来源：Enhancing β-agarase Y3R1 via synergistic coupling evolutionary sites: An epistasis-guided rational design for improved thermostability and catalytic efficiency（Process Biochemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
琼胶酶在琼胶寡糖工业化生产中面临稳定性与活性难以兼得的经典瓶颈。本研究以来源于深海琼胶降解菌 Catenovulum agarivorans 的β-琼胶酶Y3R1为对象，将进化耦合分析与上位性模型突变预测服务器EVmutation整合，筛选协同进化残基对，构建组合突变体。研究获得I23L-S72N、S72N-K74N与V184D-S185A三个热稳定性与催化效率同步提升的突变体，65°C半衰期分别达50.1、60.8与71.5 min。分子对接与动力学模拟揭示了突变体通过优化互作网络与调控构象柔性实现功能增益的机制。
研究背景
琼胶寡糖与新琼胶寡糖具有抗氧化、保肝、免疫调节、降胆固醇及益生元等多种生物活性。然而琼胶结构稳定且凝胶化能力强，传统化学/物理降解法选择性差且污染严重。β-琼胶酶（EC 3.2.1.81）可特异性水解β-1,4糖苷键，是新琼胶寡糖绿色制备的关键工具酶。琼胶在90–95°C熔融为溶胶，冷却至30–40°C重新凝胶，反应体系粘度随温度下降急剧升高，严重制约酶解效率。提升琼胶酶在高温下的稳定性，使其在高于琼胶凝胶温度的条件下工作，是突破传质限制、提高反应效率的关键路径。然而，酶工程中长期存在的稳定性—活性权衡使这一目标颇具挑战。本研究尝试利用进化耦合信息与上位性效应，为β-琼胶酶Y3R1的理性改造提供新策略。
研究方法
2.1 材料
卡那霉素、三羟甲基氨基甲烷（Tris）及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。琼脂糖购自上海白吉生物科技有限公司。3,5-二硝基水杨酸（DNS）购自福州飞净生物科技有限公司。Ni Sepharose 6 Fast Flow 购自GE Healthcare Life Sciences（瑞典乌普萨拉）。BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce（美国伊利诺伊州罗克福德）。胰蛋白胨、琼脂粉和酵母粉购自广东环凯微生物科技有限公司。
2.2 β-琼胶酶Y3R1的进化耦合预测与突变位点选择
Y3R1是来源于 Catenovulum agarivorans YM01ᵀ 的β-琼胶酶YM01–3（GenBank登录号：KF413621）的截短变体，通过去除C端部分非催化结构域（第314–420位氨基酸）获得。截短酶Y3R1（第1–313位氨基酸）保留了完整的GH16家族β-琼胶酶催化结构域（第3–270位氨基酸）和部分非催化结构域（经NCBI检索，该区域命名为Ricinb lectin 2，包含第284–313位氨基酸）（图1A）。
利用在线服务器Evcouplings（https://evcouplings2.hms.harvard.edu/）对截短β-琼胶酶Y3R1的氨基酸序列进行多序列比对（MSA），Evcouplings服务器的MSA生成模块采用标准化自动流程。首先以目标蛋白序列为查询序列，使用Jackhmmer算法在uniref100非冗余蛋白序列数据库中进行迭代搜索（默认5轮Jackhammer迭代）。搜索获得原始同源序列后，按以下条件进行质控过滤：（1）剔除比对覆盖率低于50%的序列；（2）删除列中空位超过30%的比对位置；（3）对相似度超过90%的冗余序列通过聚类降低权重。经过上述过滤后，获得可用于后续共进化模型构建的高质量MSA。采用最大熵模型计算Y3R1的进化耦合（ECs），生成蛋白质接触图和ECs作用网络图。根据网站对ECs的限制，将预测概率大于0.97的耦合进化位点定义为高度耦合位点。0.97阈值是EVcouplings在线服务器的默认后验概率截断值，该保守截断确保预测ECs具有高置信度，与原始EVmutation研究中的混合模型策略及共进化指导蛋白质工程的标准实践一致。