来源：Engineering Pseudomonas putida for efficient aromatic conversion to bioproduct using high throughput screening in a bioreactor（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
恶臭假单胞菌KT2440是极具潜力的生物制造宿主，可利用包括对香豆酸在内的可再生碳源。本研究利用覆盖近全部4778个非必需基因的转座子突变体文库，在工业相关搅拌槽生物反应器条件下开展定量适应性分析，鉴定出33个在多种反应器格式中适应性提升的基因突变体，并重建了21株缺失菌株。其中ΔgacA菌株在生物反应器中适应性提高35倍，以对香豆酸为碳源时靛蓝素产量达4.5 g/L（0.29 g/g，为理论最大产率的23%），较野生型提升8倍。
研究背景
合成生物学有望生产众多传统化学合成难以制备的新分子。然而，工业化规模的经济生物生产依赖于多项参数优化，包括反应器条件下的生长表现、产物滴度/速率/产率（TRY）的提升，以及对可再生碳源衍生碳流的充分利用。尽管许多新分子能在实验室规模实现生产，但工业规模（20,000 L–2,000,000 L）经济可行菌株的开发成本估计高达10亿美元。从经济学角度看，降低碳源成本是提升工艺可行性的最有效途径之一。使用木质纤维素生物质替代纯糖作为低成本原料，可使微生物工艺在商品化学品和生物燃料领域具备经济可行性。目前，糖类主要从纤维素和半纤维素中提取，而木质素组分的生物转化仍具挑战。木质素解聚可产生结构多样的芳香族化合物，每种均可作为碳源利用。
研究方法
2.1 化学试剂、培养基与培养条件
所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich（St. Louis, MO），除非另有说明。微量滴定板培养时，用透气膜（Breathe-easy Sealing membrane, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）密封板孔。蛋白胨和酵母提取物购自BD Biosciences（Franklin Lakes, NJ）。RB-TnSeq突变体分析使用标准M9基本培养基（1 g/L NH₄Cl，3 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L NaCl，12.8 g/L Na₂HPO₄·7H₂O，2 mM MgSO₄，0.1 mM CaCl₂），添加1%（w/v）葡萄糖。靛蓝素生产实验中，工程菌株在改良M9基本培养基中培养，添加10 g/L对香豆酸，200 rpm、30°C振荡培养。改良M9基本培养基含2 g/L (NH₄)₂SO₄、6.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂及1×微量元素溶液（Catalog Num. T1001, Teknova Inc, Hollister CA），并按需添加碳源。恶臭假单胞菌的LB过夜培养物从单菌落接种至5 mL改良M9基本培养基中适应生长。经过三轮连续适应后，以起始OD₆₀₀为0.1接种用于靛蓝素生产。所有实验设三次重复，并在不同生产规模下进行。2 mL培养物在24孔深孔板（Axygen Scientific, Union City, CA）中培养，线性振荡999 rpm、70%湿度；60 mL培养物在250 mL无挡板锥形瓶中培养，轨道振荡200 rpm。
【数据】培养基：M9基本培养基/改良M9基本培养基；温度：30°C；振荡：200 rpm（锥形瓶）/999 rpm（深孔板）；起始OD₆₀₀：0.1；对香豆酸浓度：10 g/L；葡萄糖浓度：1%（w/v）
