来源：A high-tolerance Saccharomyces cerevisiae for 2-phenylethanol production: mechanistic insight and jujube pomace utilization（LWT）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
2-苯乙醇（2-PE）是食品、日化与香料行业广泛需求的高价值天然芳香化合物，但微生物发酵生产长期受制于产物毒性与原料成本。本研究从高温大曲中分离出一株野生型酿酒酵母JQ-5，该菌株展现出对2-PE高达4 g/L的耐受性，并通过连续补料发酵在5-L生物反应器中实现4.581 g/L的最高产量。研究还成功利用枣渣水解液这一低成本食品工业副产物生产2-PE，产量达3.725 g/L，为天然香料的可持续生物制造提供了新路径。
研究背景
消费者对天然风味化合物的需求持续增长，推动全球天然配料市场快速扩张。2-苯乙醇具有典型玫瑰香气，广泛用于食品、饮料、化妆品和制药行业，是最具商业价值的香料化合物之一。植物提取因产量极低、成本高昂而缺乏商业吸引力；化学合成虽为主流，但使用有毒前体、反应条件苛刻且产生有害副产物，限制其在食品领域的应用。微生物生物合成提供了一种环境友好的替代方案，可生产符合FDA和欧盟法规的"天然"2-PE。已有多类微生物被报道可用于2-PE生物合成，包括酿酒酵母、解脂耶氏酵母、库德里阿兹威毕赤酵母、米曲霉、不动杆菌ANG344B和地衣芽孢杆菌等。然而，产物毒性抑制和高生产成本仍是制约工业化应用的核心瓶颈。
研究方法
2.1 实验材料
大曲样品采集自河南仰韶酒业有限公司（中国河南）。2-苯乙醇（2-PE，纯度≥99.0%，HPLC级）和L-苯丙氨酸（L-Phe，纯度≥98%，试剂级）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯市）。枣渣原料由好想你健康食品股份有限公司（中国河南）提供，使用前经粉碎并在80°C干燥至恒重。其余化学试剂均由国药集团化学试剂有限公司（中国上海）供应。
【数据】2-PE纯度：≥99.0%（HPLC）；L-Phe纯度：≥98%；枣渣干燥温度：80°C；干燥终点：恒重
2.2 产2-PE菌株的分离与鉴定
取5克大曲样品悬浮于95 mL无菌水中并均质化。将悬液从10⁻¹至10⁻⁶进行梯度稀释。取各稀释度100 μL涂布于YPD（酵母提取物蛋白胨葡萄糖）平板，30°C培养48小时。挑取具有玫瑰香气的单菌落，接种至YPD培养基培养72小时。随后使用HPLC（高效液相色谱）分析上清液中的2-PE浓度。分离菌株通过18S rRNA分析进行鉴定。使用DNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，中国）提取基因组DNA。18S rRNA区域用通用引物18S-F（5′-CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3′）和18S-R（5′-CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT-3′）进行扩增。扩增的PCR产物经纯化后由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。序列比对使用BLASTn对核苷酸数据库进行，系统发育树采用MEGA 11.0软件以邻接法构建。
【数据】大曲样品量：5 g；无菌水量：95 mL；稀释梯度：10⁻¹–10⁻⁶；涂布量：100 μL/平板；培养基：YPD；培养温度：30°C；培养时间：48 h（分离）/72 h（液体培养）
2.3 菌株JQ-5合成2-PE的研究
#### 2.3.1 氮源对菌株JQ-5合成2-PE的影响
将菌株JQ-5接种至五种含不同氮源的培养基中（表S1）。种子液接种前调整初始OD600至1.0。各培养基按1%（v/v）接种量接种种子液，30°C培养48小时。收集培养上清液测定2-PE浓度。
