来源：Assessment strategy for bacterial lignin depolymerization: Kraft lignin and synthetic lignin bioconversion with Pseudomonas putida（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素是自然界第二大生物聚合物，其生物转化为高附加值产品是可持续工业的关键路径。本研究提出了一种新的分析策略，利用恶臭假单胞菌KT2440作为脱木质素菌株、大肠杆菌作为非脱木质素对照，对工业Kraft木质素和合成脱氢聚合物（DHP）进行了为期7天的生物转化动力学研究。通过高效体积排阻色谱（HPSEC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）对培养上清液和菌体沉淀进行综合分析，揭示了菌株特异性作用机制，包括酚类代谢产物的瞬时形成以及对Kraft木质素自组装现象的抑制。
研究背景
全球变暖、人口增长和资源枯竭问题日益严峻，推动了基于可再生资源和低废弃物产生的可持续工业发展需求。然而，向生物质基工业的转型在很大程度上取决于经济效益。作为地球上第二大生物聚合物和木质纤维素生物精炼的残留物，木质素被视为可再生碳的可持续来源之一。木质素是多功能多酚聚合物，其转化为生物塑料单体、大宗化学品和医药产品等高附加值分子，有助于兼顾可持续工业的经济、社会和环境需求。采用微生物生物转化工艺的环境效益尤为突出。使用Kraft木质素等目前作为纸浆和造纸工业低价值副产品的技术木质素，将进一步增强这种效益。因此，技术木质素的生物转化为功能性生物分子已成为技术和工业挑战。
研究方法
2.1 细菌培养
#### 2.1.1 菌株
恶臭假单胞菌KT2440（ATCC 47054）是恶臭假单胞菌mt-2的革兰氏阴性菌衍生物。大肠杆菌W（ATCC 9637）作为对照菌株，因其不能代谢木质素化合物。
#### 2.1.2 木质素底物
商业松木Kraft木质素Indulin® AT（MeadWestvaco；美国里士满）在使用前用二氯甲烷提取，作为细菌培养的底物（"Indulin"底物）。第二种底物为合成DHP木质素，通过漆酶引发的松柏醇聚合获得，使用变色栓菌漆酶和20/80 wt. 丙酮/pH 4.5缓冲液体系。
#### 2.1.3 培养条件与细菌生长分析
M63基本培养基（KH₂PO₄，13.6 g/L；(NH₄)₂SO₄，2 g·L⁻¹）补充MgSO₄（0.12 g·L⁻¹）和微量元素。葡萄糖作为共底物，浓度为1 g·L⁻¹——添加易降解碳源已被证明可促进恶臭假单胞菌对木质素的降解。木质素底物（1 g·L⁻¹）溶解于M63培养基中。通过添加10 M NaOH将pH调至12以溶解木质素，然后用10 M HCl将pH降至7.5以保证细菌生长。此步骤未导致沉淀形成。培养基经0.2 μm过滤灭菌，并确认培养基制备未导致显著的分子量分布变化（见补充数据）。250 mL锥形瓶装入100 mL培养培养基，接种相应菌株至OD₆₀₀为0.1，于30°C、200 rpm持续搅拌下培养。通过测量600 nm处吸光度（OD₆₀₀）监测细胞生长。为评估可重复性，使用Indulin和恶臭假单胞菌进行了独立重复实验（菌体沉淀提取除外），使用相同底物和菌株但新制备的培养基并无细胞对照（第二轮独立实验）。
【数据】菌株：恶臭假单胞菌KT2440（ATCC 47054）、大肠杆菌W（ATCC 9637）；培养基：M63（KH₂PO₄ 13.6 g/L；(NH₄)₂SO₄ 2 g·L⁻¹；MgSO₄ 0.12 g·L⁻¹）；葡萄糖：1 g·L⁻¹；木质素底物：1 g·L⁻¹；pH：12（溶解）→7.5（培养）；接种OD₆₀₀：0.1；温度：30°C；转速：200 rpm；培养体积：100 mL/250 mL锥形瓶
