签及TEV酶切位点组合，引导融合蛋白在细胞内形成活性聚集体。通过差速离心即可捕获目标蛋白，TEV切割后获得高纯度可溶蛋白，全程无需层析。α-淀粉酶聚集体可重复使用10轮，tSPF融合蛋白将β-胡萝卜素重定向至ER相关聚集体，产量提升15%。1升微型生物反应器验证了工艺放大可行性。
研究背景
酵母凭借折叠能力和N-糖基化修饰优势，已成为重组蛋白生产的重要宿主。解脂耶氏酵母作为产油酵母，具备鲁棒生长、GRAS安全性且无Crabtree效应等特点，已被用于多种异源蛋白生产。然而，下游纯化仍是主要瓶颈——传统策略依赖亲和标签和多步层析，且分泌途径受信号肽选择、转运瓶颈及培养条件影响。如何在提高胞内表达的同时简化纯化流程，是该领域亟待解决的问题。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
基于pYLXP’载体构建模块化ELK16骨架，以实现目标蛋白的快速插入。首先组装pYLXP’3-ELK16-TEVp和pYLXP’3-ELK16-PT-TEVp，使ELK16位于TEV蛋白酶识别序列（ENLYFQ↓G）上游，后者在ELK16与TEV位点之间含或不含PT连接肽。TurboGFP、α-淀粉酶、截短型上清蛋白因子（tSPF）等重组蛋白的合成基因经密码子优化后由GENEWIZ公司（中国广州）合成。目标蛋白基因通过PCR扩增，引物两端带有20–40 bp与线性化载体末端同源的序列，使用无缝克隆试剂盒（碧云天，中国上海）进行Gibson组装。为评估分泌效率，另基于pYLSP质粒（携带天然Yarrowia分泌肽）构建pYLSC-ELK16-PT-TEVp-target载体。引物由GENEWIZ公司合成。所有组装产物转化至E. coli DH5α（生工生物，中国上海）扩增，在LB+氨苄青霉素平板筛选。验证正确的构建体经NotI线性化后，采用醋酸锂法转化至解脂耶氏酵母Po1g pBR322对接平台。转化子在缺亮氨酸CSM平板筛选。所有引物、质粒、菌株及合成基因序列见补充表S1–S4。
【数据】载体：pYLXP’、pYLSP；宿主：E. coli DH5α、Y. lipolytica Po1g；筛选标记：氨苄青霉素、亮氨酸营养缺陷；TEV识别序列：ENLYFQ↓G；同源臂长度：20–40 bp
2.2 培养基与培养条件
工程酵母在选择性CSM-Leu琼脂平板维持，接种至CSM-Leu液体培养基，含1.7 g/L无氨基酸酵母氮源碱（Sunrise，瑞士）、0.69 g/L CSM-Leu补充物（Sunrise，瑞士）、5 g/L硫酸铵（生工生物，中国上海）和20 g/L葡萄糖（Sigma，美国密苏里州）。种子培养在250 mL带挡板摇瓶中，含50 mL YPD（10 g/L酵母提取物（Oxiod，英国）、20 g/L蛋白胨（生工生物，中国上海）、20 g/L葡萄糖），30°C、250 rpm振荡培养，除非另有说明。葡萄糖浓度和温度采用表达分泌肽与ELK16自组装标签融合GFP的工程酵母依次优化。葡萄糖浓度筛选在250 mL带挡板摇瓶中进行，含50 mL YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨），分别添加20、40、60或80 g/L葡萄糖（Glu20–Glu80），30°C、250 rpm培养120 h。随后以最优葡萄糖浓度评估培养温度：工程酵母按上述接种，在20、25、30或35°C条件下、50 mL YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、80 g/L葡萄糖）中培养120 h。每组设三个生物学重复，取样测定胞内GFP。
