来源：Efficient bioconversion of corn stover hydrolysates into phenazine-1-carboxylic acid by engineered Pseudomonas chlororaphis for sustainable biopesticide production（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质纤维素是替代石化资源的重要可再生原料，其水解液富含葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。本研究以绿针假单胞菌GP72为底盘，通过适配铜绿假单胞菌基因组规模代谢模型iJN1462，系统改造木糖与阿拉伯糖代谢模块，最终实现玉米秸秆水解液中全部糖类的完全消耗与吩嗪-1-羧酸（PCA）合成，产量达384.2 mg/L。这是首次报道全利用玉米秸秆水解液糖类生产PCA的研究，为木质纤维素生物炼制提供了新范式。
研究背景
木质纤维素生物质因成本低廉、来源广泛，被视为生产可再生燃料和高值化学品的重要原料。其主要由纤维素（25–55%）、半纤维素（11–50%）和木质素（10–40%）组成，可降解为葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等单糖。高效且完全利用水解液中的这些糖类，是提升木质纤维素生物炼制经济竞争力的关键前提。已有大量研究致力于工程化微生物利用木质纤维素主要底物合成3-羟基丙酸、粘康酸、脂质和聚羟基脂肪酸酯等高值化合物。
吩嗪类化合物是一类含氮杂环化合物，在生物防治领域备受关注。其中，吩嗪-1-羧酸（PCA）已在中国注册为生物农药"申嗪霉素"。利用木质纤维素水解液这种低成本原料生产PCA，有望大幅降低生产成本，推动绿色农业的发展。
研究方法
2.1 代谢模型适配
基于铜绿假单胞菌KT2440基因组规模代谢网络模型iJN1462，本研究整合了绿针假单胞菌GP72中存在的10个菌株特异性反应（表S1），并根据Pseudomonas基因组数据库（https://www.pseudomonas.com）和KEGG数据库（https://www.kegg.jp）进行校正。适配后的绿针假单胞菌模型用于通量平衡分析（FBA），以优化朝向吩嗪生物合成途径末端反应的通量分布。此外，模型中整合了四条戊糖代谢途径，并采用一致的约束条件进行FBA分析。进一步地，应用基于强制目标通量的通量扫描（FSEOF）算法系统扫描模型内所有代谢通量。在通量约束下，该算法识别朝向产物合成的通量分布，从而定位需要转录上调的候选基因。
【数据】模型基础：iJN1462（P. putida KT2440）；整合反应数：10个菌株特异性反应；整合途径：4条戊糖代谢途径；数据库：Pseudomonas、KEGG
2.2 菌株、质粒与培养条件
本研究所用菌株和质粒列于表S2和S3。大肠杆菌DH5α作为基因克隆和质粒提取的宿主，在Luria–Bertani培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中培养，添加100 mg/mL氨苄青霉素，37°C、220 rpm振荡培养14小时。绿针假单胞菌GP72及其衍生菌株在GDM培养基[9.9 g/L (NH₄)₂HPO₄、5.8 g/L K₂HPO₄、3.7 g/L KH₂PO₄、0.12 g/L MgSO₄、20 μM FeCl₃·6H₂O]中于28°C培养。
玉米秸秆水解液由上海交通大学的刘成广博士和李凯博士惠赠。玉米秸秆先经清洗、干燥、粉碎，然后在130°C下通过蒸汽发生器提供高温蒸汽进行NaOH碱处理。后续酶解使用商业纤维素酶完成。玉米秸秆水解液成分为：20 g/L葡萄糖、5 g/L木糖、1 g/L阿拉伯糖和约0.5 g/L醛类。使用生物质水解液生产PCA时，按指定%（v/v）浓度进行体积补加。葡萄糖作为共底物与水解液一起添加，其浓度调节至20 g/L。培养含有pBBR1MCS2或其衍生质粒的绿针假单胞菌菌株时，培养基中补充抗生素卡那霉素（50 μg/mL）和氨苄青霉素（100 μg/mL）。