2.2 培养样品回收与纯化
#### 2.2.1 上清液收集
为研究脱木质素动力学，沿生长曲线取样。通过离心全培养液（15 min，4000 rpm，4°C）收集样品。100 mL培养液分装至两个离心管中，上清液冷冻干燥48 h供进一步分析。冻干后，同一培养条件的样品重新合并。菌体沉淀于−80°C保存。
【数据】离心：15 min，4000 rpm，4°C；冻干：48 h；菌体沉淀保存：−80°C
#### 2.2.2 酸沉淀聚合木质素（APPL）制备及上清液中酸溶性化合物的提取
冻干上清液溶于35倍量（w/w）水中，然后用2 M HCl酸化至pH < 3。4°C放置30 min后，样品离心（15 min，4000g，4°C）。沉淀含APPL。沉淀操作重复两次。为从酸溶性部分分离可溶性木质素，取6.3 mL酸溶性级分，用3 mL CH₂Cl₂/EtOAc（50/50，v/v）混合液萃取三次，减压（旋转蒸发）浓缩至终体积1800 μL。萃取前加入15 μL二十一烷（C21）溶液（0.245 μg·μL⁻¹）作为气相色谱内标。
【数据】酸化：2 M HCl至pH < 3；4°C放置30 min；离心：15 min，4000g，4°C；萃取溶剂：CH₂Cl₂/EtOAc（50/50，v/v）；萃取次数：3次；浓缩终体积：1800 μL；内标：二十一烷（C21）15 μL，0.245 μg·μL⁻¹
#### 2.2.3 菌体沉淀中木质素的提取
对冻干菌体沉淀进行过量溶剂顺序提取。先用己烷提取（脂质提取），剩余沉淀悬浮于二氧六环/水混合液（90/10，v/v）中，涡旋并在超声波浴中处理20 min，然后离心（15 min，4000g，4°C）。二氧六环/水提取液和剩余沉淀分别冻干并乙酰化供进一步分析。无细菌生长的样品（重量小于1 mg）分析一次，其他样品（约15 mg）重复分析两次。
【数据】提取溶剂：己烷（脂质）→二氧六环/水（90/10，v/v）；超声处理：20 min；离心：15 min，4000g，4°C
2.3 样品分析
#### 2.3.1 HPSEC测定表观分子量分布
##### 2.3.1.1 样品制备
初始木质素、APPL和菌体沉淀样品（10 mg）在室温下用吡啶（200 μL）和乙酸酐（400 μL）混合物乙酰化48 h。乙酰化在避光条件下进行。然后通过添加甲醇（200 μL）并在40°C氮气流下蒸发去除乙酰化试剂，随后用甲苯（200 μL）洗涤三次并蒸发至干，最后用甲醇（200 μL）洗涤一次。样品冻干后溶解于稳定化四氢呋喃（THF）中，经0.45 μm PTFE膜针头过滤器过滤后进行HPSEC分析。乙酰化APPL样品溶于1 mL THF中，乙酰化菌体沉淀样品以20 mg·mL⁻¹浓度溶于THF中。CH₂Cl₂/EtOAc（50/50，v/v）中的酸溶性提取物在溶剂蒸发并以2倍体积减少的THF溶解后不经乙酰化直接分析。
【数据】乙酰化：吡啶200 μL + 乙酸酐400 μL，室温48 h，避光；蒸发温度：40°C（氮气流）；洗涤：甲苯200 μL×3 + 甲醇200 μL×1；过滤：0.45 μm PTFE膜；乙酰化APPL溶解：1 mL THF；乙酰化菌体沉淀浓度：20 mg·mL⁻¹
