来源：Lignin-derived compounds assisted with Kocuria marina H-2 and Pseudomonas putida B6-2 co-culture enhanced naphthalene biodegradation（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
多环芳烃（PAHs）是典型的持久性环境污染物，其中萘作为最简单的PAHs代表，其生物修复效率长期受限于疏水性导致的低生物可利用性。本研究构建了Kocuria marina H-2与Pseudomonas putida B6-2双菌共培养体系，通过响应面法优化降解条件后，进一步发现乙二胺预处理木质素（EDA-PL）与对羟基苯甲酸的联合添加可将萘降解率提升至68.5%。多组学分析揭示了木质素衍生化合物通过上调ABC转运蛋白、鞭毛组装、细菌趋化及脂肪酸生物合成相关基因来促进萘的生物转化机制。
研究背景
全球经济的快速发展推动了对煤炭、原油和天然气等不可再生资源的大规模开采利用，但石油烃及其衍生物的毒性对全球环境造成了显著污染。多环芳烃具有毒性、致畸性和致突变性，被美国环境保护署列为"优先污染物"。萘是PAHs中的典型代表，既来源于野火、火山喷发等自然事件，也来源于工业炼油、秸秆焚烧等人类活动，已在多种环境生态系统中被检出。
由于碳氢化合物溶解度低，PAHs的矿化与降解一直受到限制，导致修复效果不理想。为提升污染场地的修复效率，迫切需要开发环境友好且可持续的PAHs去除策略。物理、化学和生物修复方法虽已被广泛探索，但如何提高疏水性PAHs的生物可利用性仍是核心瓶颈。木质素作为自然界最丰富的芳香族生物聚合物，其衍生化合物可能具有表面活性剂特性，有望通过增强底物 bioavailability 来强化微生物降解过程。
研究方法
2.1 培养基与化学试剂
采用Luria-Bertani（LB）固体培养基进行菌株培养，其组成为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂15 g/L，pH调至7.0。LB液体培养基用于种子液制备，培养条件为30 °C、220 rpm。无机盐培养基和微量元素液用于萘降解菌的培养。无机盐培养基含(NH4)2SO4 1.0 g/L、NaCl 1.0 g/L、K2HPO4 1.0 g/L、KH2PO4 1.0 g/L、MgSO4 0.20 g/L、CaCl2 0.02 g/L、FeSO4 0.05 g/L，pH为7.0。微量元素液含FeCl3·6H2O 0.08 g/L、ZnSO4·H2O 0.75 g/L、CoCl2·6H2O 0.08 g/L、CuSO4·5H2O 0.075 g/L、MnSO4·H2O 0.75 g/L、NaMoO4·2H2O 0.05 g/L、H3BO3 0.15 g/L。萘储备液（10 g/L）通过将0.4 g萘溶解于40 mL正己烷中制备。LB培养基、无机盐培养基和微量元素各组分购自天津希恩思生化科技有限公司。乙二胺、乙醇、硫酸、氢氧化钠、鼠李糖脂、商用碱预处理木质素（c-APL）、木质素磺酸钙（CL）、萘、正己烷、十六烷、对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸均购自天津元立化工有限公司。N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺和吡啶购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
【数据】培养基：LB固体/液体、无机盐培养基；胰蛋白胨：10 g/L；酵母提取物：5 g/L；NaCl：10 g/L；琼脂：15 g/L；pH：7.0；培养温度：30°C；转速：220 rpm；(NH4)2SO4：1.0 g/L；MgSO4：0.20 g/L；CaCl2：0.02 g/L；FeSO4：0.05 g/L；萘储备液：10 g/L（0.4 g萘溶于40 mL正己烷）
2.2 菌株来源