【数据】CSM-Leu培养基：YNB 1.7 g/L、CSM-Leu 0.69 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L、葡萄糖 20 g/L；YPD：酵母提取物 10 g/L、蛋白胨 20 g/L、葡萄糖 20 g/L；温度：30°C；转速：250 rpm；葡萄糖梯度：20/40/60/80 g/L；温度梯度：20/25/30/35°C；培养时间：120 h；重复数：3
2.3 共聚焦荧光显微镜
成像实验中，酵母培养物通常在YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中、30°C、250 rpm条件下培养48 h收获。细胞经PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤并重悬。取5 μL细胞悬液滴于载玻片，盖玻片覆盖。使用Zeiss LSM 980共聚焦激光扫描显微镜成像。图像处理采用Zeiss ZEN软件，用于分析TurboGFP的亚细胞区室化分布。
【数据】培养时间：48 h；温度：30°C；转速：250 rpm；培养基：YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；PBS pH：7.4；上样量：5 μL；显微镜：Zeiss LSM 980
2.4 蛋白提取与纯化
培养5天后离心收集细胞，在裂解缓冲液A（50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl）中用匀浆器破碎。粗裂解液低速离心（3000 rpm、10 min、4°C）去除细胞碎片，上清高速离心（16,000 rpm、10 min、4°C）将可溶蛋白（上清）与ELK16诱导的聚集体（沉淀）分离。聚集体沉淀用裂解缓冲液B（50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、0.5%（v/v）Triton X-100）洗涤一次，再用冰冷裂解缓冲液A洗涤三次。洗涤后的沉淀重悬于裂解缓冲液A，与重组His标签TEV蛋白酶（New England Biolabs，美国）在30°C孵育1 h。酶切后样品离心（16,000 rpm、10 min、4°C）去除残余不溶蛋白，目标蛋白回收于上清。为去除TEV蛋白酶，上清与BeyoGold™ His标签纯化树脂（碧云天，中国）按说明书孵育，使His标签TEV蛋白酶选择性结合。含纯化目标蛋白的流穿液收集用于下游分析。SDS-PAGE验证蛋白酶依赖性目标蛋白释放。蛋白分子量标准为Precision Plus Protein Dual Color Standards（Bio-Rad，美国加州），覆盖10–250 kDa。目标蛋白表观分子量通过在线工具（https://web.expasy.org/compute_pi/）计算。
【数据】裂解缓冲液A：50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl；裂解缓冲液B：50 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、0.5% Triton X-100；低速离心：3000 rpm、10 min、4°C；高速离心：16,000 rpm、10 min、4°C；TEV酶切：30°C、1 h；蛋白标准：10–250 kDa
2.5 荧光强度检测
携带TurboGFP基因的酵母培养物在YPD中过夜培养，离心收集（3000 rpm、5 min）。沉淀用PBS（100 mM、pH 7.4）洗涤，去离子水重悬至OD600 = 0.5。培养上清和细胞沉淀分别观察胞外GFP和胞内GFP。荧光强度在黑色96孔板中用酶标仪（BioTek，Synergy H1）测定，激发波长488 nm，发射波长520 nm。胞内信号以OD600归一化的任意单位（a.u.）报告。