##### 2.3.1.2 HPSEC-UV分析
乙酰化样品的HPSEC分析在室温下进行，系统配备PL-gel混合C型孔径柱（Polymer Laboratories，5 μm，600 × 7.5 mm），UV检测波长为280 nm，稳定化THF（1 mL·min⁻¹）为流动相。使用聚苯乙烯标准品（Polymer Labs EasyCal PS2A和B；质量范围580–364,000 g·mol⁻¹）进行校准。色谱图使用校准方程log M = 10.93–0.4403 × 保留时间（RT）转换为log M分布。非乙酰化样品（酸溶性化合物）使用100 Å PL-gel柱（Polymer Laboratories，5 μm，600 mm × 7.5 mm）分析。该柱使用聚环氧乙烷标准品（Igepal，Sigma–Aldrich，美国圣路易斯）和纯化木质素模型化合物进行校准。
【数据】色谱柱：PL-gel混合C型（5 μm，600 × 7.5 mm）；检测波长：280 nm；流动相：稳定化THF，1 mL·min⁻¹；校准标准：聚苯乙烯580–364,000 g·mol⁻¹；校准方程：log M = 10.93–0.4403 × RT；第二色谱柱：100 Å PL-gel（5 μm，600 × 7.5 mm）
#### 2.3.2 气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析CH₂Cl₂/EtOAc可溶性酚类化合物
从上清液酸溶性级分中回收的CH₂Cl₂/EtOAc提取物在GC-MS分析前浓缩10倍。取浓缩溶液等分试样（20 μL），用双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA，50 μL）和吡啶（20 μL）进行硅烷化处理。GC在SPB5聚（5%二苯基-95%二甲基硅氧烷）毛细管柱（Supelco，30 m × 0.2 mm内径，0.25 μm）上进行，氦气为载气（0.5 bar入口压力），温度从180°C以2°C/min升至260°C。以二十一烷C21为内标，使用纯商业化合物（香草醛、香草酸和乙酰香草酮）和合成模型化合物（二氢阿魏酸和二氢松柏醇，NMR合成方案和表征见S1）对酚类化合物进行定量。
【数据】浓缩倍数：10倍；硅烷化：BSTFA 50 μL + 吡啶 20 μL；色谱柱：SPB5（30 m × 0.2 mm内径，0.25 μm）；载气：氦气，0.5 bar；升温程序：180°C→260°C，2°C/min；内标：二十一烷C21
#### 2.3.3 初始DHP样品的硫代酸解
硫代酸解按Sipponen等人（2013）的方法重复两次，使用20 mg DHP（按100% Klason含量计），0.5 mg二十一烷C21（Fluka）为内标。DHP衍生的愈创木基（G）硫代酸解单体的三甲基硅烷基衍生物通过GC-MS定量。
【数据】DHP用量：20 mg；内标：二十一烷C21 0.5 mg；重复次数：2次
研究结果
根据图1所示的实验策略，研究了细菌处理对整体Kraft木质素Indulin和DHP样品的影响。每次培养后，离心培养液以分离菌体沉淀中的细菌细胞与上清液中的可溶性木质素化合物。这些化合物预计包含聚合物和寡聚体以及酚类单体，可能最初存在或在培养过程中释放。为研究聚合木质素的变化，采用酸沉淀法从上清液中分离APPL级分。同时，用CH₂Cl₂/EtOAc混合液从酸溶性级分中回收酚类化合物，以去除来自培养基或细菌的糖类和其他可能的污染物。为研究可能结合在菌体沉淀中细胞上的木质素，开发了二氧六环/水溶液（90/10，v/v）提取方法。这种木质素选择性溶剂通常在实验室规模用于木质素分离。来自细菌生物量的蛋白质和DNA预计不会溶解在这种非极性有机溶剂中。本节报告了与恶臭假单胞菌培养后各样品APPL和酸溶性级分中同时观察到的变化，以及大肠杆菌所证明的非细菌特异性效应及其对可重复性的影响。
3.1 恶臭假单胞菌对Indulin和DHP木质素的作用