【数据】接种量：1%（v/v）；初始OD600：1.0；培养温度：30°C；培养时间：48 h
#### 2.3.2 菌株JQ-5的全基因组测序分析
全基因组测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。测序结果使用KOG（真核直系同源组）、GO（基因本体论）和KEGG（京都基因与基因组百科全书）数据库进行功能注释。
【数据】测序机构：生工生物工程（上海）股份有限公司；注释数据库：KOG、GO、KEGG
#### 2.3.3 实时荧光定量PCR分析
实验组在补充L-Phe的FM培养基中培养，对照组在不含L-Phe的FM培养基中培养。培养物按1%（v/v）接种，30°C、150 rpm条件下培养24小时。使用RNA提取试剂盒从细胞中提取总RNA，各总RNA样品用HiScript III RT SuperMix试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，中国）进行逆转录。选取9个候选参考基因，RT-qPCR引物使用Primer Premier 5软件（PREMIER Biosoft International，美国加利福尼亚州帕洛阿尔托）设计（表S2）。RT-qPCR反应在Applied Biosystems（ABI）7500实时PCR系统（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）上进行。热循环条件为：95°C 5分钟，随后40个循环的95°C 15秒和60°C 30秒。目标基因的相对表达水平基于2⁻ΔΔCt方法进行分析。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养温度：30°C；转速：150 rpm；培养时间：24 h；RT-qPCR条件：95°C 5 min；40个循环（95°C 15 s，60°C 30 s）；分析方法：2⁻ΔΔCt
2.4 菌株JQ-5对2-PE的耐受性
在补充不同浓度2-PE的YPD培养基中评估2-PE对菌株JQ-5生长的影响。细胞在YPD肉汤中于30°C、180 rpm条件下培养，每隔12小时测定OD600监测生长。点板实验中，细胞悬液依次稀释至10⁰、10⁻¹、10⁻²和10⁻³。取各稀释度样品点样于含不同浓度2-PE的YPD琼脂平板上，30°C培养48小时。为阐明菌株JQ-5的2-PE耐受机制，进行了转录组学分析。菌株JQ-5在YPD培养基中30°C预培养过夜。基于2-PE对细胞生长的抑制效果，选择3 g/L作为处理浓度。随后向培养物中添加2-PE至终浓度3 g/L，对照组不添加2-PE。继续培养12小时后，收集细胞并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行转录组测序。所有样品均设生物学重复。
【数据】YPD肉汤培养条件：30°C、180 rpm；OD600监测间隔：12 h；点板稀释度：10⁰–10⁻³；琼脂平板培养：30°C、48 h；2-PE处理浓度：3 g/L；处理时间：12 h
2.5 5-L生物反应器中2-PE的发酵生产
菌株JQ-5生产2-PE在5-L搅拌釜生物反应器中进行，工作体积3 L。基础发酵培养基含40 g/L葡萄糖、0.5 g/L MgSO₄、5 g/L KH₂PO₄、5 g/L酵母提取物和7 g/L L-Phe。培养基组分基于前期摇瓶优化结果确定。发酵在28°C下进行，初始搅拌转速300 rpm。通过自动添加1 M NaOH维持pH在5.5 ± 0.1。溶解氧（DO）通过通气量（0.5–2.0 vvm）和搅拌的级联调节控制在40%空气饱和度。反应器按10%（v/v）接种量接种种子液。比较三种发酵策略（批次发酵、补料分批发酵和连续补料发酵）以评估2-PE产量。三种发酵策略的操作参数见表1。每12小时取样测定生物量、葡萄糖、L-Phe和2-PE浓度。
