假单胞菌降低菠菜砷含量：功能与基因组整合研究

来源：Arsenic mitigation in spinach using Pseudomonas putida NBRI-RC5.2: Integrating functional traits with genomic insights（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：蛋白可溶性优化分析

导读

砷污染威胁全球食品安全，叶菜类蔬菜尤其容易富集砷。本研究从印度恒河平原砷污染区域采集蔬菜及根际/内生菌样本，分离出约763株耐砷细菌，并筛选出具有砷酸盐还原能力的Pseudomonas putida NBRI-RC5.2。该菌株可使菠菜叶片总砷含量降低约88%。全基因组分析与基因表达研究揭示了其砷解毒的分子机制，为开发靶向砷污染农田的生物肥料提供了候选菌株。

研究背景

砷是一种公认的有毒类金属，长期暴露对环境和人类健康均有负面影响。土壤和水是人体砷暴露的主要途径。在好氧环境（pH 5–8）中，砷主要以砷酸盐[As(V)]形式存在，通过磷酸盐转运蛋白（pst/pit）被植物吸收；而在中性pH的厌氧条件下，亚砷酸盐[As(III)]占主导，经由水甘油通道蛋白（g1pF）和甘油促进因子进入细胞。水稻作为主食已被确认为砷暴露的主要来源，但通过食用污染土壤中种植的蔬菜、水果和其他作物同样会造成膳食砷暴露。

目前研究多聚焦于水稻中的砷积累，蔬菜作物中的砷吸收相对研究不足。叶菜类蔬菜尤其倾向于积累比茄科、十字花科、根菜类/块茎类和豆科作物更高水平的重金属。菠菜天然富含矿物质和维生素，是人体饮食的重要组成部分，但因其高积累特性，在污染土壤中种植菠菜会带来显著的砷暴露风险。

研究方法

2.1 采样点

印度已有十八个邦和三个中央直辖区记录到砷污染，其中西孟加拉邦、比哈尔邦和北方邦的严重程度最高。本研究从这些邦的受影响区域系统采集了蔬菜、灌溉水和土壤样本。每个样本的位置和特征见表S1。所有采集基质中的砷浓度均采用原子吸收光谱法（AAS；PinAAcle-900T）进行定量。

【数据】采样区域：西孟加拉邦、比哈尔邦、北方邦；检测方法：AAS（PinAAcle-900T）

2.2 耐砷细菌的分离与表征

采用系列稀释涂布法，在添加25–500 μg mL⁻¹ As(III)和50–2500 μg mL⁻¹ As(V)的营养琼脂培养基上，从不同蔬菜的根际和内生区域分离耐砷细菌菌株，随后在28°C下培养48小时。进一步使用AgNO₃方法对选定的耐砷细菌菌株进行不同的砷生物转化能力表征，包括亚砷酸盐氧化、砷酸盐还原和亚砷酸盐甲基转移酶活性。

【数据】分离方法：系列稀释涂布法；培养基：营养琼脂+25–500 μg mL⁻¹ As(III)或50–2500 μg mL⁻¹ As(V)；培养条件：28°C、48h；筛选方法：AgNO₃法

#### 2.2.1 分子鉴定

经过初步定性筛选后，对具有不同生物转化特性的选定耐砷菌株，通过砷生物转化基因（ABGs）的基因特异性PCR扩增进行进一步评估，随后使用16S rRNA基因测序进行鉴定。所有获得的16S rDNA和ABG基因序列均使用MEGA X软件通过最大似然法构建系统发育树。

【数据】鉴定方法：基因特异性PCR扩增+16S rRNA基因测序；建树方法：最大似然法（MEGA X）

#### 2.2.2 硫醇类抗氧化化合物的评估

在100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)胁迫条件下，进一步分析了选定菌株中硫醇类抗氧化剂的作用。按照先前描述的方法定量了选定培养物中的半胱氨酸、谷胱甘肽（GSH）、总抗氧化能力（TAC）和酚类含量。

【数据】胁迫浓度：100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)；检测指标：半胱氨酸、GSH、TAC、酚类含量

