来源：Improved terephthalic acid production from p-xylene using metabolically engineered Pseudomonas putida（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
对苯二甲酸（TPA）是聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的重要单体，全球需求量巨大。本研究以恶臭假单胞菌KT2440为底盘菌株，利用基于RecET的无标记重组工程系统，将pX-to-TPA生物转化途径的异源基因整合至染色体，通过多轮随机整合提高基因拷贝数，并结合双相补料分批发酵优化，最终实现38.25 g/L TPA产量和99.6%摩尔转化率。该研究为无质粒、无抗生素、无诱导剂的工业化TPA生物制造奠定了基础。
研究背景
TPA是生产PET的关键单体，广泛应用于纤维、薄膜和塑料瓶等领域。目前工业上主要通过石油来源的对二甲苯（pX）化学氧化生产TPA，但该工艺需高温高压、存在溶剂损失和反应器腐蚀等问题，且使用重金属和溴化物等环境有害催化剂，副产物4-羧基苯甲醛的形成使转化率难以超过95 mol%。生物制造则在温和条件下运行、使用低毒化学品、不依赖昂贵重金属催化剂，是绿色替代方案。此前研究曾报道代谢工程大肠杆菌可从pX生产6.7 g/L TPA，产率0.278 g/L/h，摩尔转化率96.7%。然而，大肠杆菌对TPA耐受性有限，60 g/L对苯二甲酸二钠即可完全抑制其生长。恶臭假单胞菌KT2440作为芳香族化合物合成的优良底盘菌株，其对TPA的耐受性及代谢工程潜力值得深入探索。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株列于原文表1。大肠杆菌DH5α用于分子克隆和质粒扩增。大肠杆菌常规培养于LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）或LB-琼脂培养基[LB培养基含1.5%（w/v）琼脂]，培养温度30或37°C，必要时补充10 g/L葡萄糖。恶臭假单胞菌菌株用于pX生产TPA，培养于LB培养基、LB(5)培养基（含5 g/L NaCl的LB培养基）、LB-琼脂培养基或LB(0)-琼脂培养基（含0 g/L NaCl的LB-琼脂培养基），培养温度30或37°C，必要时补充100 g/L蔗糖。
摇瓶培养恶臭假单胞菌使用一种极限培养基。该极限培养基（每升）组成为：7.75 g K₂HPO₄、4.25 g NaH₂PO₄·2H₂O、2 g (NH₄)₂SO₄、100 mg MgCl₂·6H₂O、10 mg乙二胺四乙酸（EDTA）和5 mL微量元素溶液，用固体NaOH调pH至7.0。葡萄糖（500 g/L）、MgCl₂·6H₂O（30 g/L）和EDTA（1 g/L）储备液分别单独灭菌，其余组分一同灭菌后加入。微量元素溶液（每升）含：400 mg ZnSO₄·7H₂O、200 mg CaCl₂·2H₂O、1 g FeSO₄·7H₂O、40 mg Na₂MoO₄·2H₂O、40 mg CuSO₄·5H₂O、80 mg CoCl₂·6H₂O、245 mg MnCl₂·4H₂O、114 mg Na₂B₄O₇·10H₂O、40 mg NiCl₂·6H₂O和10 mL浓HCl。
补料分批发酵使用改良极限培养基，其(NH₄)₂SO₄（4 g/L）和MgCl₂·6H₂O（300 mg/L）含量高于摇瓶培养用极限培养基，微量元素溶液中FeSO₄·7H₂O（3 g/L）和CuSO₄·5H₂O（400 mg/L）含量也相应提高。抗生素使用浓度如下：氨苄青霉素（Ap），大肠杆菌50 μg/mL、恶臭假单胞菌500 μg/mL；氯霉素（Cm），大肠杆菌17 μg/mL、恶臭假单胞菌200 μg/mL；卡那霉素（Km），大肠杆菌25 μg/mL、恶臭假单胞菌50 μg/mL；四环素（Tc），大肠杆菌10 μg/mL、恶臭假单胞菌50 μg/mL。