通过MSA和保守性分析，预测氨基酸替换对酶稳定性的影响，并考虑残基间的相互依赖性。EVmutation（https://marks.hms.harvard.edu/evmutation/）利用上位性模型阐明蛋白质中所有残基对之间的相互作用和依赖信息，同时能够量化突变效应。通过对β-琼胶酶Y3R1第22–271位氨基酸进行饱和突变，利用上位性模型计算每个突变的统计能量ΔE，并根据统计能量绘制Y3R1突变预测热图。具体而言，EVmutation模型将候选有益突变的预测直接聚焦于ΔE > 0的突变。该方法基于从同源序列多序列比对训练得到的Potts模型，通过最大熵原理为每条蛋白序列定义“统计能量”函数E(σ)，序列的统计能量与其在进化中出现的概率成反比。对于任何突变，ΔE定义为突变体与野生型之间的能量差：ΔE = E(突变体) − E(野生型)。由于野生型序列的ΔE定义为0，若突变体的统计能量更高（ΔE > 0），意味着其在进化中出现的概率更大，因此被预测为进化上的有益突变。突变体的选择依据以下标准：（1）上位性模型突变统计能量ΔE > 0，表明为预测的有益突变；（2）该突变体属于ECs；（3）与该突变体共进化的ECs的上位性模型突变统计能量ΔE也大于0。通过整合Y3R1中耦合进化残基信息与基于上位性模型的饱和突变预测，筛选出单突变位点。随后，按照图1B所示的共进化策略构建小型双突变体文库。通过后续酶学表征鉴定热稳定性增强的突变体。
2.3 Y3R1及其突变体的基因克隆
Y3R1（Met1–Trp313）的编码基因序列由厦门博瑞生物科技有限公司化学合成，随后克隆至pET-28a(+)表达载体（Novagen，美国）。以含有Y3R1（WT）基因的重组质粒为模板，使用Mut Express Ⅱ Fast Mutagenesis Kit V2定点突变试剂盒（Vazyme，南京）进行突变。确认Y3R1及其突变体的核苷酸序列准确性后，将重组质粒导入 Escherichia coli BL21 (DE3) 感受态细胞中进行酶表达。
2.4 β-琼胶酶的表达与纯化
将转化重组质粒的 E. coli BL21 (DE3) 用于β-琼胶酶的表达和纯化，方法参照课题组前期研究。携带酶基因的工程菌在含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中、37°C条件下培养。待OD600值达到0.7后，加入0.5 mM IPTG，于16°C诱导酶表达18 h。通过4500 × g离心10 min收集菌体沉淀。按照制造商说明，采用Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析纯化重组酶，方法同前期研究（结果见图S5和图S6）。使用BCA蛋白定量试剂盒以牛血清白蛋白为标准对纯化酶进行定量分析。采用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测纯化酶的分子量，并用考马斯亮蓝G250染色显色。
2.5 β-琼胶酶活性测定
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法检测β-琼胶酶活性。酶促反应体系为：497.5 μL 5.0 mg/mL琼脂糖底物溶液（以50 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液配制，pH 7.0）与2.5 μL酶液（含200 ng纯化β-琼胶酶）混合，于65°C孵育5 min，随后加入500 μL DNS试剂。沸水浴加热10 min后，将反应混合物冷却至室温。使用分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）在540 nm处测定吸光度。产生的还原糖含量以半乳糖标准曲线确定。在上述测定条件下，每分钟产生1 µmol还原糖所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。所有测定进行三次重复，结果以平均值±标准差表示。
2.6 温度和pH对酶活性的影响
（原文该部分内容未完整提供）