#### 2.2.3 砷胁迫下植物促生属性的评估

在对照和砷胁迫条件[As(III)和As(V)均为100 μg mL⁻¹]下，进一步评估了选定菌株的各种植物促生（PGP）性状。评估的性状包括磷酸盐溶解、生长素和海藻酸盐生物合成，以及胞外多糖（EPS）形成。

【数据】胁迫条件：100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)；评估性状：磷酸盐溶解、生长素、海藻酸盐、EPS

2.3 菠菜中亚砷酸盐胁迫的缓解

具有特征性砷生物转化性状、PGP属性和产生硫醇类抗氧化剂能力的细菌菌株，在温室条件下评估了其对菠菜的胁迫缓解潜力。将5日龄菠菜幼苗移植到无菌土壤-蛭石混合物中，在20 mg kg⁻¹砷胁迫条件下与选定菌株一起培养。处理组为：（i）对照，（ii）As(III)（20 mg kg⁻¹），以及（iii–xiii）As(III)与不同菌株（Bh1.16、Bh2.4、LK18.3、RC5.2、LK15R.3、LK35.1、GA1.1、LK3S.2、LK23R.3、LK4R.1、LK22.3）的组合。移植时用细菌培养物处理菠菜幼苗，并在不同时间间隔用Hoagland培养基灌溉。移植15天后加入亚砷酸钠As(III) @20 mg kg⁻¹。移植60天后测量生理和形态参数，包括地上部和根长、叶片数和生物量。

【数据】幼苗日龄：5天；基质：无菌土壤-蛭石；砷浓度：20 mg kg⁻¹ As(III)；处理组数：13组；砷添加时间：移植后15天；测量时间：移植后60天

#### 2.3.1 菠菜理化性质评估

通过酚类和总抗氧化物的产生来评估细菌接种对菠菜植株抗氧化潜力的影响。菠菜植株中的硫醇类抗氧化化合物也通过半胱氨酸和谷胱甘肽含量（GSH和GSSG）进行评估。

【数据】检测指标：酚类、总抗氧化物、半胱氨酸、GSH、GSSG

#### 2.3.2 砷吸收的定量

使用AAS评估选定细菌菌株对菠菜叶片总砷吸收的影响。取在砷胁迫（20 mg kg⁻¹）条件下与选定菌株共培养的菠菜阴干叶片组织（250 mg），用HNO₃和H₂O₂的混合物（9:1比例）通过微波消解方法进行消化。消解后，所有样品经过滤、超纯水稀释，并通过AAS分析。

【数据】叶片用量：250 mg；消解液：HNO₃:H₂O₂=9:1；消解方法：微波消解；检测方法：AAS

2.4 全基因组测序与组装

选择最能降低菠菜（Spinacia oleracea）砷吸收的最佳耐砷菌株P. putida NBRI-RC5.2（RC5.2）进行全基因组分析，以揭示砷解毒的基因组学见解。获得的原始序列读段通过fast QC工具评估，随后使用SPAdes 4.0.0基因组组装器组装高质量读段。组装读段质量通过QUAST基因组组装评估工具分析。使用PROKKA（默认细菌注释数据库）对组装的重叠群进行基因预测和注释，同时使用AUGUSTUS进行额外基因预测。使用BLASTALL程序（blast 2.2.18）对预测基因进行注释以查找目标基因。进一步进行KEGG分析以找到相关的代谢途径，包括生长素、谷胱甘肽、半胱氨酸和海藻酸盐生物合成，用于功能解释。

【数据】组装工具：SPAdes 4.0.0；质控工具：fast QC、QUAST；注释工具：PROKKA、AUGUSTUS、BLASTALL；通路分析：KEGG

2.5 NBRI-RC5.2中鉴定的砷抗性基因表达分析

鉴定为能降低菠菜砷吸收的最有效菌株RC5.2，被进一步研究其砷解毒能力。菌株RC5.2在砷胁迫条件下于28°C振荡培养。在接种后初始（0小时）和12小时，在添加100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)的营养肉汤培养基中进行砷处理，再经过12小时培养后取样。从菌株RC5.2基因组中检索已注释基因的序列以了解砷抗性相关潜在基因的功能；合成的引物列于表S3。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）从不同条件下生长的细菌沉淀中提取总RNA，随后按照制造商说明（Thermo Scientific）进行cDNA合成。