为构建共培养体系，选取了数株能够断裂苯环的细菌，并表征其萘降解能力。这些菌株包括Bacillus odysseyi（DSM 18869）、Kocuria marina H-2（CICC 23948）、Kocuria rosea（CGMSS 1.15046）、Microbacterium sp.（CICC 10762）和Staphylococcus capitis（CICC 21722），均已知可降解PAHs。此外，本实验室保存了能够解聚木质素的Pseudomonas putida KT-2440、P. putida KT1.5、P. putida B6-2（ATCC BAA-2545）、P. putida ES-07和Serratia marcescens ES-10。另有Klebsiella aerogenes S0、P. knackmussii S6、Acinetobacter junii S15、P. chengduensis B-11和Novosphingobium barchaimii B-16被证实可降解多氯联苯。本研究所用P. putida KT1.5和P. putida B6-2由上海交通大学唐鸿志教授惠赠。P. putida KT-2440由南开大学杨超教授惠赠，多氯联苯降解菌株由天津大学贾晓强教授惠赠。
【数据】菌株：K. marina H-2（CICC 23948）、P. putida B6-2（ATCC BAA-2545）等；来源：上海交通大学、南开大学、天津大学
2.3 共培养体系的构建、表征与优化
菌株首先在LB固体培养基上于30 °C培养48 h。从各菌株挑取单菌落转接至40 mL LB液体培养基中进行种子液制备。当OD600达到1.0时，取2 mL种子液在4 °C、4000 rpm条件下离心5 min。所得菌体沉淀用2 mL蒸馏去离子水（ddH2O）重悬，随后接种于38 mL无机盐培养基中，并添加2 mL 10 g/L萘溶液和2 mL微量元素液。为去除正己烷，含正己烷的培养基在接种前于室温放置过夜。同时，监测未接种菌株的无机盐培养基中萘的残留浓度（每24 h），以评估萘的挥发性。在萘降解过程中，还测定了K. marina H-2和P. putida B6-2的相对丰度、pH、细胞表面疏水性和菌落形成单位。在表征各单菌的萘降解潜力后，选择特定菌株构建共培养体系。为提高共培养体系的萘降解效率，采用Box-Behnken响应面分析法（Design-Expert 8.0.6软件，Stat-Ease，美国明尼阿波利斯）对接种比例（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1）、温度（25、30、35、40、45 °C）和转速（160、180、200、220、240 rpm）等参数进行优化。
【数据】培养温度：30°C；培养时间：48h；OD600：1.0；离心：4°C、4000 rpm、5 min；萘溶液：10 g/L、2 mL；微量元素液：2 mL；接种比例：1:3–3:1；温度范围：25–45°C；转速范围：160–240 rpm
2.4 木质素的制备
收集自中国天津武清郊区的玉米秸秆作为木质素提取的底物。采用三种预处理方法：乙二胺预处理、碱预处理和有机溶剂预处理。乙二胺预处理在130 °C下进行60 min，固液比为1:9，所得木质素称为乙二胺预处理木质素（EDA-PL）。碱预处理在105 °C下进行30 min，固液比为1:0.9，所得木质素称为碱预处理木质素（APL）。有机溶剂预处理在130 °C下进行30 min，使用50%乙醇与2%硫酸混合，固液比为1:9，所得木质素称为有机溶剂预处理木质素（O-PL）。此外，对木质素制备参数（如温度和时间）进行了优化。
【数据】底物：玉米秸秆（天津武清）；EDA预处理：130°C、60 min、固液比1:9；碱预处理：105°C、30 min、固液比1:0.9；有机溶剂预处理：130°C、30 min、50%乙醇+2%硫酸、固液比1:9
2.5 木质素单体辅助共培养体系的萘生物转化表征
选取对羟基苯甲酸、阿魏酸和对香豆酸三种木质素单体作为萘生物降解的共底物进行研究。这些酸的添加浓度分别为50、100、250和500 mg/L。此外，对羟基苯甲酸还测试了5、10和25 mg/L的较低浓度。每24 h使用液相色谱（LC）测定这些酸的残留浓度。
【数据】木质素单体：对羟基苯甲酸、阿魏酸、对香豆酸；浓度：50、100、250、500 mg/L；对羟基苯甲酸低浓度：5、10、25 mg/L；检测间隔：24 h
2.6 萘浓度、表面张力及木质素单体含量的测定
萘浓度采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析，使用熔融石英毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径，0.25 μm DB-5MS，J&W Scientific，美国福尔松）。GC-MS参数如下：分流比50:1，接口温度270 °C，离子源温度230 °C，进样口温度260 °C。色谱柱初始温度40 °C保持5 min，以5 °C/min升至250 °C，并在250 °C保持20 min。萘生物降解率按式(1)计算。菌体生物量使用紫外-可见分光光度计（TU-1810，北京普析）在600 nm处测定，所有实验均设三次重复。
