来源：Two-stage valorization of glycol-based waste fluids via Yarrowia lipolytica bioconversion and biomethane production（International Biodeterioration & Biodegradation）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
含丙二醇（PG）和乙二醇（EG）的冷却液废液是日益严峻的环境问题。本研究以野生型解脂耶氏酵母A101为底盘，先在好氧阶段将废冷却液中的二醇类物质转化为酵母生物质（q_S = 0.19 g g⁻¹·h⁻¹，约6%的乙二醇碳回收于生物质中），144小时内实现底物完全消耗；所得酵母生物质再作为厌氧消化底物，21天后沼气产量达400 mL gVS⁻¹，是废冷却液单独发酵（150 mL gVS⁻¹）的2.67倍。该两阶段策略将危废管理与可再生能源生产相结合，符合循环经济原则。
研究背景
冷却液承担着汽车发动机、热泵及光伏板的热量高效传递功能，既要散热防过热，又要保护系统免受腐蚀和水垢堆积。近年来，环保型供暖系统的普及持续增长，以二醇类物质为热载体的设施将不断扩大。目前市售冷却液主要含两种热载体：丙二醇（PG）和乙二醇（EG）。全球数据表明，乙二醇年消费量从2007年的1827万吨增至2017年的2666万吨，十年增幅超45%。PG属二羟基醇类，无色无味、高粘度、强吸湿性，被认为无或极低毒性，但已被归类为污染物。废冷却液的安全处置亟需高效方案。
研究方法
2.1 微生物与培养基
本研究所用菌株为野生型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）A101（Wojtatowicz和Rymowicz，1991）。接种培养基为YPD（含10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨、20 g L⁻¹葡萄糖）。以YP培养基（10 g L⁻¹酵母提取物、20 g L⁻¹蛋白胨）为基础，进行丙二醇（PG）和乙二醇（EG）摄取分析。纯PG和EG（培养基添加剂及标准溶液配制用）购自波兰Chempur公司。废冷却液取自热泵定期更换液（使用3年后）。经HPLC分析，废冷却液中PG和EG浓度分别为384 g L⁻¹和13 g L⁻¹。二醇类及其他组分含量采用超高效液相色谱（UHPLC）验证，色谱图显示仅存在丙二醇和乙二醇（见补充图1）。
2.2 生长曲线
Y. lipolytica生长分析使用Infinite M Nano酶标仪（Tecan，瑞士）。接种物在YPD培养基中、28°C、200 RPM连续振荡培养24小时。随后以2500 RPM离心5分钟，用无菌Milli-Q水洗涤两次。实验在96孔板中进行，每孔200 μL培养基。测试培养基包括：YP + 20 g L⁻¹ PG、YP + 5 g L⁻¹ EG、YP + 5 g L⁻¹ EG + 20 g L⁻¹葡萄糖、YP + 50 g L⁻¹ PG（来自废冷却液）、YP + 50 g L⁻¹ PG（来自废冷却液）+ 20 g L⁻¹葡萄糖。以无添加物的YP培养基为对照。酵母培养物标准化至OD₆₀₀ = 0.1，三重复，28°C恒定轨道振荡培养，每30分钟测定600 nm处光密度，共培养48小时。同时考察了其他碳源（甘油和甘露醇，浓度20 g L⁻¹，分别标记为YPG和YPM）在含纯乙二醇（0.5 g L⁻¹）或丙二醇（50 g L⁻¹）培养基中的添加效果，培养条件同上。
【数据】菌株：Y. lipolytica A101；培养基：YPD/YP；温度：28°C；转速：200 RPM；时间：24h（接种）/48h（生长曲线）；OD₆₀₀：0.1；PG浓度：20 g L⁻¹；EG浓度：5 g L⁻¹；废冷却液PG：50 g L⁻¹
2.3 形态学分析
对生长于含二醇培养基（商业乙二醇、丙二醇及废冷却液添加）中的酵母细胞进行形态学分析，涵盖所有不同碳源添加组合。用于形态学验证的Y. lipolytica培养物在含指定组分的培养基中培养144小时，28°C、200 RPM连续振荡。随后取1 mL培养物以3000 RPM离心5分钟，无菌水洗涤两次，重悬于Milli-Q水中。悬浮后立即制备微生物标本，使用Nikon Eclipse E600显微镜观察。显微镜配备微分干涉差（DIC）系统和DS-Fi1相机，图像使用NIS-Elements BR软件分析。
