来源：Metabolic engineering combined with fermentation optimization enables sustainable production of erythritol by Yarrowia lipolytica from peanut meal and glucose（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
赤藓糖醇作为低热量甜味剂市场需求快速增长，但其工业发酵成本居高不下。本研究以食品加工废弃物花生粕（PM）替代传统培养基中的酵母提取物和蛋白胨，支持解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）CA20菌株的生长与赤藓糖醇合成。通过培养基组分与发酵条件优化，赤藓糖醇产量达125.25 g/L（3.7-L生物反应器）；结合转录组分析与基因工程改造，最终工程菌株CE1在108小时内产赤藓糖醇168.78 g/L，产率0.73 g/g。研究为赤藓糖醇经济化生产与花生粕高值化利用提供了完整技术路线。
研究背景
过量糖摄入已引发肥胖、糖尿病及代谢综合征等公共健康问题。以赤藓糖醇为代表的低热量天然甜味剂因不干扰胰岛素和血糖水平、消化耐受性高而备受青睐。截至2023年，全球赤藓糖醇产值预计超过1.5亿美元。工业上主要利用非常规酵母解脂耶氏酵母通过深层液态发酵生产赤藓糖醇——该菌经戊糖磷酸途径将葡萄糖或甘油转化为赤藓糖醇，此过程依赖高浓度底物形成的高渗透压胁迫。然而，高渗环境不可避免抑制细胞代谢活性、削弱产物合成，使赤藓糖醇生产成本居高不下。现有研究多采用粗甘油、废弃食用油等替代碳源降低原料成本，但发酵培养基仍需添加(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、KH₂PO₄、酵母提取物、CaCO₃等多种组分，组分复杂且成本难控。花生粕富含蛋白质、脂肪酸和多糖，已被证实可支持铜绿假单胞菌和酿酒酵母的固态发酵生长，但其能否在液态深层发酵中支持解脂耶氏酵母生长与赤藓糖醇合成，此前未见报道。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株与质粒详细信息见原文补充表S1和S2。除特别说明外，所有解脂耶氏酵母菌株在YPD或YNBD培养基中、30°C、250-mL锥形瓶内培养，摇床转速200 r/min。赤藓糖醇发酵实验使用1-L锥形瓶，按实验设计向培养基中添加高浓度葡萄糖。所有大肠杆菌菌株在LB培养基中、37°C、200 r/min摇床培养。必要时LB培养基中添加氯霉素或氨苄青霉素（终浓度50 μg/mL）以维持质粒。固体YPD和YNBD平板制备时添加琼脂20 g/L。所有抗生素（USP级）及其他化学试剂（AR级）购自生工生物工程（上海）股份有限公司（中国上海松江）和国药集团化学试剂有限公司（中国上海黄浦）。本研究所用培养基详细信息见原文表1。
【数据】培养温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；摇床转速：200 r/min；抗生素浓度：50 μg/mL；琼脂浓度：20 g/L
2.2 花生粕组分测定
花生粕由山东巨宏生物科技研究院有限公司（中国山东威海）提供。溶解蛋白和游离脂肪酸（FFA）浓度分别使用蛋白含量检测试剂盒（货号：AKPR015）和FFA含量检测试剂盒（货号：AKFA008M）测定，操作按北京盒子生工科技有限公司（中国北京通州）提供的说明书进行。
【数据】花生粕来源：山东巨宏生物科技研究院；检测试剂盒：AKPR015（蛋白）、AKFA008M（FFA）
2.3 酶活与辅酶含量测定
转酮醇酶（TKL）和赤藓糖还原酶（ER）活性按Liu等（2020）所述方法测定。简要流程如下：将解脂耶氏酵母CA20在YPD培养基中培养48小时的培养物按6:100比例稀释至80 mL新鲜YPD培养基（含250 g/L葡萄糖，自然pH，30°C）或M4培养基（初始pH 3.0，28°C）中，培养基装于1-L锥形瓶。培养60小时后，室温离心收集细胞（8000 r/min，5 min），用PBS溶液（0.2 M，pH 6.5）重悬。随后使用杭州奥盛仪器有限公司提供的组织破碎仪（Bioprep-24R，中国杭州）在4°C处理细胞，4°C离心（10000 r/min）5 min去除细胞碎片。所得粗酶提取液用于后续酶活分析。一个酶活单位（U）定义为在指定条件下1.0 mg酶每分钟释放1.0 μM产物。蛋白浓度采用蛋白含量检测试剂盒（货号：AKPR015，Boxbio）中的Bradford法测定。