【数据】离心：3000 rpm、5 min；PBS：100 mM、pH 7.4；OD600 = 0.5；激发波长：488 nm；发射波长：520 nm；仪器：BioTek Synergy H1
2.6 淀粉水解实验
淀粉-碘水解实验参照已发表方案修改。可溶淀粉以2 g/L溶于去离子水，加热至澄清；0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7）和碘试剂（0.1269 g I2、0.83 g KI溶于100 mL水）现配现用。活性测定：40 μL蛋白样品、20 μL淀粉溶液、20 μL磷酸盐缓冲液加入0.2 mL PCR管，37°C孵育30 min，随后加入80 μL碘试剂。580 nm处酶标仪读取显色。淀粉酶活性以U/mL报告，1 U定义为每分钟每毫升蛋白溶液降解1 μg碘结合淀粉。重复使用实验：聚集体蛋白（分级分离制备）重悬于200 μL反应混合液（100 μL 1 g/L淀粉溶液和100 μL磷酸盐缓冲液），37°C孵育30 min，离心沉淀，上清按上述碘染色法测定。每轮循环后，不溶蛋白聚集体用PBS洗涤一次，与新鲜淀粉溶液重新孵育进行下一轮。过程重复10轮。酶活性以淀粉降解百分比（% degradation）定义。所有反应设三个生物学重复。
【数据】淀粉浓度：2 g/L（测定）/1 g/L（重复使用）；碘试剂：0.1269 g I2 + 0.83 g KI/100 mL水；反应体系：40 μL样品 + 20 μL淀粉 + 20 μL缓冲液 + 80 μL碘试剂；温度：37°C；时间：30 min；检测波长：580 nm；循环数：10；重复数：3
2.7 β-胡萝卜素提取与分析
β-胡萝卜素产量测定参照已发表方案略作修改。取50 μL酵母培养物离心（12,000 rpm、1 min）沉淀，弃上清，细胞沉淀用900 μL DMSO（生工生物，中国上海）在50°C加热提取1 h。DMSO提取液用900 μL甲醇（Macklin，中国上海）稀释。最终提取液经0.45 μm PTFE针头过滤器过滤后分析。定量采用反相HPLC（Agilent 1260 Infinity III LC系统），配备Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18色谱柱（4.6 × 100 mm，4 μm），450 nm检测。流动相为乙腈-甲醇-异丙醇（5:3:2 v/v/v），流速1.0 mL/min，进样量10 μL。样品浓度依据β-胡萝卜素标准品校准曲线由峰面积计算。
【数据】取样量：50 μL；离心：12,000 rpm、1 min；DMSO提取：900 μL、50°C、1 h；甲醇稀释：900 μL；滤膜：0.45 μm PTFE；检测波长：450 nm；流动相：乙腈:甲醇:异丙醇 = 5:3:2；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL；色谱柱：Poroshell 120 EC-C18（4.6 × 100 mm，4 μm）
研究结果
3.1 柔性PT连接肽对ELK16介导聚集至关重要
ELK16肽段已知通过形成稳定β-折叠诱导聚集。为评估ELK16标签在解脂耶氏酵母中的聚集诱导能力，将ELK16标签直接融合至GFP的N末端（pYLXP’3-ELK16-TEVp-GFP）。表达后荧光显微镜显示，表达该构建体的酵母在细胞质中呈现弥散绿色信号，与不含ELK16聚集标签的GFP表达定位模式相似，表明直接ELK16-GFP融合在该条件下未形成聚集体（图1a、S1）。此前研究已在E. coli赖氨酸脱羧酶活性包涵体构建中测试了多种连接肽（柔性Serine/Glycine（SG）和刚性Proline/Threonine（PT））与不同聚集标签的组合，结果显示含刚性PT连接肽的组合能有效形成活性聚集体并表现最高活性。这些发现支持使用PT连接肽来减少ELK16与目标蛋白之间的空间位阻并促进自组装聚集。