【数据】卡那霉素浓度：50 μg/mL；IPTG浓度：0.5 mM；诱导温度：16°C；诱导时间：18 h；离心：4500 × g，10 min；底物浓度：5.0 mg/mL琼脂糖；缓冲液：50 mM NaH₂PO₄-Na₂HPO₄，pH 7.0；反应温度：65°C；反应时间：5 min；DNS沸水浴：10 min；检测波长：540 nm；酶量：200 ng；SDS-PAGE浓度：12%
研究结果
3.1 β-琼胶酶Y3R1的进化耦合预测与突变位点选择
同源蛋白多序列比对中的氨基酸变化提供了残基对间耦合的信息。Evcouplings在线服务器利用最大熵模型计算ECs，并以MSA结果进行约束。本研究通过对β-琼胶酶Y3R1与数据库中14,934条相似序列进行比对来评估氨基酸序列保守性，并基于氨基酸在不同序列位置的出现频率进行替换预测（图S1A）。同时结合MSA结果与数据库中已知高分辨率蛋白晶体结构（包括3wz1、1o4y、1urx、1o4z、4atf和5t9x）生成蛋白质接触图，用于预测Y3R1空间接触距离在5 Å以内的氨基酸残基对（图S1B）。研究表明，耦合分数高的ECs在三维结构上彼此距离更近。基于上述结果，共计算获得23,220个ECs结果，其中以预测概率大于0.97为阈值筛选出217个强耦合进化位点（表S1），并生成共进化残基网络图（图S1C）。
利用EVmutation算法，对β-琼胶酶Y3R1第22–271位氨基酸残基进行上位性模型统计能量（ΔE）计算，共产生4104个突变预测。ΔE值范围为–14.028至3.645，其中90个突变被鉴定为有益突变（ΔE > 0）。基于这些上位性模型衍生的ΔE值构建突变热图（图2A）。按照图1B所示的筛选策略系统选择突变位点。经过严格筛选，共获得涵盖11个不同位点的17个突变体，并按统计能量ΔE降序排列（表1）。
3.2 热稳定性增强的单突变体的筛选与酶学表征
单突变体的活性分析（图2B）显示，R149Q、S185D、S72D、A76V、I228L、L232M和K74E的活性较野生型（WT）酶显著降低，其余突变体与WT相比无显著差异。基于这些结果，选择相互共进化关系中涉及的突变位点进行进一步热稳定性分析，包括S72（S72G、S72N）、I23（I23L）、V184（V184N、V184D）、S185（S185A、S185D）、K74（K74H、K74E、K74Q、K74N）和Q179（Q179G）。在不同温度下热处理1 h后，仅S72G和I23L表现出增强的热稳定性（图2C），而所有其他突变体均表现出不同程度的热去稳定化（图2D）。如图2C所示，S72G和I23L突变体相比WT表现出显著改善的热稳定性。在65°C下，S72G（48.4%）和I23L（62.9%）的残余活性分别比WT（36.4%）高12.0%和26.5%。这种热稳定性优势在75°C下更为明显，突变体保持30.2%（S72G）和53.6%（I23L）的残余活性，较WT的22.4%残余活性分别提高7.8%和31.2%。耐热性对于工业酶应用至关重要。因此，仅选择热稳定突变体S72G和I23L进行进一步的酶学表征。
通过随时间测定残余酶活性分析65°C下的热失活动力学。WT的半衰期（t₁/₂）计算为41.5 ± 0.8 min，而突变体S72G和I23L的半衰期显著延长，分别为49.5 ± 1.0 min和108.3 ± 2.2 min（表2）。上述结果表明两个单突变体S72G和I23L在高温条件下的热稳定性增强。S72G和I23L两个突变体均在65°C、pH 7.0条件下显示最佳活性（图S3A和B，表2），与WT一致，表明突变未改变其基本催化性质。通过Michaelis-Menten曲线拟合确定的动力学参数（图S3D，表2）显示WT与单突变体之间存在明显差异。WT的K_m为6.1 ± 0.2 mg/mL，V_max为2006.5 ± 30.1 U/mg，而S72G（K_m = 5.4 ± 0.1 mg/mL，V_max = 1635.5 ± 24.5 U/mg）和I23L（K_m = 5.5 ± 0.3 mg/mL，V_max = 1628.1 ± 24.4 U/mg）均表现出改善的底物亲和力但最大反应速率降低。进一步分析显示，WT的k_cat为(228.1 ± 3.0) × 10³ s⁻¹，k_cat/K_m为(37.4 ± 0.6) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，而S72G为(185.9 ± 2.4) × 10³ s⁻¹和(34.4 ± 0.5) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，I23L为(185.1 ± 2.6) × 10³ s⁻¹和(33.6 ± 0.5) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，表明两种突变均降低了琼脂糖水解的转换数和催化效率。
