ProteinMPNN引导改造热稳定D-氨基酸氧化酶合成L-草铵膦

来源：Development of a highly functional thermostable D-amino acid oxidase for efficient L-phosphinothricin biosynthesis using ProteinMPNN-guided engineering（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：质粒载体构建校验

导读

D-氨基酸氧化酶（DAAO）在手性氨基酸生物合成中具有重要应用前景，但其热稳定性差限制了工业化应用。本研究采用ProteinMPNN引导的多密码子饱和突变策略，从RgDAAO-Mu0出发，仅筛选1215个转化子即获得最优变体M5（S42D/T84D/H138N/A193R/E195Y/C234L）。该变体对非天然底物D-草铵膦（D-PPT）的催化效率达27.3 mM⁻¹s⁻¹（较起始酶提高29倍），50°C下半衰期519分钟（提高208倍），并在100 mL体系中7小时内完全转化500 mM D-PPT。分子动力学模拟揭示了表面电荷改变和分子内/分子间网络重构是性能提升的结构基础。

研究背景

酶作为生物催化剂，正在成为合成医药和农用化学品中间体及精细化学品的多功能替代工具。L-草铵膦（L-PPT）是全球广泛使用的广谱除草剂，传统上通过化学方法获得。利用生物催化剂可将市售PPT中的非活性成分D-PPT转化为活性成分L-PPT，其中DAAO提供了极为简洁的动力学拆分D,L-PPT路线。然而，DAAO对非天然底物D-PPT的催化活性不理想，成为其工业化的主要障碍。

过去三年中，通过蛋白质工程策略改善DAAO对D-PPT的比活性已取得显著进展。例如，作者前期利用亲水性引导突变开发了一种比活性较野生型提高2000倍以上的DAAO变体。然而，酶的热稳定性不足仍然限制其工业应用，并给蛋白质工程改造带来挑战。本研究旨在利用ProteinMPNN深度学习工具指导热点识别，通过构建"小而精"的突变文库，同步提升DAAO的催化效率和热稳定性。

研究方法

2.1 实验材料

除非另有说明，所有化学品、试剂和限制性内切酶均购自商业渠道（Aladdin、Yuanye、Tsingke、Sinopharm、Thermo Fisher、Beyotime和Vazyme），不经进一步纯化直接使用。感受态细胞（Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)）及寡核苷酸购自Tsingke公司。编码D-氨基酸氧化酶（DAAO）变体的pET-30a质粒保存于本实验室。质粒提取和PCR产物纯化分别使用购自Omega公司的Plasmid mini kit I和gel extraction kit。

【数据】试剂来源：Aladdin、Yuanye、Tsingke、Sinopharm、Thermo Fisher、Beyotime、Vazyme；感受态细胞：E. coli DH5α和BL21(DE3)；质粒载体：pET-30a；试剂盒来源：Omega

2.2 ProteinMPNN设计DAAO

DAAO的保守位点通过EFI Web的Enzyme Similarity Tool计算获得。来自Rhodotorula gracilis的DAAO-N54T/F58Q/M213S（RgDAAO-Mu0）序列作为输入序列，使用UniPort数据库进行BLAST搜索，E值为5。序列相似性网络（SSN）构建和聚类分析使用比对分数50。聚类分析得到的保守位点结果用作ProteinMPNN中的固定位置。氨基酸位点预测在ProteinMPNN服务器上进行。输入结构RgDAAO-Mu0通过Alphafold3获得。

固定位置如下：'A'：[G11, G13, G16, S48, P49, A51, G52, A53, T54, W55, T56, P57, Q58, R95, W107, Y108, Y142, N177, D191, P196, G199, Q200, T201, V202, L203, V204, P207, S213, P221, Y223, I225, P226, R227, G235, G236, T237, Y238, P264, R285, P286, R288, R293, H329, Y331, G332, S335, A336, G337, Q339, S341, G343]。排除半胱氨酸以确保催化功能不受影响，选择vanilla-v_48_020作为模型，因其性能稳定且适用范围广。骨架噪声设为零。设置不同温度（0.1、0.15、0.2、0.25和0.3），共生成90条序列。使用MAFFT进行比对，结果用TEXshade软件可视化。鉴定出若干保守区域，选择13个关键残基进行突变。