据此，我们重新设计构建体，在ELK16标签与GFP之间插入刚性PT连接肽（pYLXP’3-ELK16-PT-TEVp-GFP）。表达该修饰构建体的细胞出现离散亮斑，表明细胞质中形成聚集（图1b）。该模式指示蛋白聚集，证实PT连接肽对恢复ELK16在解脂耶氏酵母中的自组装功能至关重要。融合蛋白的结构建模支持这一解释（图1a、b）。无PT连接肽时，ELK16标签紧邻目标蛋白GFP（图1a），该约束可能在空间上阻碍β-折叠对齐并阻断聚集。相比之下，PT连接肽提供足够分离距离，允许正确对齐和β-折叠形成。此外，此前对两种蛋白（Aspergillus fumigatus amadoriase II（AMA）、Bacillus pumilus β-xylosidase（XynB））ELK16诱导聚集体的FTIR分析检测到反平行β-折叠特征的酰胺I带。该过程由疏水作用驱动，使易聚集的亮氨酸残基形成核心，随后通过赖氨酸与谷氨酸残基间的静电相互作用锁定为稳定的反平行β-折叠（图1c）。这一结果强化了PT连接肽在解脂耶氏酵母中促进ELK16标签自组装的关键作用。
【数据】GFP荧光定位：弥散（无PT）vs 离散亮斑（有PT）；连接肽类型：SG（柔性）/PT（刚性）；FTIR特征：反平行β-折叠酰胺I带；驱动机制：疏水作用 + 静电相互作用
3.2 分泌肽的融合需求
虽然在ELK16与目标蛋白之间引入PT连接肽成功诱导聚集，但所得GFP荧光强度仍然较低，表明蛋白产量有限。包涵体通常每个细胞仅一个，拷贝数低。这可能是因为ELK16驱动的聚集体在细胞质中形成后，可被细胞质量控制与降解途径（如自噬或蛋白酶体介导过程）识别并靶向。在酵母中，胞质聚集体往往不稳定且易被快速降解，泛素-蛋白酶体系统阻止重组蛋白的高水平积累。鉴于解脂耶氏酵母具有高效的分泌途径，可促进异源蛋白的正确折叠和稳定化，我们假设将ELK16标记构建体重定向至分泌途径可显著提高蛋白产量。此前研究也证明了多种分泌肽在解脂耶氏酵母中针对不同蛋白分泌的有效性。为验证该假设，我们将已知在解脂耶氏酵母中具有强且可靠ER靶向和蛋白分泌能力的信号肽XPR2prepro（SP1）融合至ELK16-PT-GFP的N末端，生成SP1–ELK16–PT–GFP构建体。共聚焦显微镜显示，N末端分泌肽的存在使ELK16-PT-GFP聚集体呈现明显不同的定位模式（图2）。在内质网（ER）中观察到强GFP荧光，表明融合蛋白被成功靶向至ER。定量荧光分析支持该结果：表达SP1-ELK16-PT-GFP融合蛋白的酵母其GFP强度显著高于不含SP的构建体（图4b、表S6）。该增加表明ER定位减少了胞质降解，从而改善了蛋白积累和稳定性。据我们所知，本研究首次报道利用天然分泌系统与ELK16介导聚集相结合，在解脂耶氏酵母中实现增强的重组蛋白生产，为高效蛋白表达和纯化提供了新平台。
【数据】SP1：XPR2prepro；GFP定位：ER；SP1融合 vs 无SP：GFP强度显著升高（具体数值见表S6）
3.3 蛋白纯化与生产条件优化
表达SP–ELK16–PT–GFP的重组酵母细胞培养5天后收获并裂解。采用差速离心（图3a）将可溶蛋白与不溶组分中ELK16诱导的聚集体分离。洗涤去除污染物后，聚集体与TEV蛋白酶孵育，切割ELK16标签并释放可溶GFP（图3b）。SDS-PAGE分析确认一条表观分子量略高于25 kDa的条带，与TurboGFP的预测分子量（26 kDa）一致（图3c）。这些结果与近期研究一致——自组装标签诱导的聚集体可通过离心高效纯化和分离，TEV蛋白酶可特异性切割标签，使可溶目标蛋白回收，残余ELK-TEVp标签随后通过离心去除。为建立定量蛋白质量平衡，分析了不同组分中GFP分布（表S5）。全蛋白提取物为15.91 mg/mL培养物，其中8.34 mg/mL分配至不溶组分（含高效ELK16介导聚集）。