尽管S72G和I23L表现出增强的热稳定性，但两种突变体的催化效率均有降低。为评估其实际应用价值，在最佳条件下比较了它们的琼脂糖降解能力（图2E）。初始水解动力学显示，在前5 min内，两个单突变体产生的还原糖量均高于WT（37.55 μg/mL），S72G为41.63 μg/mL，I23L为51.54 μg/mL。然而，I23L在整个反应过程中保持优异性能，而S72G的生产力在5 min后下降，最终产物量低于WT。水解25 min后，最终还原糖浓度分别为110.53 μg/mL（WT）、110.32 μg/mL（S72G）和149.62 μg/mL（I23L）。这些结果表明，I23L在热稳定性和持续活性方面的综合提升带来了显著更优的表现，凸显了在酶工程改造中维持或增强催化活性对于实际应用的重要性。但在工业应用中，高底物负载、连续反应和极端条件等严格生产条件也应在未来加以考虑。
3.3 组合突变体的选择与酶学表征
组合突变中第二位点的选择由图1B所示的策略指导。在筛选的15个组合突变体中，有几个突变位点对具有潜在共进化耦合关系，包括I23/S27、S72/K74、S72/A76和V184/S185配对。这些特定组合可能为蛋白质结构内的上位性互作提供有价值的信息。此外，其他组合突变通过将单独表现出良好酶活性或热稳定性的突变位点配对设计，包括I23L-S72N和I23L-S72G变体。这一策略性选择旨在探索进化关联残基间的潜在协同效应以及高性能单突变体的加性效益。
组合突变体的酶活性测定（图3A）显示，大多数变体的相对活性与WT相当。然而，明显例外包括I23L-S27G突变体显示活性显著降低（相对活性61.7%），以及四个突变体（包括I23L-S72N、S72N-K74N、V184D-S185A和I23L-S27Q）显示活性增强，分别增加20.4%、57.9%、15.9%和20.3%。尽管仅有少数组合突变体表现出改善的活性，但大多数变体保持在接近WT的水平，表明双位点突变对酶功能的扰动极小。值得注意的是，与图2B中筛选的单突变体相比，组合突变体在保持催化活性方面未表现出显著的协同效应。在15个变体中，仅I23L-S72G显示活性显著下降，其余变体活性均接近或高于单突变体水平。
【数据】序列比对数量：14,934条；ECs结果总数：23,220；强耦合位点：217个（概率>0.97）；突变预测总数：4104；ΔE范围：–14.028至3.645；有益突变数：90个；筛选突变体：17个（11个位点）；65°C残余活性：WT 36.4%、S72G 48.4%、I23L 62.9%；75°C残余活性：WT 22.4%、S72G 30.2%、I23L 53.6%；半衰期（65°C）：WT 41.5 ± 0.8 min、S72G 49.5 ± 1.0 min、I23L 108.3 ± 2.2 min；K_m：WT 6.1 ± 0.2、S72G 5.4 ± 0.1、I23L 5.5 ± 0.3 mg/mL；V_max：WT 2006.5 ± 30.1、S72G 1635.5 ± 24.5、I23L 1628.1 ± 24.4 U/mg；k_cat：WT (228.1 ± 3.0) × 10³、S72G (185.9 ± 2.4) × 10³、I23L (185.1 ± 2.6) × 10³ s⁻¹；k_cat/K_m：WT (37.4 ± 0.6) × 10³、S72G (34.4 ± 0.5) × 10³、I23L (33.6 ± 0.5) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹；5 min还原糖：WT 37.55、S72G 41.63、I23L 51.54 μg/mL；25 min还原糖：WT 110.53、S72G 110.32、I23L 149.62 μg/mL；组合突变体活性变化：I23L-S72N +20.4%、S72N-K74N +57.9%、V184D-S185A +15.9%、I23L-S27Q +20.3%、I23L-S27G相对活性61.7%
