来源：Optimized conversion of wheat straw into single cell oils by Yarrowia lipolytica and Lipomyces tetrasporus and synthesis of advanced biofuels（Renewable Energy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
将农业废弃物麦秆转化为微生物油脂（Single Cell Oils, SCOs），是替代植物油生产先进生物燃料的重要路径。本研究系统比较了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）与四孢油脂酵母（Lipomyces tetrasporus）在未脱毒麦秆水解液中的产油性能，考察了接种龄、接种密度及培养基浓度的影响，并放大至10 L生物反应器。研究发现，两种酵母均能通过代谢呋喃类抑制物实现自我脱毒，其中四孢油脂酵母在稳定期接种时表现出更强的耐受性，最终在10 L规模获得21%的油脂得率和62%的胞内油脂含量，所得生物柴油符合ASTM和EN 14214国际标准。
研究背景
全球人口增长推动能源、食品和水资源需求持续上升，自然资源被过度开发，环境压力日益加剧。向可再生资源的可持续利用转型势在必行。欧盟可再生能源指令RED II限制使用与食物链竞争的原料，鼓励利用残渣生物质和废弃物生产先进生物燃料。微生物油脂（SCOs）因脂肪酸组成与常用植物油相似，被视为可持续生产生物燃料和化学品的理想原料。由微生物油脂制备的生物柴油不含硫、无毒、可生物降解，其燃烧排放的碳氢化合物比石油柴油少67%，CO₂少48%，颗粒物少47%。产油酵母是最具应用前景的微生物之一——根据不同原料，其胞内油脂积累量可达细胞干重的70%以上，生长速率快、易于培养，且比植物油占用更少的土地和水资源。本研究聚焦于两种产油酵母——解脂耶氏酵母和四孢油脂酵母，在未脱毒麦秆水解液中的油脂积累性能，并系统优化发酵条件。
研究方法
2.1 酵母菌株与预接种物制备
四孢油脂酵母Li-0407（DSM 70314，DSMZ，德国）和解脂耶氏酵母ATCC 46483（DSM 8218，DSMZ，德国）购自莱布尼茨研究所DSMZ——德国微生物与细胞培养物保藏中心。酵母保存在YPD琼脂斜面（Sigma-Aldrich）上，4°C条件下储存，每周传代一次。预接种物制备方法为：将每种菌株的一环接种于装有100 mL YPD肉汤的500 mL锥形瓶中，在27°C、200 rpm振荡条件下培养。为评估接种物代谢阶段的影响，根据前期试验结果（数据未显示），分别在指数期（解脂耶氏酵母培养48 h，四孢油脂酵母培养70 h）和稳定期初期（解脂耶氏酵母培养96 h，四孢油脂酵母培养120 h）收获各酵母。培养后，通过600 nm波长分光光度法测定细胞悬液精确体积，转移至培养基中以达到目标初始细胞浓度3.6×10⁶和6.2×10⁶ CFU/mL，分别对应OD 5和OD 10。接种前，培养基经121°C灭菌15 min。
【数据】菌株：Lipomyces tetrasporus Li-0407 (DSM 70314)、Yarrowia lipolytica ATCC 46483 (DSM 8218)；培养基：YPD肉汤；温度：27°C；转速：200 rpm；指数期收获时间：48 h（Y. lipolytica）/70 h（L. tetrasporus）；稳定期收获时间：96 h（Y. lipolytica）/120 h（L. tetrasporus）；接种浓度：3.6×10⁶和6.2×10⁶ CFU/mL（OD 5和OD 10）；灭菌条件：121°C、15 min