【数据】培养温度：28°C；振荡培养；砷浓度：100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)；处理时间点：0h、12h；取样时间：处理后12h；RNA提取：RNeasy Mini Kit

2.6 生物修复效率的测定

使用前述实验中砷处理12小时后收集的培养上清液评估RC5.2的生物修复效率，随后用浓硝酸和过氧化氢（3:1）消化。两种实验条件下的总砷含量通过AAS定量。修复效率使用Waqar等人（2025）描述的公式计算：砷去除效率% = (Có − Cé)/Có × 100（Có = 砷初始浓度；Cé = 砷最终浓度）。

【数据】消化液：浓硝酸:H₂O₂=3:1；检测方法：AAS；计算公式：砷去除效率% = (Có − Cé)/Có × 100

2.7 NBRI-RC5.2砷解毒能力评估

定量细菌细胞吸收和排出的总砷：将培养12小时的培养物加入100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)。在砷暴露后第3、5和7天收集样品。滤液和培养物沉淀样品均进行酸消化（7.5 mL滤液加2.5 mL硝酸；沉淀加10 mL硝酸）后再分析。然后使用AAS测量总砷浓度以评估菌株RC5.2的解毒能力。

【数据】砷浓度：100 μg mL⁻¹ As(III)和As(V)；采样时间：第3、5、7天；消化：滤液7.5 mL+2.5 mL硝酸；沉淀+10 mL硝酸；检测方法：AAS

研究结果

3.1 蔬菜作物中的砷积累

考虑到地下水、土壤和可食用作物中砷的显著存在，从印度恒河平原（涵盖北方邦、比哈尔邦和西孟加拉邦）采集了相应样本[图1(a)]。结果显示，在北方邦，Ballia（18–31 mg kg⁻¹）和Prayagraj（21–31 mg kg⁻¹）的地下水和土壤砷含量最高，而Lakhimpur为20–27 mg kg⁻¹。在比哈尔邦，Buxar（49–116 μg L⁻¹）和Patna（19–49.4 mg kg⁻¹）的地下水和土壤样品中砷含量较高。西孟加拉邦的东Bardhaman地下水砷含量较高（89–780 μg L⁻¹），与Nadia地区此前的报道（89–825.00 μg L⁻¹）一致。北24 Parganas的土壤砷含量为13–99 mg kg⁻¹，而Singh等人（2024）此前的报道为46.17–66.00 mg kg⁻¹。

在所有测试作物中，从Ballia（644–1295 μg kg⁻¹ dw）、Patna（1132 μg kg⁻¹ dw）和北24-Parganas（8539–12,043 μg kg⁻¹ dw）采集的叶菜积累了较高量的砷。在叶菜中，菠菜的砷积累量最高（874–12,043 μg kg⁻¹ dw），其次为苋菜（3941–10,800 μg kg⁻¹ dw）和落葵（5420–8539 μg kg⁻¹ dw）。在块茎类中，魔芋（2440–3773 μg kg⁻¹ dw）的砷含量比允许限值高出三倍，而芋头（1084–3998 μg kg⁻¹ dw）的砷积累量最低。

菠菜叶片中观察到的较高砷积累可能与其快速转运有关。相比之下，魔芋在块茎中积累的砷最多，可能与其粗厚的储藏型根系和高水平的富含硫醇化合物（谷胱甘肽和植物螯合肽）有关，用于砷的区室化隔离。这些作物特异性差异反映了决定不同植物部位砷积累的对比性吸收、隔离和转运机制。

【数据】地下水砷含量：Ballia 18–31 mg kg⁻¹；Prayagraj 21–31 mg kg⁻¹；Lakhimpur 20–27 mg kg⁻¹；Buxar 49–116 μg L⁻¹；Patna 19–49.4 mg kg⁻¹；东Bardhaman 89–780 μg L⁻¹；北24 Parganas土壤13–99 mg kg⁻¹；菠菜砷积累：874–12,043 μg kg⁻¹ dw；苋菜：3941–10,800 μg kg⁻¹ dw；落葵：5420–8539 μg kg⁻¹ dw；魔芋：2440–3773 μg kg⁻¹ dw；芋头：1084–3998 μg kg⁻¹ dw