2.2 微生物菌株与缺失突变体构建
本研究使用恶臭假单胞菌KT2440。基因组缺失突变体设计为去除从起始密码子到终止密码子对应的蛋白质编码区DNA序列。等位交换质粒以pEX18GM或pK18mobsacB为骨架构建，通过大肠杆菌S17-1接合转移导入恶臭假单胞菌。缺失突变体将开放阅读框替换为DNA条形码——一个独特的10 bp序列，两侧各连接约180 bp来源于酿酒酵母SMC1基因的DNA序列。该侧翼序列在所有缺失质粒中共享，可用通用引物组简化突变体追踪。本研究中鉴定为生长必需基因的条目与已发表的基因必需性数据交叉比对。缺失质粒及其对应条形码序列，以及本研究所用菌株，列于补充表7中，发表后可从public-registry.jbei.org获取。
【数据】条形码长度：10 bp；侧翼序列来源：酿酒酵母SMC1基因；侧翼序列长度：约180 bp；菌株：P. putida KT2440
2.3 高级微型生物反应器方法：250 mL ambr® 250生物反应器培养
补料分批生物反应器实验使用12通道ambr® 250生物反应器系统，配备250 mL一次性微生物反应容器。容器初始装入150 mL改良M9基本培养基，含8.2 g/L对香豆酸作为碳源。整个发酵过程中温度维持在30°C，搅拌速度恒定设为1300 rpm。气流基于初始工作体积恒定设为0.5 VVM，pH用4 N NaOH维持在7.0。反应器手动接种5 mL预培养细胞悬液，起始OD₆₀₀约0.1。初始分批培养12小时后，以浓缩补料溶液（86 g/L对香豆酸、120 g/L硫酸铵、20 mM阿拉伯糖）进行补料，每2小时补料一次，恢复对香豆酸浓度至8.2 g/L（补料参数：3.1分钟，50 mL/h）。每天取样1–2次（2 mL），样品保存于−20°C。ambr® 250运行软件和集成液体处理系统执行所有工艺步骤。
【数据】反应器体积：250 mL；初始装液量：150 mL；对香豆酸浓度：8.2 g/L（初始）/86 g/L（补料）；温度：30°C；搅拌：1300 rpm；通气：0.5 VVM；pH：7.0（4 N NaOH维持）；起始OD₆₀₀：约0.1；分批时间：12 h；补料周期：每2 h；补料流速：50 mL/h（3.1 min）；硫酸铵浓度：120 g/L；阿拉伯糖浓度：20 mM
2.4 不同生物反应器条件下的RB-TnSeq适应性实验
RB-TnSeq适应性分析按此前报道方法进行。简言之，将冻存的恶臭假单胞菌KT2440混合转座子文库从500 μL甘油储备液中解冻，接种至25 mL LB培养基。按2.1节所述在M9基本培养基中适应生长。种子培养物在48 h和72 h取样（样品编号1至6）。每个生物反应器以起始光密度OD₆₀₀约0.2接种。使用配备Sartorius BIOSTAT B®发酵控制器的2 L生物反应器，安装两个Rushton搅拌叶轮，搅拌速度固定为800 rpm。温度恒定维持30°C。反应器pH使用Hamilton EasyFerm Plus PHI VP 225 Pt100电极监测，用10 M氢氧化钠维持在pH 7。溶解氧浓度使用Hamilton VisiFerm DO ECS 225 H0监测。初始反应器体积为1 L M9基本培养基，另加50 mL相同培养基的过夜预培养物。溶解氧（DO）分别在相应反应器中维持10% DO（样品编号7至11）或30% DO（样品编号12至14）。补料分批实验（样品编号15和16）中，补料溶液含100 g/L葡萄糖和300 mM氯化铵。补料速率设为5.04 g/L/hr葡萄糖和3 mM NH₄Cl，目标DO（溶解氧）分别为10%或30%。