【数据】培养基：LB、LB(5)、LB(0)、极限培养基、改良极限培养基；温度：30或37°C；抗生素浓度：Ap 50/500 μg/mL、Cm 17/200 μg/mL、Km 25/50 μg/mL、Tc 10/50 μg/mL；pH：7.0
2.2 质粒构建与供体DNA制备
所有质粒构建的遗传操作均按标准方案进行。所用质粒列于原文表1，用于质粒构建和线性供体DNA片段（供体dsDNA）制备的寡核苷酸引物分别列于原文表S1和表S2。表S1中还汇总了模板DNA和质粒构建方案，PCR产物或限制性酶切质粒通过酶连或Gibson组装构建最终质粒。所有构建质粒经Sanger测序验证。用于恶臭假单胞菌重组工程的供体质粒从含有它们的大肠杆菌菌株中分离。供体dsDNA按表S2所述引物和PCR方案制备。
【数据】测序方法：Sanger测序；组装方法：酶连/Gibson组装
2.3 恶臭假单胞菌的无标记重组工程
恶臭假单胞菌的无标记重组工程使用供体质粒（表1）或供体dsDNA（表S2），按照先前报道的方案进行。简要流程如下：首先将质粒pJB658-recET转化至目标恶臭假单胞菌菌株，用5 mM间甲基苯甲酸诱导RecE和RecT蛋白表达后制备电转感受态细胞。随后将供体质粒或供体dsDNA电转入感受态细胞，分别在含Tc和100 g/L蔗糖的LB(0)-琼脂培养基或含Tc的LB-琼脂培养基上、30°C条件下筛选Tc抗性克隆。确认基因整合后，导入质粒pRK2Cre，在含Km和1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）的LB-琼脂培养基上、30°C条件下筛选Km抗性克隆以去除重组工程中引入靶染色体位点的tetA(C)基因。最后，将恶臭假单胞菌菌株在无抗生素（即Ap、Km和Tc）的LB-琼脂培养基上、37°C划线以消除质粒pJB658-recET和pRK2Cre，随后分离Ap、Km和Tc敏感克隆。
【数据】诱导剂：5 mM间甲基苯甲酸；筛选标记：Tc、Km；蔗糖：100 g/L；IPTG：1 mM；温度：30°C/37°C
2.4 TPA毒性测定
按照先前报道的方法，通过添加不同浓度的对苯二甲酸二钠盐考察TPA对恶臭假单胞菌KT2440的生长抑制作用。监测细胞生长的摇瓶培养操作如下：首先用恶臭假单胞菌KT2440的甘油储备液接种25 mL试管中的5 mL LB培养基，在旋转摇床200 rpm、30°C培养12 h。然后将1 mL预培养物转接至含25 mL极限培养基（补充7.5 g/L葡萄糖）的250 mL锥形瓶中，在摇床培养箱200 rpm、30°C培养。不同浓度的对苯二甲酸二钠（15、30、60和90 g/L）由储备液（100 g/L，将对苯二甲酸二钠溶于培养基配制）稀释制得。对照组不添加对苯二甲酸二钠。在指定时间点取培养样品测定细胞密度。
【数据】对苯二甲酸二钠浓度：15、30、60、90 g/L；储备液：100 g/L；葡萄糖：7.5 g/L；转速：200 rpm；温度：30°C；时间：12 h
2.5 摇瓶培养条件
摇瓶培养在250 mL锥形瓶（带棉塞）中进行，内含25 mL极限盐培养基，初始葡萄糖浓度7.5 g/L。培养前，从LB平板挑取细胞接种至25 mL试管中的5 mL LB培养基制备预培养物，在旋转摇床200 rpm、30°C培养12 h。随后每瓶接种1 mL预培养物，在摇床培养箱200 rpm、30°C培养。培养6 h后，加入5 mL油醇[60%（w/w），工业级，东京化成工业]，其中含50 μL pX（相当于有机相8.66 g/L、水相1.73 g/L），用于双相分配培养中从pX生产TPA。对于对甲苯甲酸（pTA）补料实验，培养6 h后从10 g/L储备液中加入400 mg/L pTA。培养24 h后取样。双相培养时，取1 mL培养液在16,000×g离心10 min分离水相和有机相，水相样品用于进一步分析。