2.2 合成培养基中的生长试验
第一步，四孢油脂酵母和解脂耶氏酵母在两种合成培养基（SYN 40和SYN 80）上培养，两种培养基的化学组成相同，仅糖浓度不同（分别为低糖和高糖培养基）。SYN培养基的碳水化合物组成与麦秆水解液（WSH）相似，但不含抑制性化合物。SYN 80培养基组成如下：葡萄糖86.4 g/L、木糖22.1 g/L、半乳糖0.9 g/L、阿拉伯糖1.7 g/L、酵母提取物4.75 g/L、MgSO₄·7H₂O 1.5 g/L、MnSO₄·H₂O 0.004 g/L、CuSO₄·5H₂O 0.001 g/L、KH₂PO₄ 2 g/L、Na₂HPO₄ 0.3 g/L、ZnSO₄ 0.04 g/L（Sigma Aldrich，意大利）。SYN 40的葡萄糖浓度比SYN 80减半，为40.2 g/L。所有试验中，初始C/N比保持在85 mol/mol，pH设定为5.5，发酵过程中不进行调节。温度和搅拌分别设定为27°C和200 rpm。所有实验设三次重复。
【数据】SYN 80糖组成：葡萄糖86.4 g/L、木糖22.1 g/L、半乳糖0.9 g/L、阿拉伯糖1.7 g/L；SYN 40葡萄糖：40.2 g/L；C/N比：85 mol/mol；pH：5.5；温度：27°C；转速：200 rpm；重复次数：3
2.3 麦秆的表征与预处理
麦秆采集自意大利南部的农业产区。残留物分成约10 kg的批次并室内储存。预处理前，生物质干物质含量为91.9±0.2%。经50目粉碎后，风干麦秆按照Sluiter等方法[19]分析提取物、碳水化合物、木质素和灰分含量。原料组成（%）：38.4±3.2葡聚糖、16.7±1.1木聚糖、3.1±0.2阿拉伯聚糖、1.2±0.1半乳聚糖、20.6±1.1酸不溶性木质素、6.2±0.1灰分、4.3±0.3提取物。水解液成分分析使用HPIC（DIONEX ICS2500，德国）系统，配备Nucleogel Ion 300 OA色谱柱，在60°C下运行，以10 mN H₂SO₄溶液为流动相（0.4 mL/min）。检测器为Shodex RI101示差折光检测器。每项分析进行两次重复。生物质降解副产物使用HP1100系统（Agilent，美国）定量，配备RP18 5 μm LiChroCart 250×4 mm（Agilent，美国）色谱柱，在50°C下运行，以Milli-Q水/乙腈为流动相（1 mL/min），配二极管阵列检测器。定量在210和280 nm两个波长下进行。
蒸汽爆破被认为是将生物质分离为可发酵糖和残余木质素的最有效且最通用的预处理方法之一，也可使用酸或碱催化剂。麦秆预处理条件依据先前类似装置的研究论文[20]。具体而言，预处理前，生物质粉碎至粒径1.7–5.6 mm范围，浸泡在稀H₂SO₄溶液（0.05 M）中10 min，固液比10%（w/v）。原料上的酸载量通过浸渍液滴定测定，结果为1.4%（w/w）。预处理在203°C下进行5 min，与其他作者在麦秆酸催化蒸汽爆破过程中优化的工艺参数相似，以获得高纤维素水解率[21,22]。预处理产物过滤分离固体和主要含半纤维素的可溶部分。预处理产物（富含纤维素的固体部分和含可溶性半纤维素的液体部分）的组成按照Sluiter等方法[19]定量。由于蒸汽冷凝，预处理后的生物质含水量很高。随后挤压分离固体，再重新混合以达到酶解目标固体浓度20%。