【数据】E. coli DH5α培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；氨苄青霉素：100 mg/mL；温度：37°C；转速：220 rpm；时间：14h；GDM培养基：(NH₄)₂HPO₄ 9.9 g/L、K₂HPO₄ 5.8 g/L、KH₂PO₄ 3.7 g/L、MgSO₄ 0.12 g/L、FeCl₃·6H₂O 20 μM；培养温度：28°C；碱处理温度：130°C；水解液组分：葡萄糖20 g/L、木糖5 g/L、阿拉伯糖1 g/L、醛类约0.5 g/L；卡那霉素：50 μg/mL；氨苄青霉素：100 μg/mL
2.3 表达质粒与菌株的构建
本研究所用引物列于表S4。质粒提取试剂盒和基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）。限制性内切酶和连接酶均购自宝日医生物技术（北京）。用于构建过表达质粒的基因来源于绿针假单胞菌或大肠杆菌K12的基因组。PCR扩增的基因片段通过Gibson组装或T4连接酶连接至经EcoR I和BamH I消化的pBBR1MCS2质粒。所得重组质粒通过电转化导入绿针假单胞菌。
制备绿针假单胞菌电转感受态细胞的方法如下：取20 mL LB培养基过夜培养物，在4°C下以5,000×g离心10分钟。细胞沉淀用10%甘油重悬并如前离心洗涤两次。最终沉淀重悬于0.1 mL 10%甘油中。电转化时，将0.1 mL制备好的细胞与300 ng质粒DNA混合，转移至0.1 cm电转杯中。使用Bio-Rad电转仪施加2.5 kV、6 ms脉冲。脉冲后立即加入1 mL LB培养基，在28°C振荡恢复培养2小时。随后将细胞涂布于含50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板。
【数据】离心：5,000×g、4°C、10 min；洗涤液：10%甘油（2次）；电转细胞量：0.1 mL；质粒DNA：300 ng；电转杯：0.1 cm；电脉冲：2.5 kV、6 ms；恢复培养：28°C、2h、振荡；筛选抗生素：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL；限制性内切酶：EcoR I、BamH I
2.4 基因敲除质粒与菌株的构建
为实现基因敲除，首先通过PCR扩增靶基因的上游和下游区域（各约500 bp）。随后采用重叠PCR方法将这两个扩增片段对齐并连接，生成1000 bp的DNA片段。所得DNA片段经Xba I和Hind III消化后克隆至质粒pK18mobsacB。重组质粒导入大肠杆菌S17-1（λpir）菌株，并通过接合转移转移至绿针假单胞菌GP72ANO。在后续筛选过程中，单交换和双交换重组子在含100 μg/mL氨苄青霉素和50 μg/mL卡那霉素的琼脂平板上筛选，随后在含15%蔗糖的平板上进一步筛选。最后，突变体通过PCR分析和测序验证。
【数据】同源臂长度：约500 bp（各上游/下游）；重叠PCR产物：1000 bp；限制性内切酶：Xba I、Hind III；筛选抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL；蔗糖筛选浓度：15%；验证方法：PCR分析+测序
2.5 细胞生长、PCA效价及糖（葡萄糖、木糖和阿拉伯糖）浓度的测定
绿针假单胞菌的细胞生长通过紫外分光光度计测定培养物在600 nm处的吸光度来监测。PCA效价分析时，发酵液用6 M HCl酸化至pH 2.0，然后在Eppendorf Minispin离心机中以10,000 rpm离心5分钟。上清液用3.6 mL乙酸乙酯剧烈振荡提取5分钟。提取后，取0.4 mL上清液转移至新的Eppendorf管中空气干燥。干燥后，残余物溶于1 mL乙腈中，所得溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC分析使用Agilent 1260系统（Agilent Technologies, CA, USA），配备Agilent Eclipse XDB-C18反相色谱柱（4.6 mm × 250 mm），流动相为0.1%甲酸（A）和乙腈（B）。洗脱流速为1.0 mL/min，扫描波长为254 nm。洗脱程序：0–5 min，80% A；6–15 min，60% A；16–20 min，80% A。
葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的定量采用Bio-Rad HPX-87H阳离子交换柱（Bio-Rad, CA, USA），配差示折光检测器（RID）。流动相为5 mM H₂SO₄，流速设为0.5 mL/min。
【数据】PCA检测酸化：6 M HCl至pH 2.0；离心：10,000 rpm、5 min；萃取剂：3.6 mL乙酸乙酯、振荡5 min；复溶：1 mL乙腈；滤膜：0.22 μm；HPLC系统：Agilent 1260；色谱柱：Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm）；流动相：0.1%甲酸/乙腈；流速：1.0 mL/min；波长：254 nm；糖分析柱：Bio-Rad HPX-87H；检测器：RID；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.5 mL/min
2.6 统计分析
所有分析测量至少进行三次重复，数据以平均值±标准差表示。
【数据】重复次数：≥3次（三次独立重复）；数据表示：平均值±标准差
研究结果
3.1 铜绿假单胞菌基因组规模代谢模型对绿针假单胞菌GP72的适配
鉴于铜绿假单胞菌KT2440已建立的模型iJN1462，本研究将其作为基础来预测细胞代谢并指导绿针假单胞菌GP72的代谢工程改造。为实现从木质纤维素水解液合成吩嗪-1-羧酸（PCA）的模拟，研究者在iJN1462模型中增加了两条额外途径：（i）分支酸衍生的PCA合成途径和（ii）完整的L-阿拉伯糖利用途径。适配后的模型包含1,472个基因、2,937个反应和2,162个代谢物，为模拟绿针假单胞菌GP72的代谢提供了增强的计算框架。适配模型中涉及甘油（绿针假单胞菌常用底物）利用和PCA合成的生化反应网络如图1所示。
基于实验室先前构建的具有增强甘油利用能力的吩嗪产生菌株ANOFK1（ANOΔmgsA::glpF::glpK），研究者模拟了其代谢表型。通过约束由编码蛋白催化的反应通量（上调或敲除），实验数据与模型预测高度一致，验证了适配模型的可靠性。
【数据】模型规模：1,472基因、2,937反应、2,162代谢物；验证菌株：ANOFK1（ANOΔmgsA::glpF::glpK）；验证方式：通量约束（上调/敲除）与实验数据对比
3.2 木糖代谢模块的工程改造
初始测试中，绿针假单胞菌GP72ANO（以下简称ANO）在含有木质纤维素水解液中主要糖类（即葡萄糖、木糖和阿拉伯糖）的极限培养基（GDM）中培养，结果显示该平台菌株不能在木糖上生长（图2A）。在木糖上不能生长意味着要么缺乏跨细胞膜的转运，要么缺乏木糖分解代谢所需的酶学机制。
微生物中常见的四条木糖分解代谢途径为脱氢酶途径、异构酶途径、Weimberg途径和Dahms途径（图2B）。将四条途径导入绿针假单胞菌GP72的适配模型，设置一致的约束条件（木糖摄取速率20 mmol/gDCW/h，氧气摄取速率1000 mmol/gDCW/h）。以PCA合成途径的最终步骤为目标函数，通过通量平衡分析（FBA）获得不同代谢途径的最优解，预测结果显示PCA产量排序为：异构酶途径（0.195 gPCA/gXyl）> Weimberg途径（0.154 gPCA/gXyl）> Dahms途径（0.127 gPCA/gXyl）> 脱氢酶途径（0.107 gPCA/gXyl）（图2C）。
异构酶途径和脱氢酶途径都能将木糖转化为木酮糖-5-磷酸，然后进一步转化为PCA生物合成的前体E4P（图1）。然而，脱氢酶途径需要额外的辅因子（NADPH/NADP⁺），这限制了PCA生产的效率。因此，异构酶途径被预测具有最高的PCA产量。在先前的研究中，Ling等人工程化了铜绿假单胞菌KT2440从木糖合成粘康酸——一种同样源自莽草酸途径的化合物，该论文提示异构酶途径可能比其他途径更具优势。
