来源：Production of bio-based adipic acid using a combination of engineered Pseudomonas putida strains（Sustainable Chemistry for the Environment）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
己二酸是尼龙-6,6合成的关键前体，全球年产量超260万吨，但传统硝酸氧化工艺释放强温室气体一氧化二氮。本研究利用两株工程化恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），将木质素衍生的芳香族化合物愈创木酚分两步转化为生物基己二酸——第一步好氧条件下将愈创木酚转化为粘康酸，第二步限氧高密度转化粘康酸为己二酸，最终产量达2.93 mM，摩尔产率0.57。这是首次证明通过菌株工程与过程工程结合，可利用P. putida底盘实现从解聚木质素化合物到己二酸的完整生物基路线。
研究背景
己二酸是工业上重要的C6二羧酸，主要用于合成聚酰胺尼龙-6,6，全球年产量估计超过260万吨。当前己二酸生产基于硝酸氧化石油衍生的环己酮和环己醇，该过程向大气释放强温室气体一氧化二氮。由于传统生产的高环境影响，亟需开发从可再生原料合成己二酸的更环保方法。
目前仅有少数从可再生原料生物合成己二酸的报道。其中一例利用Thermobifida fusca B6——已知唯一具有天然葡萄糖合成己二酸途径的微生物。该途径称为逆向己二酸降解途径，需五个酶促步骤将乙酰-CoA和琥珀酰-CoA转化为己二酸，在天然宿主T. fusca中可从50 g/L葡萄糖生产2.23 g/L己二酸。然而，由于T. fusca缺乏遗传工程工具，Zhao等人将该途径组装到大肠杆菌中以提高滴度和产率，结合补料分批培养策略后，从甘油获得68 g/L己二酸。
研究方法
2.1 化学试剂
分析级化学试剂购自Sigma Aldrich（St. Louis, MO）。
2.2 菌株与培养条件
P. putida KT2440和E. coli NEB5α常规培养于LB培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中，培养温度分别为30°C和37°C。菌株保存在−80°C、25%（v/v）甘油中。工程化P. putida菌株培养于M9培养基（12.8 g/L Na₂HPO₄、3 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L NaCl、1 g/L NH₄Cl、2 mM MgSO₄、0.1 mM CaCl₂）中，添加1%（v/v）微量元素溶液（500 mg/L EDTA二钠二水合物、200 mg/L FeSO₄·7H₂O、10 mg/L ZnSO₄·7H₂O、3 mg/L MnCl₂·4H₂O、30 mg/L H₃BO₃、20 mg/L CoCl₂·6H₂O、1 mg/L CuCl₂·2H₂O或CuSO₄·5H₂O、2 mg/L NiCl₂·6H₂O、3 mg/L Na₂MoO₄·2H₂O）以及葡萄糖（10 g/L（55 mM））和粘康酸（3.8 mM）或愈创木酚（5 mM）。添加链霉素（100 µg/mL）维持质粒，添加IPTG（1 mM）诱导lacIq/ptrc表达系统。本研究所用和构建的菌株与质粒分别列于表2和表3。
【数据】培养基：LB/M9；温度：30°C（P. putida）/37°C（E. coli）；葡萄糖：10 g/L（55 mM）；粘康酸：3.8 mM；愈创木酚：5 mM；链霉素：100 µg/mL；IPTG：1 mM；微量元素：1%（v/v）；甘油保存：25%（v/v）
2.3 分子生物学与质粒构建
质粒构建采用标准分子克隆技术。使用GeneJet质粒小提试剂盒按制造商说明提取质粒（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）。克隆PCR反应使用Phusion High Fidelity聚合酶（Thermo Fisher Scientific）。诊断性菌落PCR使用DreamTaq聚合酶（Thermo Fisher Scientific）。寡核苷酸由Eurofins genomics（Ebersberg, Germany）合成，合成基因由Genscript（Leiden, Netherlands）合成。所有构建的质粒经Eurofins genomics（Ebersberg, Germany）进行的Sanger测序验证。