【数据】BLAST E值：5；SSN比对分数：50；ProteinMPNN生成序列数：90；温度设置：0.1-0.3；固定位置数：51个氨基酸残基；关键残基数：13个

2.3 基于PCR的文库构建与筛选

使用Phanta UniFi Master Mix通过全质粒PCR、重叠PCR和巨引物法构建文库。以插入目标DAAO基因的pET-30a质粒为模板，用简并密码子替换目标位点的密码子。短片段PCR条件为：98°C预变性30秒，（98°C变性10秒、60°C退火10秒、72°C延伸15秒）×35个循环，72°C最终延伸5分钟。重叠PCR和巨引物PCR条件同上，但延伸时间不同（重叠PCR为72°C 20秒，巨引物PCR为72°C 210秒）。PCR产物经电泳检查，用Omega Gel extraction kit纯化。向产物中加入DpnI内切酶，37°C消化模板2小时，然后将产物转化至E. coli BL21(DE3)化学感受态细胞中，在含50 μg/mL卡那霉素的Luria–Bertani（LB）琼脂平板上37°C过夜培养。引物列表见表S1。

使用含320 μL LB培养基的96深孔板进行菌落培养，加入50 μg/mL卡那霉素。37°C、800 rpm培养8小时后，取50 μL转移至96浅孔板，4°C保存作为种子。随后向板中加入30 μL 10%（v/v）乳糖，25°C振荡过夜进行蛋白表达。之后，取100 μL培养液转移至ELISA板中，加入等体积裂解液（6 U DNase I、0.4% TritonX-100、2 mg/mL溶菌酶和4 mM EDTA溶于Tris-HCl缓冲液（pH 8.0，50 mM））。30°C振荡裂解细胞1小时后，裂解液在4°C、4000 rpm离心10分钟。收集上清，取100 μL转移至新的ELISA板中进行辣根过氧化物酶（HRP，EC 1.11.1.7）显色测试。筛选体系为含25 mM D,L-PPT、1.6 U/mL HRP、1 mM 4-氨基安替比林（4-AAP）和2.5 mM 2,4,6-三溴-3-羟基苯甲酸（TBHBA）的Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.0）。30°C孵育25分钟后，通过检测500 nm处吸光度鉴定优良变体。挑选高值变体进行测序。

【数据】PCR预变性：98°C 30s；变性：98°C 10s；退火：60°C 10s；延伸：72°C 15s（短片段）/20s（重叠PCR）/210s（巨引物PCR）；循环数：35；DpnI消化：37°C 2h；卡那霉素浓度：50 μg/mL；LB培养基体积：320 μL；培养条件：37°C、800rpm、8h；乳糖浓度：10%（v/v）30μL；表达条件：25°C过夜；裂解液成分：6U DNase I、0.4% TritonX-100、2mg/mL溶菌酶、4mM EDTA；裂解条件：30°C 1h；离心：4000rpm、4°C、10min；筛选体系：25mM D,L-PPT、1.6U/mL HRP、1mM 4-AAP、2.5mM TBHBA；检测波长：500nm；孵育：30°C 25min

2.4 细胞培养、蛋白表达与纯化

插入Rhodosporidium toruloides来源的DAAO（RgDAAO）基因及其变体的pET-30a质粒在E. coli BL21(DE3)中异源表达。使用含20 mL LB培养基和50 μg/mL硫酸卡那霉素的150 mL摇瓶进行预培养。37°C、200 rpm培养16小时后，取200 μL培养物转移至20 mL Terrific Broth（TB）培养基中，37°C、200 rpm旋转振荡培养。培养8小时后加入乳糖（1% w/v）进行诱导。培养物在25°C、220 rpm下振荡过夜。细胞在13000 g离心5分钟收集，重悬于Tris-HCl缓冲液（50 mM，pH 8.0）中。使用球磨机破碎细胞，13000 g离心5分钟后获得粗酶。蛋白纯化使用购自Sangon的Ni-NTA（His-Tag）预装重力柱试剂盒。裂解液上样至预平衡的Ni-NTA柱上，以1 mL/min流速用Binding/Wash缓冲液（含10 mM咪唑）和Elution缓冲液（含250 mM咪唑）洗涤洗脱。纯化蛋白用考马斯亮蓝染色的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）分析。纯化蛋白浓度通过BCA法测定。