#### 3.1.1 APPL的转化
Indulin与恶臭假单胞菌培养后，APPL产率在最初6 h内下降了30%（图2）。无细胞对照中也观察到下降。然而，7天后，培养样品的APPL产率比无细胞对照低17%，比初始APPL产率低28%。这一结果表明恶臭假单胞菌对Indulin具有脱木质素作用。对于DHP，APPL产率过低，无法精确检测变化（数据未显示）。为评估Indulin APPL产率的下降是否归因于不溶性聚合物转化为较低分子量的可溶性化合物，对APPL和酸溶性木质素级分均进行了HPSEC分析。
【数据】Indulin APPL产率变化：6 h内下降30%；7天后比无细胞对照低17%，比初始低28%
#### 3.1.2 APPL和酸溶性级分的分子量分布变化
Indulin和DHP的APPL级分的表观分子量分布由HPSEC谱图获得，并以最大吸光度归一化（图3a和4a）。这些分布确认APPL主要由聚合物组成（log M高达5）。相比之下，酸溶性级分的HPSEC谱图表明存在单体、二聚体和寡聚体（根据保留时间，聚合度（PD）小于10）。对于两种样品，初始（0 h）培养上清液中可萃取的酚类单体仅以低比例存在（Indulin占干上清液的0.02%，DHP仅有痕量香草醛和香草酸（表1））。这与Indulin的二氯甲烷预提取以及DHP的松柏醇聚合过程一致。Indulin单体级分的初始组成与文献一致，反映了Kraft制浆过程中发生的解聚过程。
【数据】APPL聚合物log M：高达5；酸溶性级分聚合度：<10；Indulin初始酚类单体：0.02%干上清液；DHP初始酚类单体：仅痕量香草醛和香草酸
##### 3.1.2.1 Indulin观察到的变化
Indulin与恶臭假单胞菌培养仅诱导APPL木质素级分的归一化表观分子量分布发生轻微变化，而24 h对照样品则呈现出向更高分子量偏移的分布（图3a）。这种偏移表明在没有细菌的情况下发生了木质素自聚合或聚集，而恶臭假单胞菌阻止（或延迟）了这种表观木质素自组装现象。由于无细胞对照在24 h培养后可溶性级分未观察到显著变化（图3b中恶臭假单胞菌0 h与无细胞24 h谱图重叠），因此推断低分子量化合物不参与这一现象。仔细观察分子量分布发现，在恶臭假单胞菌生长阶段（0–24 h）有向较低分子量的轻微偏移（图3a）。在10 h时观察到酸溶性寡聚体比例略有增加，随后在24 h时下降（RT = 14–17.5 min；图3b）。这一观察结果与木质素解聚释放可溶性化合物、随后被恶臭假单胞菌降解和吸收的过程一致。另一方面，单体似乎在培养10 h时即被恶臭假单胞菌转化（图3b，18 min处峰），GC-MS分析确认了Indulin中初始存在的酚类单体被消耗（表1）。7天后，观察到向较高分子量的轻微偏移（图3a，7 d线位于0 h线的更高更右位置），同时所有可溶性化合物的比例下降（图3b，7 d线为最低线）。综合这些结果，Indulin的APPL级分经历了两个对抗过程：恶臭假单胞菌生长阶段的解聚，随后是再聚合——再聚合在无细胞对照中表现为自发现象。GC-MS对酚类单体的分析（表1）表明，香草醛、香草酸和二氢松柏醇（DHCA）被恶臭假单胞菌转化，在10至24 h之间瞬时形成二氢阿魏酸（DHFA）。与DHCA的初始摩尔含量（0.3 μmol g⁻¹）一致，DHFA（10 h时最大0.1 μmol g⁻¹）可能以类似于白腐真菌木质素降解中松柏醇转化为阿魏酸的方式由DHCA形成。DHFA随后可能转化为香草酸，如荧光假单胞菌中所报道的。同时，在恶臭假单胞菌培养结束时乙酰香草酮浓度特异性增加（表1），表明该化合物在7天后形成。事实上，该化合物已被证明通过β-O-4键的细菌裂解从木质素中释放。在7天前，乙酰香草酮要么未被代谢，要么可能在形成的同时被消耗。