pFL025的构建：PCR扩增密码子优化的合成BcER基因（序列见表S1），正向引物突出端含核糖体结合位点（RBS），用SacI和HindIII酶切后连接至pSEVA424载体。
pFL027的构建：从pSEVA424_P450Rrh_FrdRrh PCR扩增细胞色素P450和铁氧还蛋白还原酶基因，用SacI和HindIII酶切片段，连接至已用p14g启动子替换原lacIq/ptrc启动子的pSEVA424载体中。
pFL036的构建：首先在pSEVA424载体的多克隆位点内插入第二个终止子（T0）。然后，将BcER基因用SacI和KpnI酶切后插入含两个终止子的新载体。最后，从pFL027 PCR扩增含p14g启动子的细胞色素P450和铁氧还蛋白还原酶基因片段，用BamHI和HindIII酶切后连接至含BcER和两个终止子的载体中。
【数据】限制性内切酶：SacI、HindIII、KpnI、BamHI；载体：pSEVA424；启动子：lacIq/ptrc、p14g；测序验证：Sanger测序
2.4 菌株构建
P. putida采用电转化法转化，方法如前所述。简要步骤：取8 mL P. putida过夜培养物接种至250 mL带挡板摇瓶中的20 mL新鲜LB中，培养至OD约0.8。细胞用冰浴300 mM蔗糖洗涤数次，逐步将体积减少至500 µL。然后将细胞分装为100 µL等分试样，每份加入200 ng质粒。每份转移至电转杯（0.2 cm间隙）。使用Bio-Rad Genepulser（Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, USA）进行电穿孔，设置2.5 kV、200 Ω和25 µFD。细胞在LB中恢复1小时后涂布于LB链霉素平板。阳性克隆经菌落PCR验证。化学感受态E. coli NEB5α按Inoue方案制备和转化。
【数据】电转化参数：2.5 kV，200 Ω，25 µFD；质粒量：200 ng；蔗糖浓度：300 mM；恢复时间：1 h；OD：约0.8
2.5 粘康酸高细胞密度生物转化为己二酸
TMBFL024从甘油储备液在补充100 µg/mL链霉素的LB平板上过夜复苏。挑取单菌落接种至25 mL M9预培养物中，补充葡萄糖（10 g/L（55 mM））、微量元素溶液（1%（v/v））和链霉素（100 µg/mL）。预培养物在30°C、振荡（180 rpm）下培养24 h。将预培养物稀释10倍至500 mL带挡板摇瓶中的250 mL新鲜M9葡萄糖培养基中，再培养24 h。24 h后，通过离心（15 min，3220 × g）收集全部培养物，重悬于10 mL补充葡萄糖（10 g/L（55 mM））和粘康酸（3.8 mM）的M9培养基中，转移至带磁力搅拌器的小血清瓶中。加入链霉素（100 µg/mL）和IPTG（1 mM），将瓶置于30°C水浴中，磁力搅拌450 rpm。生物转化运行48 h。在0、24和48 h取样进行OD和HPLC分析。
【数据】离心：15 min，3220 × g；预培养：24 h，30°C，180 rpm；稀释倍数：10倍；生物转化：48 h，30°C，450 rpm；OD：约100；粘康酸：3.8 mM；葡萄糖：10 g/L（55 mM）
2.6 愈创木酚高细胞密度生物转化为粘康酸和/或己二酸
TMBFL028从甘油储备液在补充链霉素的LB平板上过夜复苏。挑取单菌落接种至10 mL M9预培养物中，补充葡萄糖（10 g/L（55 mM））、微量元素溶液（1%（v/v））和链霉素（100 µg/mL）。预培养物在30°C、振荡（180 rpm）下培养24 h。将预培养物接种至25 mL补充葡萄糖（10 g/L（55 mM））、微量元素溶液（1%（v/v））、愈创木酚（5 mM）和链霉素（100 µg/mL）的M9培养基中，初始OD为0.3，置于250 mL带挡板摇瓶中。生物转化至粘康酸在30°C、振荡（180 rpm）下运行24 h，在0和24 h取样。