【数据】预培养：20mL LB、50μg/mL卡那霉素、37°C、200rpm、16h；转接量：200μL→20mL TB；诱导剂：1% w/v乳糖（8h后）；诱导培养：25°C、220rpm过夜；离心：13000g、5min；缓冲液：Tris-HCl 50mM pH 8.0；Ni-NTA流速：1mL/min；咪唑浓度：10mM（洗杂）/250mM（洗脱）

2.5 酶活性、动力学参数和稳定性测定

DAAO及其变体的活性测定采用作者前期研究中的相同方法。反应溶液与筛选程序相同，在30°C水浴中维持。向溶液中加入100 μL DAAO酶启动反应，通过测量60秒内500 nm处吸光度增加值计算DAAO活性。一个酶活单位（U）定义为在测定条件下每分钟产生1 μmol醌亚胺所需的酶量。为测定纯化DAAO变体的动力学参数，将D-PPT浓度从0.125 mM验证至25 mM，用Michaelis–Menten方程拟合。

为评估DAAO变体的热稳定性，将纯化酶（1 mg/mL）在不同温度（40°C至70°C）下孵育15分钟。冰上冷却后测定酶的残余活性，计算T50¹⁵值（保留50%活性时的温度）。测定DAAO变体的半衰期（t1/2）。将纯化酶（1 mg/mL）在50°C孵育，冰上冷却后测定残余活性。未经孵育的活性视为100%，通过孵育时间对残余活性的半对数图斜率计算热失活一级速率常数（kD），公式如下：

(2) ln(At/A0) = −kd·t

(3) t1/2 = ln2/kd

其中At/A0为t时刻的残余活性，kd为失活速率常数。DAAO变体对甲酸铵（NH₄HCO₂）、二甲基亚砜（DMSO）和甲醇的稳定性也通过向反应体系中添加0.1至0.5 mol/L NH₄HCO₂、1%至5% DMSO和1%至10%甲醇进行测定。

【数据】酶活测定：30°C、500nm、60s；D-PPT浓度范围：0.125-25mM；热稳定性孵育：1mg/mL、40-70°C、15min；半衰期测定：1mg/mL、50°C；NH₄HCO₂：0.1-0.5mol/L；DMSO：1%-5%；甲醇：1%-10%

研究结果

3.1 利用ProteinMPNN进行DAAO定向进化热点识别

深度学习工具ProteinMPNN为发现具有更高稳定性的新蛋白提供了有用工具，也可用于定向进化以调整现有酶的稳定性。祖先序列重建（ASR）被用于基于祖先序列选择突变位点，称为祖先组合文库定向进化（CLADE）。与CLADE类似，本研究尝试使用ProteinMPNN生成的序列来选择突变热点，该方法能提供完整序列，不像ASR那样总是缺乏C端和N端序列信息。

选择作者前期研究突变文库中的DAAO变体N54T/F58Q/M213S（Mu0）作为提高热稳定性的模板。为保持催化功能，固定活性位点周围的残基，定义为距配体D-PPT 6 Å以内的残基（图1A）。同时，使用EFI-Enzyme Similarity Tool以UniProt为数据库鉴定并固定最保守残基（图S1）。ProteinMPNN从输入结构生成若干可能具有更高稳定性或活性的序列。因此，作者假设生成的序列包含可提高DAAO活性和稳定性的关键位点。

经多序列比对（MSA）后，选择若干不确定性最高的位置进行突变。这些位点在生成的序列中保守，但与原序列不同（图S2）。为缩小筛选范围，聚焦活性位点的中层和外层（距D-PPT 6 Å至16 Å范围内，图1B）。随后从MSA中识别出15个位于6–16 Å区域的候选残基。将其分为三个随机化组，用各位点最可能（或第二可能）的氨基酸替换。