己糖激酶（HK）、丙酮酸激酶（Pyk）、丙酮酸脱氢酶（Pdh）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）、磷酸葡糖酸脱氢酶（GND1）和琥珀酸脱氢酶（Sdh）活性分别使用HK活性检测试剂盒（货号：AKSU061U）、Pyk活性检测试剂盒（货号：AKSU066U）、Pdh活性检测试剂盒（货号：AKAC005C）、G6PDH活性检测试剂盒（货号：AKCO013U）、6PGDH活性检测试剂盒（货号：AKCO012U）和Sdh活性检测试剂盒（货号：AKAC011C）测定，试剂盒均购自北京盒子生工科技有限公司，操作按说明书进行。每个试剂盒中一个酶活单位（U）的定义见各自说明书。
NADPH、NADP⁺、NADH和NAD⁺含量分别使用辅酶II NADP(H)含量检测试剂盒（货号：AKCO018C）和辅酶I NAD(H)含量检测试剂盒（货号：AKCO001C）测定。
【数据】离心条件：8000 r/min、5 min（室温）/10000 r/min、5 min（4°C）；PBS浓度：0.2 M、pH 6.5；破碎温度：4°C；葡萄糖浓度：250 g/L；培养时间：48 h + 60 h；温度：30°C（YPD）/28°C（M4）
2.4 细胞生长测定
生长曲线通过酶标仪（SpectraMax iD3，Molecular Devices，美国加州）监测OD600获得。简要流程：将-80°C保存的菌株用30 mL YPD培养基在30°C活化48小时。随后将培养物分别用40 mL新鲜YPD、MD、ME、MF和MG培养基稀释，初始OD600 = 0.1 ± 0.02。培养72小时，每12小时检测一次OD600。测定细胞干重（DCW）时，收集5 mL细胞培养液，离心获得细胞沉淀，用ddH₂O洗涤两次，105°C干燥至恒重。OD600为1的1 mL细胞约相当于0.27 mg DCW。
【数据】初始OD600：0.1 ± 0.02；检测间隔：12 h；总培养时间：72 h；干燥温度：105°C；换算系数：OD600=1 ≈ 0.27 mg DCW/mL
2.5 赤藓糖醇发酵与检测
赤藓糖醇发酵在1-L锥形瓶和3.7-L生物反应器（Bioengineering AG，Wald，瑞士）中进行，操作参照Liu等（2024）的先前研究。锥形瓶发酵：将培养48小时的菌株培养物按1:10比例稀释至80 mL YPD或含PM培养基中（1-L锥形瓶），200 r/min摇床培养120小时。生物反应器发酵：将48小时培养物按1:20稀释至50 mL新鲜培养基，培养48小时；随后将培养物按1:20稀释至80 mL新鲜培养基制备种子培养液；再将种子培养液按6:100稀释至2 L新鲜培养基中，搅拌速度500 r/min，空气流量0.8 vvm。
考察酵母提取物对CA20赤藓糖醇生产的影响时，将48小时培养物按1:10稀释至80 mL M2培养基中（分别含0、2、5、10 g/L酵母提取物），30°C、200 r/min培养120小时。考察PM影响时，将48小时培养物按1:10稀释至80 mL含300 g/L葡萄糖、2 g/L酵母提取物及0、5、10或20 g/L PM的新鲜培养基中，发酵120小时。考察葡萄糖浓度影响时，将48小时培养物按1:10稀释至80 mL含2 g/L酵母提取物、10 g/L PM及200、250、300或350 g/L葡萄糖的新鲜培养基中。由此确定最佳培养基组成。
测定温度影响时，将48小时培养物按1:10稀释至80 mL新鲜M4培养基，分别在24、28、30和32°C培养120小时。测定种子液量和初始pH影响时，种子液量分别设为2%、4%、6%和10%（v/v），初始pH分别设为3.0、4.0、5.0、6.0和7.0。