为进一步转化己二酸，通过离心（15 min，3220 × g）弃去细胞，上清液转移至无菌50 mL falcon管中。向上清液中加入M9盐、葡萄糖（10 g/L（55 mM））和微量元素（1%（v/v）），然后用按前述方法制备的TMBFL024细胞以高细胞密度接种。加入链霉素和IPTG启动生物转化，在密封血清瓶中于30°C、磁力搅拌450 rpm下运行48 h，在0、24和48 h取样。
【数据】预培养：24 h，30°C，180 rpm；初始OD：0.3；愈创木酚：5 mM；第一步转化：24 h，30°C，180 rpm；第二步转化：48 h，30°C，450 rpm；离心：15 min，3220 × g
2.7 分析方法
己二酸浓度使用Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱测定，流动相为5 mM H₂SO₄。柱温60°C，流速0.6 mL/min。检测使用折光指数和UV/Vis检测器（210 nm）。通过分析0.05至5 g/L已知浓度己二酸制作标准曲线。
粘康酸和愈创木酚使用配备C-18色谱柱和PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统定量。采用含H₂O（A）、乙腈（B）和0.1 M甲酸（C）的梯度方法。分析物在280 nm波长检测。通过分析0.05至3 mM已知浓度制作粘康酸和愈创木酚标准曲线。
【数据】HPLC柱温：60°C；流速：0.6 mL/min；检测波长：210 nm（己二酸）/280 nm（粘康酸、愈创木酚）；己二酸标准曲线范围：0.05–5 g/L；粘康酸/愈创木酚标准曲线范围：0.05–3 mM
研究结果
3.1 工程化*P. putida*将粘康酸生物转化为己二酸
木质素衍生芳香族化合物的生物基己二酸生产依赖于粘康酸到己二酸的高效氢化。为完成此步骤，将Bacillus coagulans的烯酸还原酶——该酶已被报道可催化粘康酸转化为己二酸——在P. putida中以多拷贝质粒、lacIq/ptrc表达系统表达，该系统允许强诱导型表达。质粒被导入已敲除catBC基因的P. putida菌株中，阻止粘康酸的进一步转化。所得菌株命名为TMBFL024。
通过高细胞密度生物转化实验考察了构建菌株TMBFL024的烯酸还原酶活性。由于烯酸还原酶对氧气敏感，过程中限制通气。因此，该设置无法使用生长细胞——P. putida是专性需氧菌。转而采用高细胞密度（OD约100）在M9培养基中进行生物转化，使用预生长在限氧条件下的TMBFL024细胞，置于密封血清瓶中，顶部空间10%。过量添加葡萄糖以通过葡萄糖分解代谢再生烯酸还原酶活性所需的NAD(P)H（见图1）。
48小时后，粘康酸以0.84 ± 0.06（mM/mM）的产率转化为己二酸，最终滴度达2.43 ± 0.06 mM（图2）。相比之下，携带空载体的对照菌株未形成己二酸（图2）。两种菌株的葡萄糖消耗相似，为20–30%（图S3）。这些结果表明，尽管B. coagulans烯酸还原酶对氧敏感，但可以在限通气条件下在P. putida中产生有活性的酶。
【数据】粘康酸转化产率：0.84 ± 0.06（mM/mM）；己二酸滴度：2.43 ± 0.06 mM；OD：约100；时间：48 h；葡萄糖消耗：20–30%；对照菌株己二酸产量：0
3.2 愈创木酚一锅法生物转化己二酸
确认P. putida中的烯酸还原酶活性后，下一步是测试从愈创木酚生产己二酸——愈创木酚是Kraft木质素氧化解聚获得的主要芳香族化合物。作者此前已证明，通过表达来自Rhodococcus rhodochrous的异源愈创木酚脱甲基酶系统（由细胞色素P450和铁氧还蛋白还原酶组成），愈创木酚可通过儿茶酚转化为粘康酸。
在本研究中，该系统与烯酸还原酶组合于单一菌株中，测试愈创木酚到己二酸的转化。在一个多拷贝质粒上，愈创木酚脱甲基酶基因在强组成型启动子p14g控制下表达，烯酸还原酶基因在强诱导型启动子系统lacIq/ptrc控制下表达（同TMBFL024）。该质粒被导入P. putida ΔcatBC中，产生菌株TMBFL040。然而，在限氧条件下测试时，72 h后无愈创木酚被消耗，也未形成粘康酸或己二酸（图S2）。结果表明，有限的氧合水平限制了愈创木酚的转化——从愈创木酚到儿茶酚以及从儿茶酚到顺,顺-粘康酸的步骤需要分子氧（图1）。