【数据】麦秆干物质：91.9±0.2%；原料组成：葡聚糖38.4±3.2%、木聚糖16.7±1.1%、阿拉伯聚糖3.1±0.2%、半乳聚糖1.2±0.1%、酸不溶性木质素20.6±1.1%、灰分6.2±0.1%、提取物4.3±0.3%；粒径：1.7–5.6 mm；H₂SO₄浓度：0.05 M；浸泡时间：10 min；固液比：10%（w/v）；酸载量：1.4%（w/w）；预处理温度：203°C；时间：5 min；酶解固体浓度：20%
2.4 预处理麦秆的酶解
预处理麦秆的酶解在配备螺旋桨叶的10 L搅拌式生物反应器（Braun Biotech International，德国）中进行。Cellic™ CTec2（由Novozymes，丹麦惠赠）按每克不溶性葡聚糖15滤纸酶活单位（FPU）的添加量加入。酶制剂的滤纸酶活为190 FPU/g，按照Ghose方法[23]测定。生物质浆液在pH 4.8、50°C、180 rpm条件下水解90 h。然后将温度升至100°C保持数分钟以使酶蛋白变性。纤维素转化率约达90%。水解液随后添加营养盐溶液，在121°C下灭菌20 min。灭菌后的溶液接种酵母进行发酵。
【数据】酶解反应器：10 L搅拌式生物反应器；酶添加量：15 FPU/g不溶性葡聚糖；酶活：190 FPU/g；pH：4.8；温度：50°C；转速：180 rpm；时间：90 h；变性温度：100°C；纤维素转化率：约90%；灭菌：121°C、20 min
2.5 10 L生物反应器中的放大试验
SCOs的生产使用10 L搅拌罐生物反应器进行放大。此步骤通过接种四孢油脂酵母菌株并使用前期优化的生长条件完成。pH设定为5.5，随后通过添加NaOH 4N和H₂SO₄ 4M自动调节。溶解氧浓度通过搅拌速度和空气流量维持在至少40%以上。过程以补料分批模式运行。初始工作体积为6500 mL，添加两份各500 mL的浓缩补料后增至7500 mL。为避免补料分批操作期间培养基稀释，水解液在实验室真空系统中于7 kPa、180 rpm、60°C条件下浓缩5 h，将添加了微量元素的13.5 L体积减至最终体积1000 mL。
【数据】反应器：10 L搅拌罐；pH：5.5（NaOH 4N/H₂SO₄ 4M自动调节）；溶解氧：≥40%；模式：补料分批；初始体积：6500 mL；终体积：7500 mL；补料：2×500 mL；浓缩条件：7 kPa、180 rpm、60°C、5 h；浓缩体积：13.5 L→1000 mL
2.6 脂质提取与脂肪酸甲酯（FAMEs）测定
生物转化过程结束时回收的酵母生物质中的脂质提取采用先前描述的方案[16]。根据文献[24]的方法对微生物脂质进行转甲基化。甲酯谱图通过Agilent GC7890A气相色谱仪分析，配备OMEGAWAX 250（Agilent）毛细管柱（30 m×0.32 mm×0.50 μm）和火焰离子化检测器。柱温箱程序：80°C保持11 min，以20°C/min从80°C升至180°C，180°C保持22 min。氦气为载气（1 mL/min）。分流比1:19（v/v）。甲酯的鉴定通过将峰保留时间与FAMEs标准混合物C8–C24（CRM 18918 Sigma-Aldrich）比对完成。三乙酸甘油酯（glyceryl triundecanoate）作为内标评估脂质提取率，十七烷酸甲酯作为内标用于色谱分析中FAME的定量。
【数据】GC色谱柱：OMEGAWAX 250（30 m×0.32 mm×0.50 μm）；载气：氦气（1 mL/min）；分流比：1:19；升温程序：80°C 11 min→20°C/min→180°C 22 min；内标：三乙酸甘油酯、十七烷酸甲酯
2.7 生物柴油合成与表征
上述提取的脂质按照经典转酯化方法[25]转化为生物柴油。简言之，50 g经烘箱干燥（60°C过夜）的微生物油脂与甲醇在催化剂存在下进行转酯化反应。所得脂肪酸甲酯经分离纯化后，按照国际生物柴油标准（ASTM和EN 14214）对其主要理化性质进行表征，包括密度、运动黏度、十六烷值、冷滤点、闪点、硫含量、酸值等参数。