【数据】培养时间：144h；温度：28°C；转速：200 RPM；离心：3000 RPM × 5min
2.4 摇瓶研究与生物质生成
测定Y. lipolytica摄取PG和EG能力的实验在0.3 L锥形瓶中进行。Y. lipolytica A101接种物在YPD培养基中培养24小时，随后2500 RPM离心5分钟，Milli-Q水洗涤两次。PG和EG摄取速率分析进行144小时（6天）。所用培养基含PG和EG，浓度分别标准化为20 g L⁻¹和5 g L⁻¹，基础培养基为YP和YPD。生物质生成培养在YPD培养基中进行，含20 g L⁻¹葡萄糖及废冷却液添加物（PG标准化至50 g L⁻¹）。酵母培养物标准化至OD₆₀₀ = 0.5。培养在0.3 L锥形瓶中进行，每瓶30 mL培养基，28°C、200 RPM恒定振荡。菌株生长96小时或144小时（对应培养基中PG完全消耗时间）。摇瓶培养设三重复。最终生物质浓度（g干重L⁻¹）使用水分分析仪以重量法测定，分别测定仅YP对照和YP + 废冷却液（PG标准化至50 g L⁻¹）样品，据此计算YP校正生物质产率（Y_X/S，净）和比底物摄取速率（q_S）。
【数据】菌株：Y. lipolytica A101；培养基：YP/YPD；PG浓度：20 g L⁻¹（摄取实验）/50 g L⁻¹（废冷却液生物质生成）；EG浓度：5 g L⁻¹；葡萄糖：20 g L⁻¹；OD₆₀₀：0.5；温度：28°C；转速：200 RPM；时间：96h或144h；培养体积：30 mL/0.3 L瓶
2.5 分析方法
#### 2.5.1 理化特性与元素组成
酵母生物质、废冷却液及消化污泥接种物的总碳、氢、氮、硫含量使用PerkinElmer CHNS/O 2400 II测定。灰分含量依据EN 18122以重量法测定（550°C马弗炉燃烧）。氧含量以差减法计算：O [%] = 100 - C - H - N - S - Ash。总固体（TS）依据EN 15934以105°C干燥至恒重的重量法测定。挥发性固体（VS）为总固体与灰分之差。废冷却液pH使用Mettler Toledo FiveEasy Plus FP20台式pH计（Mettler Toledo，瑞士）测定，电导率使用配备专用电导探头的Elmetron CX-705多功能计（Elmetron，波兰）测定。所有测量均在室温（≈22°C）下对未稀释废冷却液样品进行。
【数据】灰分测定温度：550°C；TS干燥温度：105°C；pH测量温度：≈22°C
#### 2.5.2 培养基组分分析与厌氧消化稳定性分析
摇瓶培养样品（200 μL）以14000 RPM离心5分钟（10°C）。上清液用Milli-Q水稀释后再次在相同条件下离心。PG、EG（Chempur，波兰）和葡萄糖（Chempur，波兰）标准溶液以Milli-Q水配制至终浓度10 g L⁻¹，于−20°C保存。标准曲线由标准溶液稀释至适当浓度后制备。定量定性分析采用超高效液相色谱系统Dionex UltiMate 3000 UHPLC（Thermo Fisher Scientific，Waltham），配备Carbohydrate H+ 8μm HypeRez XP色谱柱（300 × 7.7 mm）及相应保护柱和示差折光检测器（Shodex，Ogimachi，日本）。以25 mM三氟乙酸（TFA）（Honeywell，美国）的Milli-Q水溶液为洗脱液，柱温65°C，流速0.6 mL min⁻¹，等度洗脱。UHPLC程序详见前期报道（Kosiorowska等，2022）。挥发性脂肪酸（VFA）使用同一UHPLC设备定量。厌氧消化样品于−20°C保存至分析，随后解冻、充分混匀、Milli-Q水稀释，10000 RPM离心10分钟（10°C）。校准曲线由参考标准品（Volatile Free Acid Mix，CRM46975，Merck，波兰）配制，按制造商建议储存。等度洗脱以0.25 mM三氟乙酸为流动相，流速1.1 mL min⁻¹，柱温35°C。检测同时使用UV/VIS-DAD检测器（λ = 208 ± 1 nm）和示差折光检测器（RI，Shodex，Ogimachi，日本）。所有分析设三重复，数据采集与处理使用Chromeleon 7.1软件。
【数据】离心：14000 RPM × 5min（10°C）；标准溶液浓度：10 g L⁻¹；色谱柱温：65°C（二醇类）/35°C（VFA）；流速：0.6 mL min⁻¹（二醇类）/1.1 mL min⁻¹（VFA）；TFA浓度：25 mM（二醇类）/0.25 mM（VFA）；检测波长：208 ± 1 nm