生物信息学分析确认ANO菌株基因组中内源存在编码木酮糖激酶的xylB基因（MOK_RS0104220），因此无需异源引入木酮糖激酶基因。将来自荧光假单胞菌10586和大肠杆菌K12的xylA（木糖异构酶）分别在ANO菌株中表达以构建异构酶途径，两种工程菌株（即ANO/pBBR-Pf-xylA和ANO/pBBR-Ec-xylA）获得了在以木糖为唯一碳源的GDM培养基上生长的能力，而对照菌株（ANO/pBBR）不能生长（图S1A）。尽管表达荧光假单胞菌10586 xylA的菌株未能合成PCA，但在共表达木糖转运蛋白XylE后情况发生了变化（图2D）。表达大肠杆菌K12 xylA使菌株ANO/pBBR-Ec-xylA直接获得了合成43.4 mg/L PCA的能力，共表达xylE进一步将PCA效价提高至114.2 mg/L（图2D），同时20 g/L木糖在96小时后被完全消耗（图S1B）。共表达xylE（来自大肠杆菌或荧光假单胞菌）后，菌株的生长显著改善（图S1A）。
这一结果表明底物转运是绿针假单胞菌木糖代谢的瓶颈，类似现象在铜绿假单胞菌KT2440和EM42中也有报道。在另一篇报道中，XylE转运蛋白的存在并未影响铜绿假单胞菌S12以木糖为底物的细胞生长。戊糖转运蛋白具有混杂性，因此铜绿假单胞菌S12中可能存在其他负责木糖转运的转运蛋白。
为消除木糖氧化并进一步增强木糖异构酶途径合成PCA，分别敲除了两个编码葡萄糖脱氢酶同工酶的基因gcd1和gcd2。然而，gcd2的缺失导致菌株几乎无法在以木糖为唯一碳源的培养基上生长（图S2A），木糖消耗极少（图S2B），且未检测到PCA产生（图S2C）。gcd1突变菌株的细胞生长和PCA效价分别下降了67.3%（图S2A）和78.1%（图S2C）。已知GCD能将木糖转化为木糖酸——一种末端产物。在先前报道中，敲除gcd在引入木糖异构化途径时增强了铜绿假单胞菌的细胞生长和木糖利用，因为它消除了末端产物并增加了途径通量。另一篇报道显示，台湾假单胞菌VLB120利用木糖酸形成生物量，但其存在Weimberg途径。这种差异可能是由于绿针假单胞菌在自然环境中对木糖的适应性进化与其他假单胞菌属物种不同所致。绿针假单胞菌GP72的染色体已包含xylB——编码木糖异构酶和脱氢酶途径中的一种酶，这在其他假单胞菌属物种中尚未发现。
【数据】木糖摄取速率约束：20 mmol/gDCW/h；氧气摄取速率约束：1000 mmol/gDCW/h；预测PCA产量：异构酶0.195 gPCA/gXyl、Weimberg 0.154 gPCA/gXyl、Dahms 0.127 gPCA/gXyl、脱氢酶0.107 gPCA/gXyl；ANO/pBBR-Ec-xylA PCA：43.4 mg/L；共表达xylE后PCA：114.2 mg/L；木糖消耗：20 g/L、96h完全耗尽；gcd1突变株生长下降：67.3%；gcd1突变株PCA下降：78.1%；xylB基因编号：MOK_RS0104220
3.3 阿拉伯糖代谢模块的工程改造
菌株ANO能够在以阿拉伯糖为唯一碳源的GDM培养基上生长，这意味着ANO菌株含有分解阿拉伯糖的酶学机制（图2A）。这是首次关于绿针假单胞菌利用阿拉伯糖能力的报道，尽管假单胞菌属在这方面相对罕见。ANO中与阿拉伯糖代谢相关的四个基因（araD、araE、araX和araA）在染色体上相邻排列（图S3）。基于生物信息学分析，ANO菌株中的阿拉伯糖代谢途径可能是Weimberg途径——微生物中报道的三种主要阿拉伯糖代谢途径之一（图3A）。
整个阿拉伯糖基因簇araDEXA的缺失导致菌株ANOΔara无法在以阿拉伯糖为唯一碳源的GDM培养基中生长和合成PCA，表明该基因簇负责阿拉伯糖的降解（图3B）。菌株ANOΔaraD、ANOΔaraX和ANOΔaraA均无法在以阿拉伯糖为唯一碳源的GDM培养基中生长和合成PCA（图3B），表明ANO菌株中降解阿拉伯糖的途径为Weimberg途径。有趣的是，缺失编码阿拉伯糖转运蛋白的araE基因的菌株仍能在以阿拉伯糖为唯一碳源的GDM培养基中生长并合成PCA（图3B）。这可能是因为ANO菌株中混杂的戊糖转运蛋白——其他转运蛋白也兼具阿拉伯糖转运功能，或者阿拉伯糖能够通过被动扩散进入细胞。