在ISM过程中，ProteinMPNN预测的氨基酸用作简并密码子（图1C、D）。对每个文库，使用简并密码子在候选位点进行"双密码子"或"三密码子"饱和突变。例如，在文库A中，V41和E195分别用V/T和E/Y简并密码子替换，而S42、Q192和A193分别用S/D/K、Q/E/K和A/S/R替换。在文库B中，C234替换为C/L，H138、R279、H280和N281分别替换为H/D/N、R/E/K、H/Y/R和N/L/R（表S1）。为满足95%文库覆盖率，文库A和C分别生成324个转化子，文库B生成486个转化子。第一轮突变共筛选1134个转化子，与使用NNK简并密码子构建的文库相比规模相对较小。筛选程序因此大大简化，以相对较少的努力即可识别潜在有益的突变体。

在文库A和B中迅速观察到多个活性提高的变体，但文库C中未出现（图S3）。对这些变体进行测序，并通过50°C孵育0分钟和15分钟后500 nm处吸光度变化进一步评估其活性和热稳定性。结果显示，S42、A193、E195、H138和C234位点的六个单变体表现出较Mu0提高的活性，分别命名为M1–1（S42D）、M1–2（A193R）、M1–3（A193S）、M1–4（E195Y）、M2–1（H138N）和M2–2（C234L）（图2A）。其中，M1–2（A193R）和M2–1（H138N）的活性分别比Mu0高1.8倍和2.4倍，表明这两个位点在酶催化中发挥重要作用。Liu-Yu Wang等人也发现了E195Y和C234L变体可增强酶活性和热稳定性。该结果证明本方法在改善酶性能方面行之有效。

组合变体也被鉴定并分别命名为M1–5（A193R/E195Y）、M1–6（A193S/E195Y）、M1–7（S42D/E195Y）、M1–8（S42D/A193R/E195Y）和M2–3（H138N/C234L）（图2A）。其中，三突变变体M1–8（S42D/A193R/E195Y）在文库A和B中活性最高，为Mu0活性的三倍，表明这些突变之间存在协同性非加性效应。本研究中的多密码子饱和突变（MCSM）能够在文库中快速识别具有协同效应的最佳变体。

M1–8的性能通过与文库B中的突变组合进一步改善，产生了四突变变体M3–1（S42D/A193R/E195Y/C234L）和M3–2（S42D/A193R/E195Y/H138N），以及五突变变体M4（S42D/A193R/E195Y/H138N/C234L），其活性分别比M1–8提高1.2倍、1.5倍和1.6倍，比Mu0提高3.5倍、4.5倍和5.0倍。鉴于Mu0的活性比RgDAAO-WT高1152倍，本研究中M4的活性比野生型酶高5760倍。

酶的热稳定性在定向进化过程中也得到提升（图2B）。50°C孵育15分钟后，原始酶Mu0几乎丧失全部活性，表明其热稳定性极差。令人欣慰的是，M4在孵育后保留超过95%的活性，这可归因于S42D和E195Y突变（孵育后分别保留86%和78%活性）。H138N和A193R变体对热稳定性的贡献较低至中等（孵育后分别保留3%和35%活性），但对催化活性贡献显著（活性分别提高2.4倍和1.8倍）。C234L变体在活性和热稳定性方面均表现出中等改善（活性提高1.5倍，孵育后残余活性35%）。值得注意的是，本研究仅筛选了1137个转化子，证明了基于ProteinMPNN和CAST/MCSM的组合策略的高效性。

为进一步评估各单突变对酶性能的贡献，纯化了各变体并测试其特性（图S4，表1）。与Mu0相比，M4的催化效率（kcat/Km）显著提高，较亲本增加20倍以上（M4为19.2 mM⁻¹s⁻¹，Mu0为0.94 mM⁻¹s⁻¹）。这可归因于其较低的Km值（M4的Km为1.9 mM，Mu0为9.0 mM）以及增强的转换数（M4的转换数为36.4 s⁻¹，Mu0为8.4 s⁻¹）。对其他进化中间变体的评估显示，S42D、A193R和H138N的引入同时增强了转换数和亲和力，催化效率分别提高2.4倍、2.9倍和3.9倍。另一方面，E195Y和C234L突变适度改变酶的催化效率（分别为Mu0的1.4倍和1.6倍），其中E195Y的Km降低而C234L的kcat增加。