#### 2.5.3 脂肪酸谱测定
脂肪酸谱采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）测定。首先，冻干生物质经Folch胞内提取（非极性和极性溶剂混合物），该方法可同时提取非极性脂质（如三酰甘油）和极性膜脂。
【数据】原文未详述GC-MS具体参数
研究结果
3.1 废冷却液理化特性
对废冷却液进行了全面表征以评估其理化性质及潜在环境影响。分析样品呈碱性反应，与乙二醇基冷却系统中典型使用的腐蚀抑制剂和缓冲添加剂一致。除pH外，还测定了电导率和重金属含量，以评估来自系统磨损、添加剂或长期运行产生的潜在污染。废冷却液pH为8.57 ± 0.02（21.9°C，补充表1），接近中性且略低于新鲜乙二醇基热载体通常宣称的pH值（7.5–9.5），很可能反映了碱性腐蚀抑制添加剂在长期运行中的部分降解。电导率达587.1 μS cm⁻¹，表明存在溶解性离子物质，与表1所示重金属谱及废液中残留添加剂组分一致。在定量元素中，铁（Fe）为主要金属（11.8 ± 2.4 mg kg⁻¹），其次为铜（Cu）（2.54 ± 0.51 mg kg⁻¹）和锌（Zn）（1.88 ± 0.38 mg kg⁻¹）。其余元素包括铅（Pb）、镉（Cd）、镍（Ni）和铬（Cr）均低于各自检测限，表明污染可忽略。同样，锑（Sb）、钒（V）、锡（Sn）、钼（Mo）和银（Ag）均未在阈值以上检出。总体而言，元素谱显示有毒金属负荷较低，检出的金属可能来源于系统背景组件而非显著外部污染。重金属浓度采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）按已验证分析程序PBW-11（第6版，2022年9月9日发布）商业化测定。
为进一步表征所用废冷却液，化学需氧量（COD）基于其主要组分PG（1.68 gO₂ g⁻¹）和EG（1.29 gO₂ g⁻¹）的化学计量氧化计算。对于含384 g L⁻¹ PG和13 g L⁻¹ EG的废液，计算COD约为662,000 mgO₂ L⁻¹，证实了寿命末期乙二醇基热载体典型的高浓度有机负荷。该值与文献报道一致——浓缩乙二醇基流体（如除冰剂和冷却剂）的COD水平可达约615,000 mgO₂ L⁻¹。在更稀释的体系中（如工业含EG废水），COD通常在1000–3000 mgO₂ L⁻¹范围内，与连续流反应器生物处理中应用的数值一致。分析废冷却液的高COD既凸显了其未经处理排放的环境危害性，也表明其通过所提出的两阶段生物转化策略进行增值利用的巨大能量潜力。
【数据】pH：8.57 ± 0.02（21.9°C）；电导率：587.1 μS cm⁻¹；Fe：11.8 ± 2.4 mg kg⁻¹；Cu：2.54 ± 0.51 mg kg⁻¹；Zn：1.88 ± 0.38 mg kg⁻¹；PG：384 g L⁻¹；EG：13 g L⁻¹；COD：约662,000 mgO₂ L⁻¹
3.2 Yarrowia lipolytica在含纯二醇及废冷却液培养基上的生长
为评估Y. lipolytica利用废冷却液中乙二醇基组分作为碳源的能力，在不同培养条件下进行了初步生长实验。培养实验前，废冷却液经UHPLC分析（补充图1）。在所应用的色谱条件下，仅检出丙二醇（384 g L⁻¹）和乙二醇（13 g L⁻¹）为可分析鉴定组分，在方法检测范围内未解析出与腐蚀抑制剂、染料残留或降解副产物对应的额外峰。但需注意，色谱方法针对二醇类及结构相关的多元醇定量进行了优化，因此低于检测限或处于方法分辨率窗口之外的痕量组分的存在不能完全排除。这一分析观察结果对下述生长差异的解读具有重要意义——酵母在真实废冷却液上的生长略慢于纯二醇，可能归因于此类不可检测的基质组分而非PG或EG本身。
如表2所示，酵母在所有含纯二醇及废冷却液组分的测试培养基中均表现出一致生长。各底物对应的比生长速率（μmax）值显示，单独的二醇类物质较对照培养基略降低生长速率，而废冷却液的存在引起更明显的抑制效应。值得注意的是，在含废冷却液的完全YPD培养基培养中，测试培养期内未观察到稳定期，表明指数生长期延长。同时评估了补充替代碳源的共投喂效应，以确定此类补加能否增强酵母在含二醇培养基上的生长。因此，后续实验仅使用对照培养基（无额外碳源）和添加葡萄糖的培养基。