【数据】时间：72 h；愈创木酚消耗：0；粘康酸产量：0；己二酸产量：0
3.3 愈创木酚两步法生物转化己二酸
愈创木酚与粘康酸转化对氧需求的差异促使开发了替代的两步策略：将途径拆分至两个独立菌株，在不同通气条件下使用——第一步菌株在好氧条件下将愈创木酚转化为粘康酸；然后，富含粘康酸培养液在第二步中用于高细胞密度生物转化，在限氧条件下使用仅表达烯酸还原酶基因的第二菌株生产己二酸（图3A）。
过程第一步，来自R. rhodochrous的愈创木酚脱甲基酶系统在组成型启动子p14g控制下于多拷贝质粒上表达，导入P. putida ΔcatBC中，产生菌株TMBFL028。该菌株用于在摇瓶培养中将5 mM愈创木酚转化为粘康酸。与粘康酸生物转化一样，过量添加葡萄糖以供应NAD(P)H——愈创木酚脱甲基酶系统的活性也需要NAD(P)H（图1）。24 h后，愈创木酚以100%的产率转化为粘康酸（图3B），而葡萄糖被完全消耗（图S3），与作者此前在类似菌株（相同系统受IPTG诱导）上的结果一致。
过程第二步，将含5 mM愈创木酚来源粘康酸的步骤1培养液补充M9培养基组分，用限氧条件下生长的烯酸还原酶生产菌株TMBFL024细胞以高OD接种，在密封血清瓶中于30°C孵育48 h。48 h后，培养液中大部分粘康酸成功转化为己二酸，产率0.81 ± 0.05（mM/mM），最终滴度达2.93 ± 0.18 mM（图3C）。约30%添加的葡萄糖被消耗（图S3），与另一次限氧生物转化中观察到的消耗相似（第3.1节）。总体而言，该两步法中己二酸对愈创木酚的产率估计为0.57 ± 0.05（mM/mM）。
【数据】第一步：愈创木酚5 mM，24 h，产率100%，葡萄糖完全消耗；第二步：粘康酸5 mM，48 h，30°C，产率0.81 ± 0.05（mM/mM），己二酸滴度2.93 ± 0.18 mM；葡萄糖消耗：约30%；总产率：0.57 ± 0.05（mM/mM）
讨论与解读
本研究证明，使用重组P. putida菌株作为唯一催化剂，可从愈创木酚——Kraft木质素氧化解聚获得的主要芳香族化合物——生产生物基己二酸。通过在不同通气条件下依次使用两种不同的P. putida菌株，实现了超过57%的转化产率，凸显了所选生物基己二酸生产路线的效率。
在该好氧P. putida宿主中建立此生产路线的主要挑战是所有已知烯酸还原酶对氧的敏感性。尽管如此，P. putida仍是木质素到生物产品平台的优选宿主，原因包括：细胞生长快速且无副产物形成；稳健性强、耐应激；代谢途径多样，包含多种芳香族化合物的分解代谢途径；遗传可操作性强，遗传工程工具成熟。此外，即使使用可厌氧生长的其他生物（如E. coli），愈创木酚生物转化过程仍需要氧气，因为从芳香族化合物生产粘康酸依赖于脱甲基酶和开环酶，两者均需分子氧。这解释了为何几乎所有已报道的芳香族化合物好氧转化己二酸（经粘康酸）的研究都采用最终化学氢化步骤从粘康酸到己二酸。
编译者解读
本研究的技术亮点在于巧妙利用"氧需求差异"设计了两菌株分段工艺——好氧段完成需氧的脱甲基与开环反应，限氧段保护氧敏感的烯酸还原酶。这种"过程工程适配酶学特性"的思路值得借鉴。但需注意，目前产量仍处于毫摩尔级，距离工业化尚有距离；且两步法增加了操作复杂度。未来若能在单一菌株中实现氧梯度调控或筛选耐氧烯酸还原酶突变体，将显著提升该路线的经济性。从合成生物学应用角度看，该工作为木质素高值化提供了可扩展的范式。
参考来源
Lund F. Production of bio-based adipic acid using a combination of engineered Pseudomonas putida strains. Sustainable Chemistry for the Environment, 2024. DOI: 10.1016/j.scenv.2024.100154
DOI: 10.1016/j.scenv.2024.100154