【数据】Indulin APPL分子量偏移：24 h对照向高分子量偏移；恶臭假单胞菌生长阶段（0–24 h）向低分子量轻微偏移；DHCA初始含量：0.3 μmol g⁻¹；DHFA最大含量：0.1 μmol g⁻¹（10 h时）；单体转化时间：10 h
##### 3.1.2.2 DHP观察到的变化
对于DHP，对照组观察到较高分子量APPL的比例略有增加，但与Indulin的结果相比，分子量分布没有发生偏移（图4a），表明DHP不太倾向于自组装。恶臭假单胞菌培养24 h后，较高分子量化合物比例的增加被增强，并在7天时达到最大值。与Indulin一样，在短时间培养（10 h）时观察到轻微下降。曲线低分子量部分（400–900 g·mol⁻¹）的变化在10 h时即发生，一个新峰逐渐形成，对应表观分子量为520 g·mol⁻¹，而表观分子量为630 g·mol⁻¹的肩峰（相当于四聚体）消失。一致地，可溶性级分的分析（图4b）也显示四聚体和较高分子量寡聚体随时间减少（RT = 14–15.5 min处的色谱图部分），随后二聚体富集（15.8 min处峰）。7天时二聚体峰的加宽（图4b）表明形成了新的二聚体。聚合度大于3的DHP寡聚体似乎被恶臭假单胞菌转化为较低分子量化合物。与Indulin相比，DHP的寡聚体级分表现出更高的表观反应性，与恶臭假单胞菌培养时具有更明显的解聚效应。寡聚体和APPL中较高聚合级分的同步增加可以解释前面注意到（3.3.1）的APPL量缺乏明确趋势的原因。
【数据】DHP新峰表观分子量：520 g·mol⁻¹（10 h形成）；消失肩峰：630 g·mol⁻¹（四聚体）；寡聚体转化范围：400–900 g·mol⁻¹；聚合度>3的寡聚体被转化
讨论与解读
4.1 实验方法的相关性
本研究开发策略的新特点包括：1）同时生物转化两种类型的木质素（技术木质素和DHP），揭示底物特异性机制；2）动力学研究（7天以上），揭示瞬时转化和长期物理化学效应；3）使用非脱木质素细菌（大肠杆菌）作为对照（除常规无细胞对照外）；4）分析菌体沉淀中所含的木质素。从方法学角度看，该策略产生了两个对木质素分析具有重要意义的主要结果。第一个结果是，通过离心培养液，部分木质素损失在菌体沉淀中。这种损失可能导致上清液中高分子量化合物比例的表观下降，从而错误地得出发生解聚的结论（例如非降解菌大肠杆菌）。第二个重要结果是，细菌培养对木质素的解聚作用可能被木质素自聚合（如Kraft木质素所观察到的）或氧化木质素产物的再缩合（如DHP所观察到的）所掩盖。
编译者解读
本研究的方法论价值在于建立了"三重对照+多级分分析"的木质素生物降解评估框架。将菌体沉淀中的木质素纳入分析，揭示了一个常被忽视的系统性偏差——离心过程中木质素随菌体共沉淀可造成解聚的假阳性判断。从合成生物学应用角度看，该策略为筛选和验证木质素降解菌株提供了更严谨的评估工具。其局限在于DHP的APPL产率过低限制了部分定量分析，且7天培养周期内观察到的再聚合现象提示，在实际生物转化工艺设计中需考虑抑制木质素自组装或再缩合的策略。
参考来源
E. Rouches. Assessment strategy for bacterial lignin depolymerization: Kraft lignin and synthetic lignin bioconversion with Pseudomonas putida. Bioresource Technology Reports, 2021. DOI: 10.1016/j.biteb.2021.100742
DOI: 10.1016/j.biteb.2021.100742