【数据】反应器：5-L搅拌釜，工作体积3 L；基础培养基：40 g/L葡萄糖、0.5 g/L MgSO₄、5 g/L KH₂PO₄、5 g/L酵母提取物、7 g/L L-Phe；温度：28°C；初始转速：300 rpm；pH：5.5 ± 0.1（1 M NaOH自动调节）；DO：40%空气饱和度；通气量：0.5–2.0 vvm；接种量：10%（v/v）；取样间隔：12 h
2.6 以枣渣为底物发酵生产2-PE
将枣渣与0.1%（w/v）纤维素酶溶液（pH 4.6）按1:30的固液比混合。混合物在45°C酶解72小时，然后离心。收集上清液浓缩得到枣渣水解液（JPH）。将JPH的葡萄糖浓度调整为40 g/L，并补充5 g/L L-Phe，随后在121°C灭菌20分钟。发酵培养基按10%（v/v）接种酵母，30°C培养。发酵进行至12小时时，向培养物中额外添加10 g/L JPH和3 g/L L-Phe。每12小时取样测定生物量、葡萄糖、L-Phe和2-PE浓度。发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次。合并有机相，脱水过夜，40°C旋转蒸发浓缩得到2-PE提取物。使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行结构表征，气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析挥发性组分。
【数据】纤维素酶浓度：0.1%（w/v）；酶解pH：4.6；固液比：1:30；酶解温度：45°C；酶解时间：72 h；JPH葡萄糖调整浓度：40 g/L；L-Phe补充量：5 g/L；灭菌条件：121°C、20 min；接种量：10%（v/v）；培养温度：30°C；补料（12 h）：10 g/L JPH + 3 g/L L-Phe；萃取：乙酸乙酯等体积×3；浓缩温度：40°C
2.7 分析方法
使用分光光度计（上海美析仪器有限公司，中国）在600 nm波长处测定光密度（OD600）监测细胞密度。上清液中2-PE、葡萄糖和L-Phe的浓度按照此前描述的方法通过HPLC测定。HPLC配备二极管阵列检测器（DAD）和C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，Thermo，美国马萨诸塞州）。流动相为甲醇-水（50:50，v/v），流速0.8 mL/min，柱温35°C。进样量10 μL，检测波长260 nm。所有分析均设三次重复。GC–MS分析中，挥发性化合物经0.45 μm滤膜过滤后，使用C18固相萃取（SPE）从培养上清液中提取。洗脱液浓缩后通过GC–MS（Agilent 7890A–5975C）分析。分离在Supelcowax毛细管柱上进行，氦气为载气，在电子轰击电离（70 eV）全扫描模式下鉴定化合物。详细的SPE程序和GC–MS升温程序见补充材料。
【数据】OD600测定波长：600 nm；HPLC检测波长：260 nm；流动相：甲醇-水（50:50，v/v）；流速：0.8 mL/min；柱温：35°C；进样量：10 μL；GC–MS电离：70 eV全扫描；滤膜孔径：0.45 μm
研究结果
3.1 产2-PE菌株的分离与鉴定
高温大曲是多样微生物群落的丰富储库，也是分离新型产香菌株的理想来源。本研究从大曲中初步分离到16株散发香气的菌株。其中6株在YPD琼脂平板上呈现明显玫瑰香气的菌株被选入液体培养。菌株JQ-5的2-PE产量显著高于其他菌株（P < 0.05），培养48小时后产量达0.468 g/L（图1）。菌株JQ-5的2-PE产量大幅高于已报道的其他野生型菌株，凸显其作为2-PE生产候选菌株的潜力。形态学特征显示，菌株JQ-5的菌落呈现典型的酵母样特征，包括乳白色、凸起菌落和多边芽殖的椭球形细胞。基于18S rRNA序列的系统发育分析显示，菌株JQ-5与模式菌株酿酒酵母NRRL Y-12632亲缘关系密切。因此，菌株JQ-5被鉴定为酿酒酵母（图S1）。