式(1)：萘生物降解率(%) = (NAP总含量 − NAP残留含量 − NAP挥发含量) / (NAP总含量 − NAP挥发含量)
其中NAP总含量、NAP挥发含量和NAP残留含量分别代表萘总含量（500 mg/L）、萘挥发含量和萘残留含量。油液界面表面张力使用界面张力仪（JYW-200A，上海宝环保科技）测定。绘制了表面活性剂添加浓度与表面张力之间的关系曲线。木质素单体含量采用LC定量，使用TSKgel GMPWxl色谱柱（30 cm × 7.8 mm，TOSOH，东京）配UV/Vis检测器。柱温设定为30 °C，流动相为含1%（v/v）甲酸的水和甲醇，流速为1 mL/min。
【数据】GC-MS柱：DB-5MS（30 m × 0.25 mm，0.25 μm）；分流比：50:1；接口温度：270°C；离子源温度：230°C；进样口温度：260°C；柱温程序：40°C保持5 min→5°C/min至250°C→保持20 min；萘总含量：500 mg/L；LC柱温：30°C；流速：1 mL/min
2.7 共培养菌株RNA提取与测序
使用共培养体系或木质素基化合物辅助共培养体系进行萘降解36 h后，收集菌株，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，然后在−80 °C液氮中冷冻。使用RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性，并用琼脂糖凝胶电泳检查RNA降解情况。使用特异性探针选择性去除核糖体RNA（rRNA），保留信使RNA（mRNA）。mRNA在高温条件下片段化。后续测序步骤原文未详述。
【数据】降解时间：36 h；洗涤：PBS两次；保存：−80°C液氮；RNA完整性：RNA Nano 6000试剂盒
研究结果
3.1 不同细菌对萘降解的影响
对多株能够生物转化苯类似物的细菌进行了环境废弃物管理评估，其中K. marina H-2表现出最高的萘降解率（25.5%）和OD600值。这表明萘降解与菌株丰度之间存在正相关。值得注意的是，P. putida B6-2的萘降解特征（降解率和OD600）与K. marina H-2相似。假单胞菌属含有多个与PAHs生物转化相关的基因簇，如pah、nah和dox。此外，A. junii S15在多氯联苯降解菌中表现出最高的萘生物降解水平。木质素降解菌和多氯联苯降解菌均显示出萘降解潜力，反映出参与碳氢化合物转化的微生物酶具有广泛的底物灵活性，能够处理结构相似的底物。
虽然单一菌株表现出一定的萘降解能力，但与更有潜力的生物降解菌相比效果较差。共培养体系在萘生物转化方面表现出显著改善（图1）。在共培养组合中，K. marina H-2与P. putida B6-2组合的萘降解率达到36.8%。该共培养体系还表现出优于所有其他菌株的生长能力。这些结果表明，共培养体系中多样化的微生物群落和碳代谢途径有助于其比单一细菌具有更高的PAHs生物降解潜力。P. putida B6-2与A. junii S15共培养的萘去除水平与K. marina H-2相似（图1）。萘生物降解过程受底物竞争和细菌适应性的影响，这可能影响K. marina H-2与A. junii S15共培养的碳氢化合物转化效率。
K. marina H-2与P. putida B6-2的共培养在24至48 h之间表现出显著的萘降解，这与这些菌株的生长模式一致。此外，当共培养体系用于萘降解时，24 h时K. marina H-2的相对丰度高于P. putida B6-2。随时间推移（24至72 h），P. putida B6-2的比例增加。这些结果表明，K. marina H-2在PAHs降解的初始阶段起关键作用，而萘的添加和氮的减少加速了P. putida B6-2的适应和繁殖。另外，在96 h的萘降解过程中，K. marina H-2与P. putida B6-2的比例保持相对稳定，表明菌株平衡有助于改善PAHs生物转化。
【数据】K. marina H-2单菌降解率：25.5%；K. marina H-2+P. putida B6-2共培养降解率：36.8%；显著降解时段：24–48 h；相对丰度变化时段：24–72 h；总降解时长：96 h
3.2 萘生物降解条件的优化
为提高萘去除效率，对共培养体系的生物降解条件进行了优化，包括温度（X1）、转速（X2）和菌株比例（X3）。建立了一个二次模型[式(2)]来表示萘生物降解率（Y）与这些因素的关系。进行了方差分析（ANOVA）以评估预测模型的显著性。结果如表1所示，F值（45.79）和p值（<0.0001）确认了模型的显著性。X1、X2和X3的p值均小于0.001，证明了这些参数在模型中的重要性。