【数据】阿拉伯糖基因簇：araD、araE、araX、araA（染色体相邻排列）；敲除菌株：ANOΔara、ANOΔaraD、ANOΔaraX、ANOΔaraA（均不能利用阿拉伯糖）；ANOΔaraE（仍能利用阿拉伯糖）；代谢途径类型：Weimberg途径
3.4 葡萄糖代谢模块的工程改造
（图4展示了绿针假单胞菌GP72中葡萄糖代谢途径分析及适配模型预测的基因过表达菌株的PCA效价。）
【数据】图4数据：三次重复的平均值
3.5 工程菌株在模拟木质纤维素水解液中的性能
（图5展示了菌株ANO、ANO/pBBR和ANO/pBBR-LH在模拟木质纤维素水解液中的细胞生长、葡萄糖和戊糖浓度以及PCA效价。）
【数据】菌株基因型：ANO/pBBR（空质粒对照）、ANO/pBBR-LH（表达xylA、xylE等基因）；培养基：模拟木质纤维素水解液
3.6 工程菌株在不同浓度玉米秸秆水解液中的性能
（图6展示了菌株ANO/pBBR-LH在不同比例玉米秸秆水解液中的细胞生长（A）、PCA效价（B）、葡萄糖（C）和戊糖（D）浓度。）
【数据】水解液浓度梯度：%（v/v）梯度；菌株：ANO/pBBR-LH（表达xylA、xylE等基因）；底物：玉米秸秆水解液
讨论与解读
本研究将铜绿假单胞菌基因组规模代谢网络模型iJN1462适配至绿针假单胞菌GP72，适配模型包含1,472个基因、2,937个反应和2,162个代谢物，占绿针假单胞菌GP72测序基因组5,964个预测基因的24.7%。利用该模型，研究者工程化了绿针假单胞菌GP72ANO菌株，使其能够利用玉米秸秆水解液生物合成PCA，产量达384.2 mg/L。据研究者所知，这是首次关于完全利用玉米秸秆水解液主要糖类合成PCA的研究。初步评估表明，这种低成本培养策略的成本仅为传统PCA生产流程的三分之一。基于整体工艺评估，在此条件下实现经济可行性需要800 mg/L的PCA效价，本研究已完成该目标的48%。这些发现强烈表明，在生物反应器中实施补料分批发酵可进一步提高产量，并达到经济可行的阈值。这项工作展示了绿针假单胞菌利用玉米秸秆水解液生物合成PCA的潜力，并为利用木质纤维素生物质通过假单胞菌合成其他高值化学品提供了有价值的参考。尽管本研究构建的高产菌株展现了对葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的高效利用，但其生长……（原文未详述后续内容）。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于将基因组规模代谢模型从近缘物种适配至目标菌株，以模型指导多模块协同工程——从木糖转运瓶颈的识别到阿拉伯糖Weimberg途径的确认，再到葡萄糖模块的优化，路径清晰且逻辑严密。值得注意的是，研究者发现gcd敲除在绿针假单胞菌中反而损害生长，与铜绿假单胞菌中的报道相反，这提示代谢工程策略的种属特异性不可忽视。384.2 mg/L的PCA产量虽距800 mg/L的经济可行性阈值尚有差距，但48%的完成度已展示了模型驱动策略的实用价值。后续若能在生物反应器中结合补料策略，有望进一步逼近经济可行窗口。该研究为假单胞菌属利用真实木质纤维素水解液合成芳香族化合物提供了可复用的方法论框架。
参考来源
Yue, S.-J. (2026). Efficient bioconversion of corn stover hydrolysates into phenazine-1-carboxylic acid by engineered Pseudomonas chlororaphis for sustainable biopesticide production. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133371
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133371