【数据】初筛产香菌株数：16株；玫瑰香气菌株数：6株；JQ-5的2-PE产量：0.468 g/L（48 h）；鉴定结果：酿酒酵母（与NRRL Y-12632近缘）
3.2 酿酒酵母JQ-5的2-PE生物合成途径
#### 3.2.1 底物依赖型的2-PE生物合成
氮素可利用性是2-PE生物合成途径的关键调控因子。不同氮源培养实验揭示了菌株JQ-5中强烈的底物依赖性生产特征（图2）。最高2-PE效价在FM培养基中获得（2.875 g/L），其次为M1培养基（1.357 g/L）。相比之下，YPD培养基中的2-PE产量低得多，在M2培养基（L-Phe + (NH₄)₂SO₄）中进一步降至0.743 g/L。M3培养基中仅检测到痕量2-PE（0.008 g/L），该培养基以铵盐为唯一氮源。当L-Phe作为主要氮源且Ehrlich途径被激活时，菌株JQ-5的2-PE产量得到提高。FM培养基中补充酵母提取物等复合氮源可进一步增强生物量积累和2-PE产量。然而，铵盐补充强烈抑制2-PE合成，与先前报道一致。这些结果表明菌株JQ-5的2-PE生物合成强烈依赖氮源组成。
【数据】FM培养基2-PE效价：2.875 g/L；M1培养基：1.357 g/L；YPD培养基：低于FM；M2培养基：0.743 g/L；M3培养基：0.008 g/L（铵盐为唯一氮源）
#### 3.2.2 酿酒酵母JQ-5的基因组注释
菌株JQ-5的完整基因组为11.27 Mb，平均GC含量38.1%。功能注释为其2-PE生物合成代谢潜力提供了基因组层面的见解（图S2）。GO分析显示，参与代谢过程、生物调控、刺激应答、催化活性和转运蛋白活性的基因显著富集，表明发酵期间存在活跃的代谢功能和适应性响应。编码膜和细胞器组分的基因也高度代表，提示胞内转运和膜相关活性增强。这些功能与2-PE发酵过程中的氨基酸摄取、代谢物转运和应激适应密切相关。KOG分类显示与翻译、转录、翻译后修饰以及氨基酸转运和代谢相关的类别富集。这种富集反映了菌株JQ-5具有强大的蛋白质合成、酶更新和氨基酸分解代谢能力。高效的蛋白质合成和代谢调控对于维持酿酒酵母中高Ehrlich途径活性和2-PE生产性能至关重要。KEGG注释进一步表明，与氨基酸代谢、碳水化合物代谢和能量代谢相关的途径高度代表，支持2-PE生物合成所需前体和能量的供应。此外，参与信号转导和环境适应的途径提示菌株JQ-5在发酵相关应激条件下具有调控灵活性。类似的代谢和调控特征已在2-PE耐受和高产酵母菌株中有报道。菌株JQ-5的基因组特征为其作为2-PE生产候选菌株的潜力提供了分子基础。
【数据】基因组大小：11.27 Mb；GC含量：38.1%；注释数据库：GO、KOG、KEGG
#### 3.2.3 RT-qPCR关键基因表达分析
通过KEGG注释鉴定出9个参与2-PE生物合成的基因，归属莽草酸途径和Ehrlich途径（图3A和表S3）。莽草酸途径通过基因ARO1、ARO2、ARO3、ARO7和PHA2编码的酶介导从葡萄糖从头合成2-PE。相比之下，Ehrlich途径负责从L-Phe通过转氨、脱羧和还原反应合成2-PE，分别由基因ARO8、ARO9、ARO10和ADH介导。RT-qPCR分析显示，Ehrlich途径相关基因的表达水平显著高于莽草酸途径（图3B），表明Ehrlich途径在菌株JQ-5的2-PE生物合成中发挥主要作用。已有报道指出莽草酸途径受多个限速步骤和反馈调控的制约，导致2-PE产量相对较低。本研究中，ARO8、ARO9、ARO10和ADH的表达水平分别增加了2.48倍、19.70倍、15.14倍和3.51倍。ARO10的强烈上调表明脱羧步骤可能在Ehrlich途径高效生产2-PE中发挥重要作用。