【数据】工作体积：25 mL；葡萄糖：7.5 g/L；油醇：5 mL（60% w/w）；pX：50 μL（有机相8.66 g/L、水相1.73 g/L）；pTA：400 mg/L；转速：200 rpm；温度：30°C；时间：12 h预培养/24 h培养；离心：16,000×g，10 min
2.6 双相分配补料分批发酵
双相分配补料分批发酵在6.6 L发酵罐（Bioflo 320；Eppendorf）中进行，含1.8 L改良极限培养基（补充10 g/L葡萄糖），温度30°C。种子培养制备：甘油储备液细胞先接种至25 mL试管中的5 mL LB培养基，旋转摇床200 rpm、30°C培养12 h；然后将2 mL培养物转接至250 mL锥形瓶中的100 mL LB培养基，摇床培养箱200 rpm、30°C培养12 h。两份100 mL种子培养物（共200 mL）用于接种发酵罐，使初始工作体积为2 L。发酵期间通过补充氨水（28%，w/w）维持pH 7.0。通过调节搅拌速度（200–1000 rpm）并保持恒定空气流量2.0 L/min，将溶解氧（DO）水平维持在空气饱和度的40%。当1000 rpm搅拌速度不足以维持DO在40%空气饱和度时，通过供应纯分子氧提高空气流中的氧比例。使用Antifoam 204（Sigma-Aldrich）抑制发酵期间泡沫形成。当培养基中初始葡萄糖耗尽后，启动补料分批模式的营养物补加。
【数据】发酵罐：6.6 L；工作体积：2 L；培养基：改良极限培养基+10 g/L葡萄糖；温度：30°C；pH：7.0；DO：40%空气饱和度；搅拌：200–1000 rpm；空气流量：2.0 L/min；氨水：28%（w/w）
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌KT2440对TPA的耐受性评估
为评价恶臭假单胞菌KT2440作为pX生产TPA底盘菌株的适用性，首先在补充0–90 g/L对苯二甲酸二钠（即TPA的二钠盐）的培养基中培养细胞，考察该菌对TPA的耐受性。此处使用对苯二甲酸二钠而非TPA，是因为前者在水中的溶解度远高于后者。随着对苯二甲酸二钠浓度的增加，恶臭假单胞菌KT2440的生长出现延缓（图2）。然而，即使在90 g/L对苯二甲酸二钠（相当于71.2 g/L TPA）存在下，细胞仍然存活，24 h时OD₆₀₀达到3.38 ± 0.06，为未添加对苯二甲酸二钠时最大细胞密度的63.7%（图2）。值得注意的是，60 g/L对苯二甲酸二钠可完全抑制大肠杆菌的生长。该结果表明，恶臭假单胞菌KT2440对TPA的耐受性显著高于大肠杆菌，因此特别有利于TPA的过量生产。
【数据】对苯二甲酸二钠：0–90 g/L（相当于0–71.2 g/L TPA）；OD₆₀₀：3.38 ± 0.06（24 h，90 g/L）；相对细胞密度：63.7%；大肠杆菌完全抑制浓度：60 g/L
3.2 重构pTA-to-TPA转化模块
确认对TPA的高耐受性后，将来自睾丸酮丛毛单胞菌T-2的异源基因——tsaMB（编码对甲苯磺酸单加氧酶）、tsaC（编码4-羧基苯甲醇脱氢酶）和tsaD（编码4-羧基苯甲醛脱氢酶）——引入恶臭假单胞菌KT2440（图1）。为检测异源pTA-to-TPA模块基因在恶臭假单胞菌KT2440中的功能表达，将质粒pTrcMBCD中的合成tsaMBCD盒克隆至质粒pBBR1MCS，置于lac启动子控制下。所得质粒pBBR1MCS-lac-tsaMBCD随后导入恶臭假单胞菌KT2440，构建T1plasmid菌株。在补充400 mg/L pTA作为底物的单相摇瓶培养中，T1plasmid菌株从pTA生产了33.3 ± 4.9 mg/L TPA，而使用野生型恶臭假单胞菌KT2440的对照实验中未检测到TPA（图3a）。T1plasmid菌株摇瓶培养后残留pTA水平为300.7 ± 1.3 mg/L（图S1a）。这些结果表明pTA-to-TPA转化的异源基因在恶臭假单胞菌KT2440中实现了功能表达。