组合突变体的热稳定性分析（图3B和C）显示，I23L-S72N、S72N-K74N和V184D-S185A三个变体在65°C和75°C下均表现出比WT更优异的残余活性。在65°C处理1 h后，WT的残余活性为36.4%，而I23L-S72N、S72N-K74N和V184D-S185A的残余活性分别为51.2%、58.7%和66.3%。75°C处理1 h后，三个变体的残余活性分别为33.5%、41.8%和50.2%，而WT仅为22.4%。65°C下半衰期测定结果显示，WT为41.5 ± 0.8 min，而I23L-S72N为50.1 ± 1.0 min，S72N-K74N为60.8 ± 1.2 min，V184D-S185A为71.5 ± 1.4 min（表2）。三个组合突变体的半衰期分别比WT延长20.7%、46.5%和72.3%。
组合突变体的水解曲线（图3D）显示，I23L-S72N、S72N-K74N和V184D-S185A在25 min水解反应中产生的还原糖量均高于WT和单突变体。其中V184D-S185A表现最优，最终还原糖浓度达172.4 μg/mL，较WT（110.53 μg/mL）提高56.0%。I23L-S72N和S72N-K74N的最终还原糖浓度分别为158.3 μg/mL和164.7 μg/mL。动力学参数测定显示，三个组合突变体的K_m值均低于WT，表明底物亲和力进一步提升。I23L-S72N的k_cat/K_m为(42.8 ± 0.7) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，S72N-K74N为(45.6 ± 0.8) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，V184D-S185A为(48.2 ± 0.9) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，均高于WT的(37.4 ± 0.6) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹，表明组合突变有效缓解了单突变体中观察到的稳定性—活性权衡。
3.4 序列与结构分析
利用MEME Suite在来自19个不同菌株的β-琼胶酶中鉴定保守基序（图4A）。多序列比对（图4B）显示，红色背景残基为严格保守残基，黄色背景残基代表部分保守残基。突变位点S72、I23、K74、V184和S185在不同来源的β-琼胶酶中保守性各异，其中S72和K74在多数序列中高度保守，而I23和V184的保守性相对较低。这种保守性差异可能解释了不同位点突变对酶性质的不同影响。
3.5 分子对接分析
为探究突变对酶与底物相互作用的影响，将WT及单突变体S72G、I23L与新琼胶四糖进行分子对接（图5）。WT的对接结果显示，新琼胶四糖结合在催化沟槽内，与催化残基形成氢键和疏水相互作用。S72G的对接图显示，突变后底物结合模式发生改变，部分氢键网络重建。I23L的对接结果显示，突变残基与底物之间形成新的疏水接触，增强了底物结合稳定性。
组合突变体I23L-S72N、S72N-K74N和V184D-S185A与新琼胶四糖的分子对接结果（图6）显示，三个突变体均表现出不同程度的相互作用网络优化。I23L-S72N的对接结构中，S72N突变引入了新的氢键供体/受体，与底物形成额外氢键。S72N-K74N的双突变效应在底物结合口袋中创造了更密集的氢键网络。V184D-S185A的对接结果显示，突变导致的局部电荷重排增强了与底物的静电互补性。
3.6 分子动力学模拟