生长曲线分析（图1A）显示，在含PG或EG的培养基中，延迟期缩短至约6小时，而缺乏这些化合物的培养基中约为12小时。所有测试条件下的最终光密度值相当，表明冷却液来源的二醇未显著影响最大生物质产率，但指数生长期的持续时间和斜率存在细微差异。同时考察了提高纯EG和PG浓度的影响，结果见补充图2。实验使用含0.5 g L⁻¹ EG和50 g L⁻¹ PG的YPD培养基进行。最大生物质产率和比生长速率与表2中低浓度条件获得的结果相当。含废冷却液的培养基以PG浓度标准化至50 g L⁻¹，与纯化合物添加量相当。添加20 g L⁻¹未显著影响酵母细胞生长，且该浓度在48小时内即从培养基中耗尽（数据未显示），因此采用提高初始浓度以扩大废物利用规模并观察多元醇添加对酵母细胞生长的效应。目前Y. lipolytica培养中使用的多元醇浓度各异，研究人员采用了高浓度，如甘油40–120 g L⁻¹，甚至高达160 g L⁻¹的甘油和甘露醇。文献报道的最高甘油浓度为300 g L⁻¹，证实了该酵母菌株对多元醇浓度的显著耐受能力。本研究所用培养基中多元醇浓度完全在酵母耐受标准范围内，不构成生长挑战。尽管文献表明Y. lipolytica对培养环境中高浓度多元醇具有高度抗性，但本研究所用废冷却液在所应用的UHPLC条件下除PG和EG外未检出其他组分。因此，真实废冷却液上略慢的生长更可能归因于PG和EG代谢过程中形成的副产物而非基质来源的抑制剂，尽管低于方法检测限的痕量组分的存在不能排除。
【数据】延迟期：约6h（含PG/EG）/约12h（对照）；PG浓度：50 g L⁻¹；EG浓度：0.5 g L⁻¹；培养时间：48h
3.3 底物消耗曲线与生物质生成
（此部分原文节选未完整提供，以下为可译内容）
在含废冷却液的培养基中，Y. lipolytica在144小时内实现PG的完全消耗。生物质生成实验中，以YPD为基础培养基（含20 g L⁻¹葡萄糖），废冷却液PG标准化至50 g L⁻¹。经重量法测定，仅YP对照和YP + 废冷却液（PG标准化至50 g L⁻¹）处理的最终生物质浓度用于计算YP校正生物质产率（Y_X/S，净）和比底物摄取速率（q_S）。q_S = 0.19 g g⁻¹·h⁻¹，约6%的乙二醇碳回收于生物质中。
【数据】q_S：0.19 g g⁻¹·h⁻¹；乙二醇碳回收率：约6%；底物完全消耗时间：144h
3.4 厌氧消化性能与挥发性脂肪酸谱
将所得酵母生物质作为厌氧消化底物，21天后沼气产量达400 mL gVS⁻¹，是废冷却液单独发酵（150 mL gVS⁻¹）的2.67倍。厌氧消化过程中监测挥发性脂肪酸（VFA）浓度变化，包括乙酸和丙酸。
【数据】沼气产量：400 mL gVS⁻¹（21天，酵母生物质）；150 mL gVS⁻¹（废冷却液单独）；倍数：2.67倍
讨论与解读
废冷却液作为酵母培养基组分进行增值，为危险废物提供了一种创新处置途径。该两阶段过程将液体废物分解代谢为酵母生物质，后者作为沼气生产的有效底物。该方法将难处理残留物转化为有价值资源，同时实现高沼气产率。通过间接将冷却液用于生物过程，第一阶段降低其危害性，第二阶段实现可再生能源生产。碳平衡计算表明，第一阶段（好氧培养）约5.5%的乙二醇来源碳回收于酵母生物质中；所得生物质随后作为底物用于第二阶段（厌氧消化）沼气生成，达400 mL gVS⁻¹。进一步验证（包括测试更多废冷却液类型、放大研究及专门的技术经济与生命周期评估）将在更广泛的环境和经济效益得到定量确认之前开展。
编译者解读
本研究以"废液→酵母→沼气"的两级串联策略处理含二醇废冷却液，方法设计务实且具备工业转化潜力。亮点在于选择了天然耐受高浓度多元醇的非常规酵母Y. lipolytica，避免了毒性预处理环节；第二阶段利用酵母生物质产沼的效率较废液直接厌氧消化提升2.67倍，体现了"生物质中间载体"在危废能源化中的桥梁价值。局限同样明显：实验室规模验证、单一废液来源、约5.5%～6%的碳回收率意味着第一阶段碳损失较大，整体能量平衡有待生命周期评估确认。后续若能在工业废液批次差异适应性、连续流工艺衔接及经济性核算上补齐数据，该策略有望成为含醇危废处理的范式参考。
参考来源
Kosiorowska, K.E. Two-stage valorization of glycol-based waste fluids via Yarrowia lipolytica bioconversion and biomethane production. International Biodeterioration & Biodegradation, 2026. DOI: 10.1016/j.ibiod.2026.106389
DOI: 10.1016/j.ibiod.2026.106389