RB-TnSeq分析样品通过收集1 mL样品并离心收集细胞沉淀获得。每个实验所用参数的完整描述参见补充表1。根据需要，向反应器注入1 mL消泡剂B（Sigma Aldrich）以控制过量泡沫。若RB-TnSeq数据分析流程中条形码多样性未通过质控步骤，相应生物反应器运行数据将被排除。基因组DNA提取、文库构建和Illumina测序条形码定量均按此前描述方法进行。本工作所述适应性数据将在发表后于http://fit.genomics.lbl.gov公开。为评估每个适应性值的统计显著性，使用t-like检验统计量（t分数），形式为fitness/sqrt（估计方差）。基因突变体在实验中若适应性值>1.5、t>2，则视为具有增强适应性表型；若适应性值<−2、t<−2（且|fitness|>95百分位数(|fitness|)+0.5），则视为具有适应性缺陷。层次聚类热图使用Python库Seaborn 0.11.1，采用平均连接法和欧氏距离度量生成。
【数据】接种OD₆₀₀：约0.2；反应器体积：2 L；搅拌：800 rpm（两个Rushton搅拌叶轮）；温度：30°C；pH：7.0（10 M NaOH）；DO条件：10%或30%；补料溶液：100 g/L葡萄糖+300 mM NH₄Cl；补料速率：5.04 g/L/hr葡萄糖+3 mM NH₄Cl；消泡剂用量：1 mL；样品体积：1 mL；适应性阈值：>1.5（增强）/ <−2（缺陷）；t值阈值：>2或<−2
2.5 基于约束建模选择编码代谢功能的缺失菌株
恶臭假单胞菌KT2440基因组规模代谢模型（GSM）iJN1462经修改以纳入靛蓝素生物合成。以葡萄糖或对香豆酸（pCA）作为唯一碳源模拟好氧生长。ATP维持需求保持不变（0.97 mmol/gDW/h），葡萄糖摄取速率和对香豆酸摄取速率分别设为6.3 mmol/gDW/h和4.04 mmol/gDW/h。通量平衡分析（FBA）用于从反应化学计量和氧化还原平衡计算最大理论产率（MTY），也用于单基因缺失分析。代谢调整最小化（MOMA）分析用于预测与野生型相比代谢通量分布扰动最小的单基因缺失。通量可变性分析（FVA）用于检查每个基因缺失的靛蓝素最小和最大通量。
【数据】模型：iJN1462；ATP维持需求：0.97 mmol/gDW/h；葡萄糖摄取速率：6.3 mmol/gDW/h；pCA摄取速率：4.04 mmol/gDW/h
研究结果
3.1 利用功能基因组学揭示生物反应器多种工艺参数下生长的核心细胞特征
我们设计了一套实验方案，以鉴定在与工业培养相关的条件下适应性发生变化的恶臭假单胞菌突变体。与实验室规模实验不同，微生物生物制造过程在搅拌桨混合的夹套罐中实施，在特定过程中向微生物培养物添加气体（如空气、氧气）和营养物质（糖类、氮源）。利用恶臭假单胞菌KT2440的混合条形码转座子突变体文库，我们能够通过定量适应性分析快速评估约100,000个独特转座子突变体，覆盖几乎所有（约4800个）非必需基因突变体。这些混合突变体培养物在生物反应器中生长（图1A），条件如表1所述，以表征不同时间点和工艺条件下的差异性适应性变化。定量分析条形码丰度变化可在RB-TnSeq工作流程中快速鉴定特定突变体及其相应适应性值。在恶臭假单胞菌中，该方法已用于预测碳分解代谢途径和表征生长抑制剂。将搅拌槽条件下的适应性值与实验室规模实验进行比较，可鉴定在不同格式和工艺条件下适应性发生变化的突变体，以区别于那些在所有条件下均影响菌株适应性的突变。对每个样品，我们计算了对应文库中全部4778个基因的单转座子突变体的适应性和相应t分数。每个时间点的适应性值计算为取样时间点群体丰度与实验开始时初始突变体丰度之比的对数（log2）。t分数评估适应性值与零的差异可靠性。