此外，可以观察到这些突变之间存在协同相互作用。E195Y与A193R或S42D的组合使催化效率提高3.7倍，在变体M1–8（S42D/A193R/E195Y）中进一步增强至M0的9.3倍。变体S42D/E195Y主要降低其Km，而A193R主要贡献于转换数。在文库B中，变体M2–3（H138N/C234L）的催化效率增加有限（为Mu0的4.3倍），表明C234L在酶催化中作用有限。这五个位点的同时引入极大地改变了酶的催化能力，为协同进化提供了证据。

【数据】筛选转化子总数：1134（第一轮）；文库A和C：各324个；文库B：486个；M1-2活性：Mu0的1.8倍；M2-1活性：Mu0的2.4倍；M1-8活性：Mu0的3倍；M3-1活性：M1-8的1.2倍/Mu0的3.5倍；M3-2活性：M1-8的1.5倍/Mu0的4.5倍；M4活性：M1-8的1.6倍/Mu0的5.0倍；M4活性：野生型的5760倍；Mu0活性：野生型的1152倍；50°C孵育15min后：Mu0几乎失活、M4保留>95%、S42D保留86%、E195Y保留78%、H138N保留3%、A193R保留35%、C234L保留35%；M4 kcat/Km：19.2 mM⁻¹s⁻¹；Mu0 kcat/Km：0.94 mM⁻¹s⁻¹；M4 Km：1.9mM；Mu0 Km：9.0mM；M4 kcat：36.4s⁻¹；Mu0 kcat：8.4s⁻¹；S42D/A193R/H138N催化效率：Mu0的2.4/2.9/3.9倍；E195Y/C234L催化效率：Mu0的1.4/1.6倍；E195Y+A193R或S42D：3.7倍；M1-8：M0的9.3倍；M2-3：Mu0的4.3倍

讨论与解读

讨论要点

DAAO有限的催化效率和热稳定性是其在手性氨基酸合成中工业应用的主要障碍。本研究利用基于ProteinMPNN的多密码子饱和突变策略，获得了用于D,L-PPT动力学拆分的进化DAAO变体。通过ProteinMPNN生成的序列快速识别突变热点，利用CAST策略结合简并密码子构建了"小而精"的文库。最优变体M5仅通过筛选1215个转化子即获得。M5的催化活性较其模板Mu0显著提升，相当于较野生型酶提高6105倍。此外，Mu0热稳定性差的缺陷被彻底改变——M5在50°C下实现了卓越的热稳定性。酶的底物谱也得到拓宽，尤其是对具有亲水性侧链和苯环的底物，使其成为有价值化合物生物合成的有前景催化剂。以M5为催化剂进行D,L-PPT动力学拆分验证了其实际应用性能——100 mL体系中500 mM D-PPT在7小时内完全转化。进一步的机制分析揭示了活性和稳定性增强的结构基础，源于表面电荷分布改变、分子内/分子间相互作用的引入等综合效应。

编译者解读

本研究的方法论亮点在于将ProteinMPNN深度学习工具引入DAAO定向进化流程，以计算预测替代传统大通量随机突变，仅用1215个转化子便完成了从Mu0到M5的多轮迭代进化，筛选成本较NNK全饱和突变降低数个量级。从合成生物学应用视角看，M5兼具超高催化效率（较野生型6105倍）和出色热稳定性（50°C半衰期519分钟），可直接服务于L-PPT的工业化酶法生产。值得注意的是，作者通过MD模拟和静电表面分析揭示了远端突变通过表面电荷重塑和内部网络优化影响催化功能的长程效应机制，为"非活性位点突变如何调控酶功能"提供了结构解释。局限在于底物谱扩展仍限于结构类似的D-氨基酸，对更广泛非天然底物的适应性有待验证。

【数据】M5催化活性：野生型的6105倍；M5半衰期：50°C下519min；底物：500mM D-PPT；反应体积：100mL；转化时间：7h

参考来源

期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2026

DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149737

DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149737