随后，考察将合成Ptac-tsaMBCD盒整合至恶臭假单胞菌KT2440染色体，以构建无质粒、无抗生素标记的pTA-to-TPA转化菌株。利用先前研究开发的基于RecET的无标记重组工程系统，使用供体质粒pTetSac-ΔpvdD::Ptac-tsaMBCD(Par)和pTetSac-ΔpvdD::Ptac-tsaMBCD(Anti)，将Ptac-tsaMBCD盒以两种方向（即与pvdD基因平行和反平行）整合至恶臭假单胞菌KT2440的pvdD位点（图4a），分别构建T1par和T1anti菌株（表S1）。有趣的是，在补充400 mg/L pTA的单相摇瓶培养中，T1par和T1anti菌株分别生产了335.6 ± 5.7和405.1 ± 2.3 mg/L TPA，比质粒携带tsaMBCD基因的产量高出10倍以上（图3a）。T1par和T1anti菌株摇瓶培养后残留pTA水平分别为102.3 ± 2.1和51.5 ± 3.2 mg/L（图S1a）。需要指出的是，摇瓶培养期间无需补充IPTG，因为恶臭假单胞菌KT2440菌株没有编码lac操纵子阻遏物的内源lacI基因。基于这些结果，选择TPA产量高于T1par菌株的T1anti菌株用于后续工程改造。
【数据】pTA底物：400 mg/L；T1plasmid TPA产量：33.3 ± 4.9 mg/L；T1par TPA产量：335.6 ± 5.7 mg/L；T1anti TPA产量：405.1 ± 2.3 mg/L；残留pTA：T1plasmid 300.7 ± 1.3 mg/L、T1par 102.3 ± 2.1 mg/L、T1anti 51.5 ± 3.2 mg/L；产量提升：>10倍
3.3 重构pX-to-pTA转化模块
与上述T1plasmid菌株类似，使用pTacRK2K-xylMA（组成型表达来自恶臭假单胞菌F1的xylMA基因）在恶臭假单胞菌KT2440中表达负责将pX转化为pTA的异源基因，构建X1plasmid菌株。X1plasmid菌株中未引入xylC基因，因为恶臭假单胞菌KT2440已含有内源xylC基因。为在摇瓶水平检测X1plasmid菌株对pX的转化，应用先前建立的双相分配培养系统以促进高挥发性pX在摇瓶培养期间的补充（Luo and Lee, 2017）。简言之，油醇作为pX的有机载体，以受控方式将pX逐渐释放至水相培养基中（图1）。结果表明，在补充50 μL pX（相当于溶剂相8.66 g/L、水相1.73 g/L）的双相分配摇瓶培养中，X1plasmid菌株生产了441.4 ± 5.7 mg/L pTA，证明了重构的pX-to-pTA模块在恶臭假单胞菌中的功能性（图3b）。相比之下，野生型恶臭假单胞菌KT2440的对照摇瓶培养中未检测到pTA（图3b）。
接下来，使用基于RecET的无标记重组工程系统和供体质粒pTetSac15-pvdD7294::Ptac-xylMA（表S1），将质粒pTacRK2K-xylMA中的Ptac-xylMA盒整合至恶臭假单胞菌KT2440 pvdD基因内的另一位点（距Ptac-tsaMBCD整合位点1 kb处；图4a）。在此情况下，Ptac-xylMA盒仅以与pvdD基因反平行的方向整合，因为Ptac-tsaMBCD盒以该方向整合时催化性能更高（图3a）。由此构建了无质粒、无抗生素标记的X1pvdD菌株。与上述T1par和T1anti菌株的情况类似，在补充pX的摇瓶培养中，X1pvdD菌株的pTA产量（1060.3 ± 93.1 mg/L）高于X1plasmid菌株（441.4 ± 5.7 mg/L）（图3a和b）。这些结果验证了恶臭假单胞菌KT2440中上游模块（即pX至TPA）的功能性重构。
【数据】pX：50 μL（溶剂相8.66 g/L、水相1.73 g/L）；X1plasmid pTA产量：441.4 ± 5.7 mg/L；X1pvdD pTA产量：1060.3 ± 93.1 mg/L；野生型：未检测到pTA
3.4 整合pX-to-pTA与pTA-to-TPA模块