葡萄糖和赤藓糖醇浓度用高效液相色谱（HPLC）（e2695，Waters，美国马萨诸塞州米尔福德）检测，配离子排阻柱Aminex HPX-87H（Bio-Rad，美国加州）和示差折光检测器（2414，Waters），流动相为0.5 mM H₂SO₄。流速0.6 mL/min，柱温35°C，每次进样10 μL。赤藓糖醇产率（Y_ERY，g/g）按公式Y_ERY = P/S计算，其中P为发酵结束时培养液中赤藓糖醇总量（g），S为消耗的葡萄糖总量（g）。赤藓糖醇生产速率（Q_ERY，g/L/h）按公式Q_ERY = P/V/t计算，其中V为培养液初始体积（L），t为培养时间（h）（Cheng等，2018）。
【数据】锥形瓶发酵接种比：1:10；发酵时间：120 h；生物反应器接种比：1:20→6:100；搅拌速度：500 r/min；通气量：0.8 vvm；酵母提取物浓度梯度：0/2/5/10 g/L；PM浓度梯度：0/5/10/20 g/L；葡萄糖浓度梯度：200/250/300/350 g/L；温度梯度：24/28/30/32°C；种子液量梯度：2/4/6/10%；初始pH梯度：3.0-7.0；HPLC流动相：0.5 mM H₂SO₄；流速：0.6 mL/min；柱温：35°C；进样量：10 μL
2.6 菌落与细胞形态观察
观察菌落形态时，将解脂耶氏酵母CA20及突变菌株用YPD培养基在28°C活化。培养36小时后，将培养物按6:100稀释至80 mL新鲜M4培养基（初始pH 3.0），28°C、200 r/min摇床培养。培养48小时和96小时后，将培养液梯度稀释并涂布于含300 g/L葡萄糖的固体M4培养基上，28°C培养。
【数据】活化温度：28°C；活化时间：36 h；稀释比：6:100；初始pH：3.0；固体培养基葡萄糖浓度：300 g/L
研究结果
3.1 花生粕与葡萄糖组合培养基可支持CA20生长与赤藓糖醇合成
首先测定了花生粕中溶解蛋白（DP）和游离脂肪酸（FFA）含量。结果显示，PM中DP含量为0.08 ± 0.005 g/g，FFA含量为49.80 ± 3.0 μM/g（补充表S4）。随后分析了CA20在含/不含PM培养基中的生长情况。将YPD培养基中的酵母提取物和蛋白胨替换为PM，得到MD、ME、MF和MG培养基（图1A和表1）。有趣的是，CA20在YPD、MD和ME中的生长相似——各时间点生长曲线无显著差异。同时，CA20在MF中的生长优于YPD和ME。对于仅含葡萄糖和PM的MG培养基，CA20的生长明显优于YPD中的生长，表明PM可有效替代培养基中的酵母提取物、蛋白胨及其他成分支持细胞生长。
随后评估了CA20在含PM培养基中的赤藓糖醇产量。值得注意的是，与YPD相比，添加PM显著提高了CA20的赤藓糖醇滴度（图1B）。此外，CA20在仅含葡萄糖和PM的M2培养基中产生的赤藓糖醇滴度显著高于YPD培养基，表明PM有利于赤藓糖醇合成。
接着对培养基组分浓度（酵母提取物、PM和葡萄糖）进行优化以确定最佳组合。结果表明，酵母提取物最佳浓度为2 g/L——高于2 g/L的酵母提取物添加反而降低CA20的赤藓糖醇产量（图1C）。类似地，PM和葡萄糖的最佳浓度分别为10 g/L和250 g/L（图1D和E）。由此获得最佳培养基（命名为M3），含250 g/L葡萄糖、10 g/L PM和2 g/L酵母提取物。CA20在M3培养基中的赤藓糖醇滴度为93.67 ± 2.1 g/L，显著高于YPD培养基（61.50 ± 3.30 g/L），提高了52.30%（图1F）。
进一步考察了CA20在不含酵母提取物的培养基（命名为M4）中的赤藓糖醇产量。值得注意的是，获得了83.83 ± 2.67 g/L的赤藓糖醇滴度，显著高于YPD培养基，但略低于M3培养基。这些结果表明，除葡萄糖外，PM可作为唯一培养基组分支持液态发酵中细胞生长和赤藓糖醇合成。因此，后续研究使用M4培养基。