在大多数条件下，大多数基因突变体没有可测量的差异性适应性值，因此其适应性值和t分数接近0。在全基因组分析中，我们选择了强且统计显著的适应性决定因素，要求适应性值必须>1.5或<−2，且t分数绝对值>2。五个代表性实验的突变体适应性值及其对应t分数的火山图见图1B。我们的高通量筛选方法同时鉴定出适应性提升（第3.2节）和适应性缺陷的突变体。虽然我们对前者感兴趣，但分析适应性降低的突变体对于全面表征条件必需性同样重要。从该数据集中，我们鉴定出35个在所述条件下表现出生长缺陷的恶臭假单胞菌转座子突变体（图1C）。对适应性降低（<−2）突变体的层次聚类表明，大多数补料葡萄糖的生物反应器样品与摇瓶格式中补料葡萄糖的样品相似，但补料pCA时细胞反应不同。对于表1所列条件，适应性降低的突变体属于甲硫氨酸、色氨酸和组氨酸生物合成途径相关基因。其他多步氨基酸生物合成途径（亮氨酸、精氨酸和天冬氨酸）也鉴定出适应性降低，但这些途径中仅1–2个突变体。预测参与硫中继和硫胺素生物合成（PP_0261、PP_1233、PP_5104）或金属离子稳态（PP_3506、PP_0910）的途径也被认为是在生物反应器条件下稳健生长所必需。我们注意到，这些单基因失活并不会导致氨基酸或营养缺陷型，因为这些突变体仍能在M9基本培养基中生长。对这些突变体进行聚类时，两个额外未表征基因（PP_1109、PP_1111）的突变体也出现在该组中，提示它们具有相关功能。19个突变体仅在pCA生长条件下出现。这些包括编码转录调节因子或芳香族化合物分解代谢相关途径代谢功能的基因。将Price等人2019年数据集的pCA适应性谱数据纳入分析，也加强了其他编码代谢功能基因的统计显著适应性缺陷证据，包括PP_5095/proI（参与脯氨酸生物合成）、PP_0356/glcB（苹果酸合酶）、PP_4700/panC（泛酸合酶）和PP_4799（推定胞壁酰四肽羧肽酶）。多个调控系统也被认为参与了新型生物反应器应激反应。缺失σ38应激反应sigma因子（PP_1623/rpoS）或持家sigma因子σ70家族基因（PP_4208）均显著降低生物反应器适应性。与只有一个已知sigma 70反应因子的大肠杆菌不同，恶臭假单胞菌有19个开放阅读框编码σ70家族蛋白结构域，提示通过复制实现功能冗余。其他恶臭假单胞菌RB-TnSeq数据集未显示任一sigma因子缺失导致适应性缺陷，提示生物反应器中的适应性增强由σ38和σ70家族转录调控共同促进，且其调控网络并非冗余。此外，四个环境/营养可利用性感知双组分信号系统也对生物反应器适应性有贡献：氮胁迫传感器（PP_2388-PP_2390）；参与氯霉素抗性的传感器（PP_0185）；参与脂质A重塑的传感器（PP_2348）；以及一个对基本培养基生长适应重要的双组分系统（PP_4505-PP_2714）。激活其余两个双组分信号系统的具体搅拌槽参数尚未鉴定。其他降低生物反应器适应性的突变体包括PP_5303/ridA（活性氧响应伴侣蛋白）和PP_0735/moeB（腺苷酰转移酶，腺苷酰化钼蝶呤合酶）的突变。最后，四个其他基因的突变因与已表征基因同源性低或与已知过程相关性弱而无法注释功能。由于高通量分析的混合性质，利用可被群体中其他突变体分泌的代谢物互补的基因途径破坏在该分析中无法检测。此外，破坏多顺反子mRNA的转座子插入有时会产生极性效应，这是该高通量方法的缺点。尽管如此，我们的负适应性突变体鉴定了在考虑基因组规模方法进行宿主优化时应避免失活的重要基因。
【数据】突变体库规模：约100,000个转座子突变体；覆盖基因数：约4800个非必需基因；适应性增强阈值：>1.5；适应性缺陷阈值：<−2；t分数阈值：|t|>2；生长缺陷突变体数：35个；pCA特异突变体数：19个；σ因子编码基因：PP_1623/rpoS（σ38）、PP_4208（σ70家族）