为构建能够从pX生产TPA的重组菌株，使用供体质粒pTetSac15-pvdD7294::Ptac-xylMA（表S1）和基于RecET的无标记重组工程系统，将Ptac-xylMA盒整合至T1anti菌株染色体，将pX-to-pTA和pTA-to-TPA转化的最优菌株（分别为X1pvdD和T1anti菌株）合并为单一菌株。所得T1X1pvdD菌株在距Ptac-tsaMBCD整合位点1 kb处携带Ptac-xylMA盒。在补充50 μL pX的双相分配摇瓶培养中，T1X1pvdD菌株从pX生产了TPA，但产量意外地低，仅为66.9 ± 1.2 mg/L（图3c）。由于摇瓶培养后未观察到中间产物pTA的积累（图S1b），推测可能原因是pX-to-pTA模块基因的表达水平相对较低，导致pX向pTA的转化速率较慢。为验证这一假设，将T1X1pvdD菌株在补充400 mg/L pTA的摇瓶中培养。实际上，从pTA生产了368.9 ± 15.7 mg/L TPA（图3c），与T1anti菌株在相同条件下获得的产量（405.1 ± 2.3 mg/L；图3a）相当。此外，用质粒pTacRK2K-xylMA转化T1anti菌株生成的T1X1plasmid菌株，在双相分配摇瓶培养中从pX生产了431.4 ± 1.3 mg/L TPA，比T1X1pvdD菌株（66.9 ± 1.2 mg/L）的产量高5.4倍（图3c）。这些结果支持了T1X1pvdD菌株中整合的Ptac-xylMA模块表达水平不理想的假设，并提示需要筛选更好的整合位点。
【数据】T1X1pvdD TPA产量（pX底物）：66.9 ± 1.2 mg/L；T1X1pvdD TPA产量（pTA底物）：368.9 ± 15.7 mg/L；T1X1plasmid TPA产量（pX底物）：431.4 ± 1.3 mg/L；产量差异：5.4倍
3.5 靶向16S rDNA位点进行基因组整合以提高TPA产量
为提高整合的xylMA基因的表达水平……
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程将恶臭假单胞菌KT2440改造为高效的pX-to-TPA生物转化菌株。尽管从葡萄糖或其他常见底物生产TPA更为理想，但由于相关酶和途径尚未阐明，目前尚不可行。由于可以从生物质获得pX，生物质来源的pX可通过生物转化用于生产TPA。为建立无质粒、无抗生素、无诱导剂的成本竞争优势型TPA生物工艺，所有负责pX-to-TPA生产的异源基因均在组成型启动子调控下整合至恶臭假单胞菌KT2440染色体，利用基于RecET的无标记可迭代重组工程系统。随后通过将额外拷贝的Ptac-tsaMBCD盒随机整合至16S rDNA位点提高TPA产量。使用具有与全部七个16S rDNA位点几乎相同序列的同源臂的供体dsDNA，实现了基于无标记重组工程系统的随机整合。对生成菌株的后续筛选鉴定了具有更高TPA生产性能的重组菌株。最后，通过评估底物补加量、速率和时机等多种因素的最适条件，优化了双相分配补料分批发酵工艺。最终，工程菌株从pX生产了38.25 ± 0.11 g/L TPA，摩尔转化率达99.6 ± 0.6%，相当于将99.3 ± 0.8 g pX转化为154.6 ± 0.5 g TPA。
编译者解读
该研究展示了合成生物学中"基因组整合+多拷贝扩增"策略在工业菌株开发中的强大威力。相比质粒表达系统，染色体整合虽然初期产量较低，但通过随机整合至rDNA位点并结合高通量筛选，反而获得了远超质粒体系的最终产量——这一反直觉的结果值得关注。双相分配培养系统巧妙解决了pX高挥发性和低水溶性的问题，是整条工艺链中不可或缺的工程创新。从应用角度看，无质粒、无抗生素、无诱导剂的三无体系大幅降低了工业化生产成本和监管障碍。然而，从pX而非葡萄糖等可再生碳源出发仍是该路线的局限，未来若发现从可再生底物合成pX或直接合成TPA的酶促途径，该菌株平台将释放更大潜力。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2023
DOI: 10.1016/j.ymben.2023.01.007
DOI: 10.1016/j.ymben.2023.01.007