【数据】ARO8表达上调：2.48倍；ARO9表达上调：19.70倍；ARO10表达上调：15.14倍；ADH表达上调：3.51倍
3.3 菌株JQ-5的2-PE耐受性研究
#### 3.3.1 菌株JQ-5的2-PE耐受性评价
高浓度2-PE可损害膜完整性并抑制微生物生长，从而限制2-PE生物生产的最终效价。因此，细胞对2-PE的高耐受性是提高产量的关键决定因素。本研究在补充不同浓度2-PE的固体（YPD琼脂）和液体（YPD肉汤）培养基中评估了菌株JQ-5对2-PE的耐受性。图4显示，低浓度2-PE（≤2 g/L）对细胞生长几乎无抑制作用，生物量与对照组相当。即使在YPD平板的10⁻³稀释度下仍观察到密集的细胞生长，表明细胞活力高。在3 g/L 2-PE条件下，菌株JQ-5的延滞期略有延长，最终生物量较对照组下降26.38%，但仍实现大量生长。将2-PE浓度提高至4 g/L代表了菌株JQ-5的耐受阈值。在此高胁迫条件下，生物量降至对照组的45.18%，但YPD平板上可见的菌落生长表明仍有相当比例的细胞保持活力。该耐受水平超过常规酵母菌株的报道值——后者通常在2.0–3.0 g/L时即被抑制。
【数据】2-PE低抑制浓度：≤2 g/L；3 g/L时生物量下降：26.38%；4 g/L时生物量：对照组的45.18%；常规酵母抑制浓度：2.0–3.0 g/L
#### 3.3.2 2-PE胁迫下菌株JQ-5的转录组学分析
通过2-PE处理组与对照组之间的转录组学分析，研究了菌株JQ-5对2-PE的耐受机制。如图5A所示，共鉴定出1138个差异表达基因（DEG），包括723个上调基因和415个下调基因。上调基因占主导地位表明菌株JQ-5启动了广泛的转录和代谢适应以响应2-PE胁迫。
【数据】差异表达基因总数：1138个；上调基因：723个；下调基因：415个
#### 3.3.2.1 线粒体响应与能量调控
GO富集分析确定线粒体相关功能是与2-PE胁迫细胞响应相关的主要组分（图5B）。DEG在线粒体内膜相关的细胞组分条目中显著富集——原文此处截断，后续内容未在节选中呈现。
【数据】富集分析：线粒体内膜相关细胞组分条目显著富集（原文节选未提供更多数值）
讨论与解读
本研究从高温大曲中分离的野生型酿酒酵母JQ-5展现出高耐受性和高效的2-PE生产能力。RT-qPCR和转录组分析表明，Ehrlich途径在2-PE生物合成中占主导地位，而线粒体和能量代谢相关响应可能参与细胞对2-PE胁迫的适应。连续补料发酵进一步提高了2-PE生产效率，枣渣的成功利用证明了以低成本副产物生产2-PE的可行性。总体而言，本研究为野生型酿酒酵母的胁迫适应提供了见解，并凸显了农业工业残留物用于可持续天然香料生产的潜力。
编译者解读
该研究最值得关注之处在于从传统大曲中直接筛选出天然高耐受菌株，而非依赖实验室驯化或基因工程改造——这一策略在工业应用层面具有成本与法规优势。JQ-5在4 g/L 2-PE下仍保持近半数生物量，突破了常规酵母2.0–3.0 g/L的抑制阈值，这为原位产物萃取或高密度发酵提供了更大的操作窗口。枣渣水解液的成功利用则展示了食品工业副产物增值的可行路径。不过，转录组分析揭示的线粒体适应机制仍停留在关联层面，关键靶基因的功能验证尚需基因编辑等手段加以确认。未来若能将JQ-5的耐受基因模块与代谢工程改造相结合，或可进一步提升产量。
参考来源
Song, L. (2026). A high-tolerance Saccharomyces cerevisiae for 2-phenylethanol production: mechanistic insight and jujube pomace utilization. LWT, 2026. DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119692
DOI: 10.1016/j.lwt.2026.119692