培养基组成对解脂耶氏酵母的细胞生长和赤藓糖醇合成至关重要。已有研究表明，过量碳源或氮限制条件（高初始碳氮比C/N）可触发赤藓糖醇合成，其中氮限制是赤藓糖醇合成的前提（Liu等，2020；Rywínska等，2015）。与这些研究一致，本研究发现酵母提取物添加量高于2 g/L或PM添加量高于10 g/L均会降低CA20的赤藓糖醇滴度（图1C和D），这可能源于培养基中初始C/N比降低。培养基组成优化已被广泛用于提升解脂耶氏酵母赤藓糖醇合成性能，涉及碳源（如葡萄糖、甘油和废弃资源）、氮源（如酵母提取物、蛋白胨和硫酸铵）、金属离子（如Mn²⁺、Cu²⁺和Zn²⁺）、表面活性剂（如Tween 20、Tween 80和Span 20）及其他成分（如NaCl和KH₂PO₄）等（Yang等，2014；Daza-Serna等，2021；Liu等，2023；Yang等，2024a；Hijosa-Valsero等，2021）。然而不论底物如何，向培养基中添加其他组分都不可避免地增加赤藓糖醇生产成本。已有研究报道以粗甘油和废弃食用油为碳源可降低赤藓糖醇生产的经济成本（Liu等，2017b；Jagtap等，2021），但这些研究的发酵培养基相对复杂，包含碳源、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄、KH₂PO₄、NaCl、酵母提取物、CaCO₃等。利用农业废弃物（如酒糟和麦麸）通过固态发酵生产赤藓糖醇是另一种高效经济化的潜在策略（Liu等，2019a；Liu等，2022a），但目前液态深层发酵仍是赤藓糖醇生产的主导方式。花生粕富含蛋白质、脂肪酸和多糖，已被证明可支持铜绿假单胞菌和酿酒酵母的固态发酵生长（Zhang等，2021；Zhao等，2023）。在本研究之前，PM能否在液态深层发酵中支持解脂耶氏酵母生长和赤藓糖醇合成尚未被探索。本研究结果表明，PM是葡萄糖之外培养基组分的优良替代物。PM的利用将大大简化培养基组成，有助于赤藓糖醇的经济化生产。
【数据】DP含量：0.08 ± 0.005 g/g；FFA含量：49.80 ± 3.0 μM/g；M3培养基赤藓糖醇滴度：93.67 ± 2.1 g/L；YPD培养基滴度：61.50 ± 3.30 g/L；增幅：52.30%；M4培养基滴度：83.83 ± 2.67 g/L；最佳酵母提取物浓度：2 g/L；最佳PM浓度：10 g/L；最佳葡萄糖浓度：250 g/L
3.2 培养条件优化可进一步提高CA20赤藓糖醇产量
随后对发酵条件（温度、初始pH和种子液量）进行优化以确定最佳组合。温度方面，28°C下CA20产生的赤藓糖醇较24°C和30°C显著增加（图2A）。此外，32°C下的赤藓糖醇滴度较30°C略有增加，但仍低于28°C。因此，28°C是CA20在M4培养基中生产赤藓糖醇的最适温度。pH方面，低初始pH（3.0）显著促进赤藓糖醇滴度（图2B），而初始pH升高则降低CA20的赤藓糖醇产量。因此，最适初始pH为3.0。随后优化种子液量。结果表明，6%（v/v）种子液量产生最大赤藓糖醇滴度93.67 ± 1.97 g/L，显著高于2%种子液量（87.83 ± 2.11 g/L）（图2C）。
综合确定最佳发酵条件：温度28°C、初始pH 3.0、种子液量6%。随后在最佳条件下于1-L锥形瓶和3.7-L生物反应器中进行CA20的赤藓糖醇发酵。值得注意的是，优化后锥形瓶发酵中赤藓糖醇滴度显著提升，达到113.17 ± 3.48 g/L，显著高于优化前M4培养基（91.05 ± 3.42 g/L）和YPD培养基（62.50 ± 2.81 g/L）（图2D）。在3.7-L生物反应器中，发酵144小时后产生赤藓糖醇125.25 ± 4.8 g/L（图2E），显著高于优化前M4培养基（100.25 ± 5.10 g/L）和YPD培养基（88.60 ± 6.20 g/L，补充图S4）。赤藓糖醇产率和生产速率分别为0.69 ± 0.03 g/g和0.87 ± 0.03 g/L/h。值得注意的是，葡萄糖未被完全消耗，剩余葡萄糖70 ± 12 g/L。此外，120小时后葡萄糖消耗速率和赤藓糖醇积累速率均下降。这提示若葡萄糖被完全耗尽，赤藓糖醇滴度可能进一步提高。
温度、初始pH和种子液量是影响细胞生长和赤藓糖醇合成的重要因素。已有报道表明，解脂耶氏酵…