TEV蛋白酶处理后，从聚集组分释放0.45 mg/mL GFP，去除TEV蛋白酶后回收0.33 mg/mL纯化GFP。迄今，众多异源蛋白已通过XPR2和LIP2分泌肽在解脂耶氏酵母分泌系统中表达。为优化蛋白产量，将多种天然分泌肽（SP1–SP4；图4a）融合至ELK16系统。荧光分析显示，仅含前导区（pre-region）的构建体（SP2和SP4，即XPR2pre和LIP2pre）表现出显著更高的GFP表达。其中，XPR2pre信号肽（SP2）显示最高胞内GFP荧光，表明最小前导区靶向足以引导ELK16融合蛋白进入分泌途径并增强积累（图4b、表S6）。虽然XPR2prepro广泛用于解脂耶氏酵母异源蛋白分泌，但此前研究也证明仅前导区即可有效将蛋白导入分泌系统。机制上，前导区被信号识别颗粒及其受体识别，将多肽靶向至ER腔，而前序列主要辅助折叠和成熟，在后期高尔基体中加工。这解释了为何前导区足以在我们的系统中靶向ELK16构建体。此外，我们以荧光强度作为蛋白产量指标，评估了葡萄糖浓度对蛋白产量的影响（图5）。80 g/L葡萄糖培养物表现出最高细胞密度（OD600）和胞内荧光（图5a）。按OD600归一化后，80 g/L条件仍显示最高的单细胞GFP表达，证明升高葡萄糖可同时增强生长和重组蛋白产量。
【数据】全蛋白提取物：15.91 mg/mL培养物；不溶组分：8.34 mg/mL；TEV释放GFP：0.45 mg/mL；纯化GFP回收：0.33 mg/mL；TurboGFP分子量：26 kDa；最佳葡萄糖浓度：80 g/L
3.4 分泌肽对胞内GFP的影响
（此节内容在原文节选结果部分未完整呈现，但图4显示SP2（XPR2pre）为最优分泌肽。）
【数据】最优分泌肽：SP2（XPR2pre）；SP2 vs SP1：GFP荧光更高（具体数值见表S6）
3.5 α-淀粉酶聚集体的活性与重复使用
（此节内容在原文节选结果部分未完整呈现，但图6显示淀粉-碘实验证实ELK16聚集体中淀粉酶活性。）
3.6 tSPF融合蛋白介导的β-胡萝卜素区室重定向
（此节内容在原文节选结果部分未完整呈现。）
3.7 1升微型生物反应器验证
（此节内容在原文节选结果部分未完整呈现，但图7显示补料分批发酵的时间曲线。）
讨论与解读
本研究在解脂耶氏酵母中建立了无层析的重组蛋白生产与纯化平台。核心要素包括：刚性PT连接肽对ELK16聚集的必需性；分泌肽前导区将融合蛋白靶向分泌途径并提升胞内积累；差速离心捕获聚集体后经TEV切割释放可溶蛋白。α-淀粉酶在聚集态和释放态均保持活性，10轮循环中维持稳定淀粉水解，构成无载体可重复使用的固定化生物催化剂。tSPF融合将β-胡萝卜素从脂滴重定向至ER相关聚集体，总胞内类胡萝卜素增加15%。1升规模验证中GFP积累和淀粉酶活性较摇瓶提升约10倍。
编译者解读： 该工作巧妙利用"分泌肽引导+ELK16自聚集"的组合策略，将传统上被视为下游负担的包涵体转化为可离心捕获的纯化工具。TEV可切割设计赋予聚集体"按需释放"功能，同时保留了固定化酶的应用场景——一个系统兼顾纯化与催化。β-胡萝卜素的重定向展示了该平台在代谢区室工程中的延伸价值。然而，0.33 mg/mL的GFP回收量仍偏低，TEV酶和洗涤步骤的放大成本需进一步评估。整体而言，该策略为产油酵母的"实验室到中试"蛋白制造提供了简洁且可扩展的解决方案，尤其适合不依赖层析设备的工业化场景。
参考来源
Lertphadungkit P. Secretion peptide-guided ELK16 aggregation enables column-free protein production and purification in Yarrowia lipolytica. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2026.174276
DOI: 10.1016/j.cej.2026.174276