3.2 生物反应器适应性提升的基因突变体
微生物并非为搅拌槽生物反应器等环境而进化；内源细胞活性与培养环境之间的不匹配可导致生长效率低下。我们推测，RB-TnSeq数据集中适应性值提升的突变体更适合工业培养参数。对所有生物反应器中正适应性突变体与pCA和摇瓶条件的层次聚类表明，生物反应器中的适应性特征不同于使用芳香族碳源或葡萄糖的标准实验室格式（图2A）。我们鉴定了18个基因的转座子突变体，它们在生物反应器中始终表现出定量适应性提升（图2A）。此外，突变体……
【数据】适应性提升基因数：18个；聚类方法：平均连接法+欧氏距离
3.3 条形码缺失菌株靛蓝素生产评估
我们重建了RB-TnSeq高通量分析中鉴定出的目标缺失突变体，并在不同规模下评估了其以对香豆酸为碳源生产靛蓝素的能力（图3A）。靛蓝素是一种蓝色素，具有作为可持续纺织染料和生物光电材料的应用潜力。在分批模式下，以对香豆酸为碳源，ΔgacA菌株的靛蓝素产量较野生型提升8倍，达到4.5 g/L（0.29 g/g，为理论最大产率的23%）（图3B）。以葡萄糖为碳源时，ΔgacA菌株的靛蓝素产量也有提升（图3C）。ΔttgB和ΔPP_0063菌株的靛蓝素产量与野生型相比也有不同程度提升。
【数据】靛蓝素产量：4.5 g/L（ΔgacA，pCA碳源）；产率：0.29 g/g；理论最大产率：23%；产量提升：8倍；碳源：对香豆酸/葡萄糖
3.4 恶臭假单胞菌GacS-GacA信号系统与大肠杆菌BarA-UvrY同源物的功能差异
对不同假单胞菌和大肠杆菌中GacS-GacA突变体的共适应性值进行了荟萃分析（图4A）。数据显示，恶臭假单胞菌中GacS-GacA系统对生物反应器适应性的贡献与其在大肠杆菌中的同源系统BarA-UvrY存在显著差异。这种差异可能反映了不同物种中该全局调控系统在碳源利用和应激响应方面的功能分化。
【数据】分析数据集：P. putida、P. stutzeri、E. coli的RB-TnSeq碳源数据
讨论与解读
本研究在基因组水平上描述了放大培养条件下独特的适应性景观，揭示了从代谢到调控等多个细胞过程与大规模培养生长之间的非显而易见联系。我们描述了一套从高通量结果中筛选突变菌株并在中等通量搅拌槽格式（如ambr250®生物反应器系统）中验证的工作流程，并提供了一株可直接用于反应器的菌株，可将木质素来源的芳香族化合物高效转化为高价值可持续色素靛蓝素，实现高滴度、高速率和高产率。由于测序技术相对可及，更大规模的突变体搜索空间也可被探索。例如，使用双突变或三突变RB-TnSeq文库，或使用天然或异源基因文库的过表达库，从泛基因组组装中挖掘新基因候选。这些系统生物学方法有望显著推进恶臭假单胞菌的工程改造，以满足未来生物经济对生物工艺参数的需求。
编译者解读
本研究展示了将高通量功能基因组学（RB-TnSeq）与规模化验证相结合的策略价值——从约10万突变体中快速锁定目标基因，再通过中试规模反应器确认表型，大幅缩短了菌株开发周期。ΔgacA突变体同时提升适应性和产物合成效率的结果，揭示了全局调控因子改造在生物制造中的潜力。值得注意的是，研究以木质素来源的芳香族化合物（对香豆酸）为碳源，直接面向可再生原料利用的产业化需求。局限在于，部分基因功能注释仍不完整，且混合培养中代谢物互补效应可能掩盖某些基因的功能，后续可结合更多组学方法和单菌验证加以完善。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2021
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.04.015
DOI: 10.1016/j.ymben.2021.04.015