【数据】油脂用量：50 g；干燥条件：60°C过夜；表征标准：ASTM、EN 14214
研究结果
3.1 不同碳浓度、接种水平和生长代谢阶段下酵母在合成培养基中的表现
先前研究报道了解脂耶氏酵母和四孢油脂酵母在多种碳源转化为SCOs中的应用[29,30]，结果表明过程产率受多种因素影响，包括酵母菌株、碳源类型和浓度以及工艺设置。在最近一篇关于四孢油脂酵母和弯隐球酵母（C. curvatus）转化菜蓟（cardoon）水解液的研究中，我们发现接种物的生长阶段影响菌株将某些降解产物代谢为无毒分子的能力[16]。显然，不同水解液因比组成不同可能具有不同的抑制阈值，因此需要对发酵设置进行精细调整。尽管菜蓟和麦秆的糖组成及代表性抑制物相似，但仍可能存在一些固有差异。更广泛地说，鉴于木质纤维素基质的复杂性，水解液中可能存在未被鉴定的额外降解产物。Vergara等人[31]在麦秆酸水解液中发现了与菜蓟不同的木质素衍生产物。即使本工作使用的酶解比酸解更温和，也不能排除存在不同木质素片段从而产生不同整体抑制效果的可能性。
本研究中，解脂耶氏酵母和四孢油脂酵母首先在糖组成与麦秆水解液相似的合成培养基中测试。这对于探索葡萄糖和木糖的吸收动力学以及生物质、脂质和多元醇的转化产率很重要。试验在高、低糖培养基（分别为SYN 80和SYN 40）中进行，使用两种接种物代谢阶段——稳定期（SP）和指数期（EP）——以及两种接种量（对应OD 5和OD 10）。为研究接种物两种代谢阶段（SP和EP）与两种糖浓度（SYN 80和SYN 40）之间的显著差异，过程产率通过ANOVA进行统计分析。
表1所示的分析显示，对于接种密度OD 10的解脂耶氏酵母菌株，无统计学显著差异。仅在SP接种阶段的生物量产率（Y DCW）值上，SYN 80和SYN 40之间存在可辨识的差异（p<0.05）。相反，对于OD 5接种密度，在EP接种阶段，SYN 80和SYN 40之间的Y DCW和Y lipids值均显示出显著差异。解脂耶氏酵母的生物量产率在47–63%范围内，比四孢油脂酵母（24–38%范围）更高。最高生物量产量63%是在解脂耶氏酵母以EP接种、SYN 40和OD 5条件下获得的（图1a，橙色柱）。在相同条件下，解脂耶氏酵母产生了最佳油脂产率，对应13.5%的脂质（图1b，橙色柱）。在相同的接种阶段EP和培养基浓度SYN 40下，以更高接种量OD 10获得了相似产率（图1b，橙色柱），对应26%的脂质细胞含量（图1c，橙色柱）。SP接种在最高糖浓度培养基（即SYN 80）中显示出比EP更高的生物量产率（DCW）（图1a，蓝色柱）。解脂耶氏酵母观察到的过程产率与Enshaeieh等人[32]关于含95 g/L葡萄糖的合成培养基转化的结果相当。
检测到中等含量的甘露醇，范围为1.3–5.8 g/L。一些作者描述了解脂耶氏酵母DSM 8218菌株产生柠檬酸[33]，不同解脂耶氏酵母菌株产生赤藓糖醇、甘露醇和阿拉伯糖醇[34]，菌株VKM Y-2373产生异柠檬酸[35]，菌株A8产生α-酮戊二酸[36]，以及6种不同解脂耶氏酵母菌株产生乙酸[37]。虽然甘露醇的产生已在多种解脂耶氏酵母菌株中观察到，但迄今为止尚无关于DSM 8218菌株在糖上生长时产生甘露醇的具体数据报道，本文结果扩展了该微生物的知识基础。未发现与工艺条件的统计相关性，因此需要进一步分析来评估这些代谢物形成与特定设置之间的相关性。