3.2 耐砷细菌的表征

从根际分离到约500株耐受500 μg mL⁻¹ As(III)和2500 μg mL⁻¹ As(V)的细菌分离物，以及263株耐受25 μg mL⁻¹ As(III)和50 μg mL⁻¹ As(V)的内生菌。结果表明，内生细菌菌株对砷的耐受性中等偏低，不如根际细菌。这与先前报道一致，表明根际细菌由于与外部环境直接相互作用，比内生菌对环境胁迫更具韧性。

【数据】根际菌株数：约500株；耐受浓度：500 μg mL⁻¹ As(III)、2500 μg mL⁻¹ As(V)；内生菌株数：263株；耐受浓度：25 μg mL⁻¹ As(III)、50 μg mL⁻¹ As(V)

#### 3.2.1 不同砷生物转化特性的分类

基于硝酸银测定的菌株表征显示，根际样品中可能含有还原菌（238株）、氧化菌（97株）和甲基转移酶菌（40株）。然而，内生菌中氧化菌（30株）占优势，超过甲基转移酶菌（18株）和还原菌（10株）。同样，先前报道也表明根际土壤中还原菌（17株）和氧化菌（16株）比含甲基转移酶的细菌（4株）更丰富。

根际中还原菌的较高丰度可能将As(V)转化为As(III)，以便通过水通道蛋白被植物吸收。有毒的As(III)进一步被普遍存在的内生氧化菌转化为毒性较低的As(V)，以降低其在植物体内的毒性。先前的研究已报道根、根际和内生微生物群落在植物-土壤系统中砷的生物可利用性和生物转化中的相互作用。

选定菌株进一步确认了arsC、aioA和arsM基因的存在。结果显示，arsC（约350 bp）存在于三株根际菌（GA1.1、DA5.1、RC5.2）和内生菌（LK 12S.1、LK 23R.3、LK3S.2）中。aioA基因（约500 bp）在三株根际菌（LK35.1、LK22.3、LK26.2）中扩增成功，而只有两株内生菌（LK15R.3、LK4R.1）显示扩增。arsM（约350 bp）存在于六株根际来源的细菌菌株（LK18.3、Bh2.4、Bh1.16、LK10.2、LK22.2、LK26.3）中。

通过砷生物转化基因（ABGs）的基因特异性PCR扩增和16S rRNA基因测序鉴定表现最佳的菌株，结果显示选定的微生物群落以变形菌门为主，其次是厚壁菌门[图1(b)]。这一结果也与先前将变形菌门鉴定为砷污染地下水中优势门类的报道一致。

本研究中鉴定出的砷酸盐还原菌株——枯草芽孢杆菌、肠杆菌属、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和苍白杆菌属——与先前报道的含arsC菌株高度一致。本研究中首次报道了Citrococcus属和Priestia Flexa中存在aioA基因，尽管此前已有其砷抗性的报道。同样，Pseudochrobactrum、产碱菌属、鞘氨醇杆菌属和贝莱斯芽孢杆菌首次被鉴定为含甲基转移酶的细菌。鞘氨醇杆菌属已被报道对有机砷具有抗性。

【数据】根际：还原菌238株、氧化菌97株、甲基转移酶菌40株；内生菌：氧化菌30株、甲基转移酶菌18株、还原菌10株；arsC扩增：~350 bp；aioA扩增：~500 bp；arsM扩增：~350 bp

#### 3.2.2 硫醇类抗氧化化合物的产生

微生物产生半胱氨酸和谷胱甘肽等硫醇类化合物，用于涉及谷胱甘肽合成酶和谷胱甘肽还原酶的关键代谢功能。因此，对选定菌株的还原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）及半胱氨酸含量进行了表征（图2），同时测定了总酚类和总抗氧化能力（TAC）（图S2）。在含arsM的菌株中，GSH、GSSG和半胱氨酸的积累发现存在差异——