在338 K下对WT和突变体进行分子动力学模拟以评估其热稳定性差异的分子基础（图7）。RMSD值分析（图7A）显示，WT的RMSD在模拟后期显著升高，表明其结构在高温下发生较大构象偏离。而突变体特别是V184D-S185A的RMSD波动较小，提示其整体结构在高温下更为稳定。Rg值分析（图7B）表明，WT在高温下趋于松散，而突变体保持更紧凑的结构。RMSF值分析（图7C和D）显示，突变体的某些区域柔性与WT存在差异——红色阴影表示RMSF值高于WT的区域，蓝色阴影表示低于WT的区域。突变位点附近的局部柔性变化可能与底物结合和催化效率的改善相关。
催化通道动力学模拟（图8）显示了各突变体与WT的通道重叠图。S72G突变体的催化通道与WT整体结构（黑色网格）高度重叠，但通道直径在突变位点附近略有变化。I23L、I23L-S72N、S72N-K74N和V184D-S185A突变体的通道结构分析显示，突变残基（以不同颜色表示）对通道形状和表面性质产生了不同程度的影响。V184D-S185A的通道在入口处表现出明显的构象调整，这可能有利于底物的进入和产物的释放。
【数据】65°C残余活性（1 h）：WT 36.4%、I23L-S72N 51.2%、S72N-K74N 58.7%、V184D-S185A 66.3%；75°C残余活性（1 h）：WT 22.4%、I23L-S72N 33.5%、S72N-K74N 41.8%、V184D-S185A 50.2%；半衰期（65°C）：WT 41.5 ± 0.8 min、I23L-S72N 50.1 ± 1.0 min、S72N-K74N 60.8 ± 1.2 min、V184D-S185A 71.5 ± 1.4 min；半衰期延长：+20.7%、+46.5%、+72.3%；25 min还原糖：V184D-S185A 172.4 μg/mL（较WT提高56.0%）、I23L-S72N 158.3 μg/mL、S72N-K74N 164.7 μg/mL；k_cat/K_m：I23L-S72N (42.8 ± 0.7) × 10³、S72N-K74N (45.6 ± 0.8) × 10³、V184D-S185A (48.2 ± 0.9) × 10³ mL·mg⁻¹·s⁻¹；模拟温度：338 K；序列分析菌株数：19；MEME基序分析：已执行
讨论与解读
本研究提出了一种有效策略：识别进化耦合网络，理性预测并鉴定有益单突变，再基于共进化原理整合这些突变，成功改造出热稳定性和催化活性同时增强的β-琼胶酶。初始阶段，利用上位性模型鉴定出热稳定性增强的单突变体S72G和I23L。这些突变虽提升了酶的热稳定性，但催化活性略有下降，凸显了酶工程中平衡稳定性与活性的经典难题。这些改进使酶具备在高于琼胶凝胶温度的条件下高效降解的潜力，有望解决琼胶寡糖工业化生产中因底物凝胶化导致的传质限制和低反应效率问题。未来仍需在高底物浓度、制备规模、长期反应及产物谱分析等工艺相关条件下系统评估突变体，以进一步验证其工业应用价值。随后，在进化耦合指导下，鉴定出两个组合突变体（S72N-K74N和V184D-S185A）及一个上位性组合突变体I23L-S72N在酶热稳定性和催化效率方面均表现出协同提升。结构分析表明，这些增强归因于优化的相互作用网络、高温自由状态下增加的构象柔性以及与底物结合后增强的整体结构刚性。
【编译者解读】该研究的方法论价值在于将进化耦合分析从预测工具延伸为组合突变设计蓝图——单突变体S72G和I23L的性能此消彼长，而基于共进化配对的双突变却实现了稳定性与活性的同步增益，这提示上位性互作可作为打破酶工程中稳定性—活性权衡的突破口。分子动力学模拟揭示的“高温自由态柔性增加但底物结合态刚性增强”这一看似矛盾的双重机制，为理解酶的热适应策略提供了新视角。局限在于突变体性能验证仍停留在实验室规模，工业条件下的长周期运行数据尚属空白。
参考来源
Du, Z. (2026). Enhancing β-agarase Y3R1 via synergistic coupling evolutionary sites: An epistasis-guided rational design for improved thermostability and catalytic efficiency. Process Biochemistry. DOI: 10.1016/j.procbio.2026.07.003
DOI: 10.1016/j.procbio.2026.07.003