在所有条件下，四孢油脂酵母产生的脂质是解脂耶氏酵母的1.5至2倍，范围分别为13.5–23.2%和8.3–13.5%（表1）。以OD 10为接种水平时，DCW和脂质产率均受糖浓度显著影响（p<0.05）（表1）。如图1a和1b绿色柱所示，最高的DCW产率（38.8%）和脂质产率（23%）是在SP细胞、SYN 40和最高接种水平（OD 10）条件下获得的，而最高脂质含量（64%）是在SYN 40中以EP细胞、OD 10接种获得的（图1c，黄色柱）。除脂质产生外，还观察到少量两种次级产物的生成，其中一种被鉴定为甘露醇。这与Caporusso等人[16]最近发表的关于四孢油脂酵母次级代谢物分析一致。需要进一步分析以评估这些代谢物形成与特定工艺条件之间的相关性。
四孢油脂酵母在某些条件下表现出比解脂耶氏酵母高出多达40%的生产率（表1），且两种酵母在低糖培养基中均表现出更高的生产率。在SYN 80中，两种酵母均无法完全消耗葡萄糖，过程结束时培养基中仍有超过50%的木糖残留（仅在解脂耶氏酵母SP细胞中约83%被消耗）。相反，在SYN 40中，仅四孢油脂酵母在过程结束时培养基中残留不到50%的木糖（数据未显示）。此外，水解液中半乳糖和阿拉伯糖的浓度相对于葡萄糖和木糖较低，低于2 g/L。阿拉伯糖未被转化，半乳糖和葡萄糖同时被消耗，半乳糖对脂质产生的最大贡献可忽略不计，低于5%。
许多产油微生物能够在不同碳源上生长，包括多种C5糖（木糖、阿拉伯糖等）[38,39]。酵母在C5糖上的代谢研究对于木质纤维素生物质全组分的完全增值利用非常重要。此外，已有研究发现，在某些情况下使用木糖作为脂质生产的碳源甚至可能比葡萄糖表现更好。葡萄糖的理论最大脂质产率为0.32 g/g，而木糖在磷酸酮醇酶途径情况下的理论最大产率约为0.34 g/g，戊糖磷酸途径为0.30 g/g[12]。木糖消耗通常在葡萄糖耗尽后或对应特定胞内糖浓度比时开始。相对于培养基中其他可用碳源，酵母对葡萄糖具有更高的亲和力，这是一个众所周知的过程，已在许多产油物种中因碳分解代谢物阻遏效应而有详细记录[40]。该机制在某些情况下导致二次生长（diauxic growth）现象，影响次级糖的代谢，并进一步限制了发酵过程中的转化效率[41]。一些作者还发现，木糖的缓慢转运速率限制了下游途径；因此，提高转运速率对于改善细胞生长速率和木糖转化效率是必要的[42,43]。
表2列出了通过所研究的设置获得的甘油三酯的详细脂肪酸（FAs）组成。最常见的脂肪酸谱如图3所示。
【数据】Y. lipolytica生物量产率范围：47–63%；L. tetrasporus生物量产率范围：24–38%；最高生物量产量：63%（EP、SYN 40、OD 5）；Y. lipolytica最佳脂质产率：13.5%；脂质细胞含量：26%（OD 10）；甘露醇范围：1.3–5.8 g/L；L. tetrasporus脂质产率范围：13.5–23.2%；Y. lipolytica脂质产率范围：8.3–13.5%；L. tetrasporus最高DCW产率：38.8%（SP、SYN 40、OD 10）；最高脂质产率：23%；最高脂质含量：64%（EP、SYN 40、OD 10）；木糖残留：SYN 80中>50%（Y. lipolytica SP约83%）；半乳糖对脂质贡献：<5%
3.2 未脱毒麦秆水解液中的发酵表现与放大