【数据】检测指标：GSH、GSSG、半胱氨酸、总酚类、TAC

3.3 菠菜砷胁迫的缓解与RC5.2的筛选

在温室条件下，将具有砷生物转化特性、PGP属性和硫醇类抗氧化剂产生能力的菌株接种到菠菜植株上，评估其在20 mg kg⁻¹ As(III)胁迫下的缓解潜力。结果显示，不同菌株对菠菜生长和砷含量的影响存在显著差异。其中，Pseudomonas putida NBRI-RC5.2表现出最佳的性能，可使菠菜叶片总砷含量降低约88%。

【数据】砷胁迫浓度：20 mg kg⁻¹ As(III)；RC5.2使菠菜叶片总砷降低：~88%

3.4 全基因组分析与代谢通路注释

对最佳菌株RC5.2进行了全基因组测序和组装。环形基因组图谱和KEGG注释的代谢通路架构如图5所示。基因组分析揭示了与砷抗性、植物促生和防御调控相关的基因。KEGG通路分析注释了包括吲哚乙酸（生长素）、海藻酸盐、谷胱甘肽和半胱氨酸生物合成在内的代谢途径。

【数据】基因组注释工具：PROKKA、AUGUSTUS；通路分析：KEGG

3.5 砷抗性基因表达分析

在砷胁迫条件下培养的RC5.2菌株中，arsR、arsB、arsA、arsK、arsJ、aqp、arsH和arsC基因的表达均出现上调。这些基因的上调表达验证了RC5.2的砷解毒潜力。基于基因组中推定的注释基因表达分析，推测了Pseudomonas putida NBRI-RC5.2中的砷解毒机制（图6）。

【数据】上调基因：arsR、arsB、arsA、arsK、arsJ、aqp、arsH、arsC

3.6 生物修复效率与砷解毒能力

生物修复测定显示，培养上清液中的砷逐步减少，而细菌沉淀中的砷积累增加，表明存在吸附/吸收和细胞内区室化隔离两种机制，且对As(V)的去除具有偏好性。

【数据】修复机制：吸附/吸收+细胞内区室化隔离；偏好性：As(V)去除优先

讨论与解读

本研究展示了细菌应对砷胁迫的多方面作用。微生物对砷污染区域的适应是遗传、生理和生化机制的复杂相互作用。Pseudomonas putida NBRI-RC5.2是最有效的菌株，也是首次被报道能减少叶菜类蔬菜菠菜中砷含量的菌株。基因组学见解揭示了RC5.2中各种砷抗性、植物促生和抗氧化相关基因的密切联系。RC5.2基因组中注释到的新基因集arsM和arsJ的出现，很可能是水平基因转移的结果。这些见解强调了砷影响的地下环境中细菌种群所经历的选择压力的重要性。生物修复测定证明培养上清液中的砷逐步减少，而细菌沉淀中砷积累增加，表明存在吸附/吸收和细胞内区室化隔离两种机制，且对As(V)去除具有偏好性。因此，RC5.2是开发靶向砷生物肥料的理想候选菌株。未来研究将集中于配方开发、田间试验以及不同环境条件下根际相互作用的理解。

编译者解读

本研究从"田间采样—菌株筛选—温室验证—基因组解析"的完整链条出发，将微生物功能性状与基因组信息有机结合，为砷污染农田的微生物修复提供了系统性方案。RC5.2兼具砷转化能力与植物促生特性，且能在菠菜中实现约88%的砷削减，具备较强的田间应用潜力。值得注意的是，基因组中发现的arsM和arsJ基因提示水平基因转移在砷抗性演化中的角色，这为理解环境微生物适应机制提供了新视角。后续研究若能将菌株配方与田间复杂条件结合验证，将更有力地推动其实际应用。

参考来源

Dharmesh V. Arsenic mitigation in spinach using Pseudomonas putida NBRI-RC5.2: Integrating functional traits with genomic insights. Bioresource Technology Reports, 2026. DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102586

DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102586