【数据】最适温度：28°C；最适初始pH：3.0；最适种子液量：6%；优化后锥形瓶滴度：113.17 ± 3.48 g/L；优化前M4滴度：91.05 ± 3.42 g/L；YPD滴度：62.50 ± 2.81 g/L；生物反应器滴度：125.25 ± 4.8 g/L；优化前M4（反应器）：100.25 ± 5.10 g/L；YPD（反应器）：88.60 ± 6.20 g/L；产率：0.69 ± 0.03 g/g；生产速率：0.87 ± 0.03 g/L/h；残余葡萄糖：70 ± 12 g/L
3.3 转录组分析揭示赤藓糖醇合成增强的分子机制
对CS（对照条件）与OS（优化条件）之间的差异表达基因（DEGs）进行功能富集分析。图3A显示了OS相对于CS的上调和下调基因。GO富集分析（图3B）和KEGG富集分析（图3C）揭示了DEGs涉及的生物学通路。图3D概述了与赤藓糖醇合成相关的DEGs。
与赤藓糖醇合成相关酶的活性变化如图4所示。实验至少设置三次生物学重复，误差线代表标准差。“”表示两组间存在显著差异（p < 0.05；p < 0.01；*p < 0.001）。
【数据】显著性阈值：p < 0.05；p < 0.01；p < 0.001；生物学重复数：≥3
3.4 基因过表达与敲除验证关键基因功能
图5展示了CA20单独过表达或敲除目标基因后的赤藓糖醇产量。图5A和5B分别为CA20单独过表达赤藓糖醇代谢相关基因后的赤藓糖醇滴度和产率。图5C和5D为用于功能验证的DEGs的倍数变化（FC）。
图6展示了CA20及突变菌株的赤藓糖醇产量和细胞形态。图6A和6B为CA20ΔA002891（即CE0）单独过表达A000466、yht1、A001489、HK、yht5、ER25、EYI2和GK后的赤藓糖醇滴度和产率。赤藓糖醇发酵…（原文未完整呈现）
【数据】赤藓糖醇滴度与产率数值详见原文图6；菌株：CA20ΔA002891（CE0）
3.5 工程菌株CE1的构建与发酵验证
（原文结果部分未完整提供，以下内容依据摘要与结论）
通过敲除A002891并在CA20中过表达A001489，构建了工程菌株Yarrowia lipolytica CE1。该菌株以花生粕和葡萄糖为底物，在108小时内产生赤藓糖醇168.78 ± 10 g/L，产率0.73 ± 0.05 g/g。
【数据】赤藓糖醇滴度：168.78 ± 10 g/L；发酵时间：108 h；产率：0.73 ± 0.05 g/g
讨论与解读
本研究证实花生粕可作为葡萄糖之外唯一培养基组分，在液态深层发酵中支持解脂耶氏酵母的生长和赤藓糖醇合成。培养基组成与发酵条件优化有效提升了赤藓糖醇产量，这可能与碳水化合物、氨基酸和脂质代谢活性增强以及直接参与赤藓糖醇合成的ZWF1和GND1活性提高有关。转录组分析鉴定出A002891和A001489为影响CA20赤藓糖醇合成的关键基因。通过敲除A002891并过表达A001489构建的工程菌株CE1，在108小时内从花生粕和葡萄糖中产出168.78 g/L赤藓糖醇。整体而言，本研究为经济化赤藓糖醇液态发酵生产和花生粕高值化转化提供了有效途径。
编译者解读
该研究的核心价值在于将"废弃物基质开发"与"代谢工程改造"有机结合——花生粕同时充当氮源与生长因子来源，使培养基组分从复杂的多成分体系简化为"葡萄糖+花生粕"二元体系，直接降低了原料与配制成本。尤其值得关注的是，作者发现花生粕可完全抑制解脂耶氏酵母的菌丝形成，这一形态学效应与产量提升之间的关联颇具合成生物学挖掘潜力。从应用角度看，CE1菌株168.78 g/L的滴度在同类研究中处于较高水平，且发酵周期缩短至108小时，具备工业放大前景。然而，花生粕作为天然农副产品，其批次间成分波动可能影响发酵稳定性，原文未详述该问题的应对策略，后续研究值得关注。
参考来源
Chen Y. Metabolic engineering combined with fermentation optimization enables sustainable production of erythritol by Yarrowia lipolytica from peanut meal and glucose. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132679
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132679