在合成培养基中完成工艺优化后，研究进一步在未脱毒的麦秆水解液（WSH）中验证两种酵母的生长和产油性能。蒸汽爆破预处理（203°C、300 s）结合酶解（15 FPU/g底物、20%固液比）获得的混合麦秆水解液含有86 g/L葡萄糖和22 g/L木糖，以及2.3 g/L乙酸和0.9 g/L呋喃类化合物。试验在两种水解液浓度下进行：未稀释的WSH（含86 g/L葡萄糖和22 g/L木糖）和稀释培养基（含40 g/L葡萄糖和22 g/L木糖，即WSH 40）。结果表明，两种酵母均能在未脱毒水解液中生长。解脂耶氏酵母在所有测试设置中均能脱毒培养基，而四孢油脂酵母仅在稳定期接种时才能脱毒培养基。接种龄在决定细胞对微生物胁迫反应的显著差异中起决定性作用——稳定期的四孢油脂酵母接种物表现出比指数期更强的胁迫耐受性。在低糖浓度培养基中记录了更高的生长和脂质产量。在此条件下（葡萄糖和木糖浓度分别为40和22 g/L），脂质产率和细胞积累量分别为18%和67%。
在摇瓶优化之后，使用四孢油脂酵母在10 L中试生物反应器中以补料分批模式进行SCOs生产放大。以OD 5的接种量、稳定期（SP）接种于WSH 40培养基中。发酵过程中通过NaOH和H₂SO₄自动维持pH 5.5，溶解氧维持在40%以上。最终获得的脂质产率和细胞含量分别为21%和62%。对四孢油脂酵母在10 L生物反应器中产生的脂肪酸谱分析显示，其主要脂肪酸为油酸和棕榈酸，不饱和脂肪酸（UFAs）和饱和脂肪酸（SFAs）的比例适宜生物柴油生产。提取的SCOs经转酯化反应转化为生物柴油，其整体性能符合国际生物柴油标准ASTM和EN 14214的要求。
【数据】WSH组成：葡萄糖86 g/L、木糖22 g/L、乙酸2.3 g/L、呋喃类化合物0.9 g/L；WSH 40：葡萄糖40 g/L、木糖22 g/L；L. tetrasporus在WSH 40中脂质产率：18%、细胞脂质含量：67%；10 L反应器脂质产率：21%、细胞脂质含量：62%；主要脂肪酸：油酸、棕榈酸
讨论与解读
本研究首次系统考察了四孢油脂酵母Li-0407和解脂耶氏酵母ATCC 46483在未脱毒蒸汽爆破麦秆水解液上的生长与产油性能。摇瓶规模的研究揭示了几个关键发现：接种龄对细胞胁迫耐受性具有决定性影响——四孢油脂酵母在稳定期接种时能有效脱毒培养基并生长，而指数期接种则不能；解脂耶氏酵母在所有测试条件下均表现出脱毒能力，达到61%的生物量产率，但脂质产率仅5%，远低于四孢油脂酵母。低糖浓度（40 g/L葡萄糖）有利于脂质积累，四孢油脂酵母在此条件下达到18%的脂质产率和67%的胞内脂质含量。10 L反应器放大试验进一步验证了工艺可行性，获得21%的脂质产率和62%的细胞含量。所得微生物油脂富含油酸和棕榈酸，转化所得生物柴油符合ASTM和EN 14214国际标准。
编译者解读
该研究的核心价值在于"未脱毒"路径——直接利用含抑制物的真实水解液而非合成培养基，更贴近工业化场景。接种龄效应的发现（稳定期接种增强四孢油脂酵母的脱毒能力）是一个低成本、易操作的工艺优化杠杆，无需基因改造即可提升抑制物耐受性。值得注意的是，解脂耶氏酵母虽脱毒能力强但产脂率偏低，而四孢油脂酵母产脂率更高但脱毒能力受限——这种菌株间的"性能互补"提示未来可探索共培养策略。放大至10 L后脂质含量略有下降（67%→62%），说明搅拌、氧传质等放大效应对产油仍有影响。从合成生物学角度看，若能进一步解析四孢油脂酵母在稳定期启动的脱毒相关基因网络，或将呋喃代谢通路导入高产油菌株，有望突破抑制物耐受与高产脂兼得的瓶颈。
参考来源
Caporusso A, et al. Optimized conversion of wheat straw into single cell oils by Yarrowia lipolytica and Lipomyces tetrasporus and synthesis of advanced biofuels. Renewable Energy, 2023. DOI: 10.1016/j.renene.2022.11.059
DOI: 10.1016/j.renene.2022.11.059