式(2)：Y = +42.96 − 0.24X1 + 0.21X2 + 0.37X3 − 0.78X1X2 + 1.15X1X3 − 1.40X2X3 − 5.87X1² − 6.02X2² − 16.14X3²
在共培养体系保持1:1菌株比例的条件下，当温度从25升至35 °C、转速从160升至200 rpm/min时，萘生物降解率随之增加（图2a）。然而，超过35 °C和200 rpm/min后，共培养体系的碳氢化合物转化效率显著下降。这些结果表明，最佳生物降解条件为温度35 °C、转速200 rpm/min（图2）。在低于35 °C的温度下，菌株生长和酶活性最高。此外，充足的溶解氧水平可增强PAHs生物降解。
前人研究表明，共培养体系中接种比例与石油烃生物降解效率呈正相关。正如预期，调整细菌接种比例显著影响萘去除率，而温度或转速的变化对碳氢化合物转化的影响较小（图2c）。为减轻共培养体系中的底物竞争，在PAHs去除过程中平衡菌间相互作用至关重要。改变接种比例导致萘生物降解效率显著下降。当K. marina H-2与P. putida B6-2保持1:1比例时，碳氢化合物去除率提高至42.2%（图2d）。
【数据】模型F值：45.79；模型p值：<0.0001；X1、X2、X3的p值：均<0.001；最佳温度：35°C；最佳转速：200 rpm/min；最佳菌株比例：1:1；优化后降解率：42.2%
3.3 木质素添加对萘生物降解特性的影响
本研究考察了向萘生物降解体系中添加木质素后油液系统的表面张力变化。结果证实，预处理过程改变了木质素的性质（图3）。具体而言，生物质预处理过程中反应溶液中的离子或基团掺入木质素结构，可能赋予木质素表面活性剂特性。c-APL的添加增加了油液表面张力，表明其对碳氢化合物生物可利用性没有改善。相比之下，APL和O-PL的添加降低了油液表面张力，表明它们具有作为木质素基表面活性剂的潜力。碱预处理中的氢氧根离子攻击了木质素的酯键和醚键，暴露了APL的羟基，从而降低了油液表面张力（图3a）。
增加CL和EDA-PL的浓度进一步降低了油液的表面张力，在5 mg/L EDA-PL条件下观察到51.24 mN/m的表面张力值。EDA预处理增强了木质素的水溶性，促进了木质素基团与胺基之间的缩合反应。此外，随着鼠李糖脂的添加，油液表面张力逐渐降低，其趋势与EDA-PL相似。值得注意的是，预处理条件（如时间和温度）可显著影响木质素的性质。例如，在130 °C和60 min条件下获得的EDA-PL表现出优异的表面张力降低能力。在引入6.25 mg/L的木质素基表面活性剂或生物表面活性剂后，油液表面张力保持不变，后续实验将表面活性剂添加量调整至该水平（图3a）。
在共培养体系中加入EDA-PL和鼠李糖脂，使K. marina H-2和P. putida B6-2共培养的萘生物降解率分别显著提高至57.7%和55.6%（图3b）。不同木质素类型使萘生物降解体系的pH维持在7至8之间，为碳氢化合物转化创造了有利条件。相比之下，添加鼠李糖脂时pH值降至7以下，可能抑制了碳氢化合物的生物转化。生物降解菌与PAHs之间相互作用的有效性受细胞表面疏水性影响，Tween-80和鼠李糖脂的添加改善了PAHs的生物吸附。APL、EDA-PL和鼠李糖脂的添加增加了细胞表面疏水性和菌落形成单位。
【数据】EDA-PL 5 mg/L时表面张力：51.24 mN/m；表面活性剂添加阈值：6.25 mg/L；EDA-PL辅助降解率：57.7%；鼠李糖脂辅助降解率：55.6%；pH范围（木质素添加）：7–8；pH（鼠李糖脂添加）：<7
3.4 木质素衍生化合物辅助共培养体系的差异表达基因与代谢组学分析
通过火山图和功能注释分析了木质素衍生化合物辅助共培养体系（CC）中的差异表达基因（图4）。比较乙二胺预处理木质素（EDA-PL）辅助CC与CC的火山图显示，大量基因在添加EDA-PL后发生显著差异表达。进一步比较EDA-PL与对羟基苯甲酸辅助CC的转录组数据，鉴定出与细菌趋化、鞭毛组装、ABC转运蛋白和脂肪酸生物合成相关的基因显著上调。这些通路共同促进了萘的摄取、转运和生物转化。
KEGG通路注释和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）用于解析木质素衍生化合物辅助共培养体系的代谢特征（图5）。正负离子模式下的代谢物注释到KEGG数据库，揭示了添加木质素衍生化合物后代谢谱的显著变化。PLS-DA模型清楚地区分了不同处理组的代谢物谱，表明木质素衍生化合物的添加显著改变了共培养体系的代谢状态。
【数据】差异表达基因：与细菌趋化、鞭毛组装、ABC转运蛋白、脂肪酸生物合成相关；代谢组学：正负离子模式KEGG注释；PLS-DA：不同处理组显著分离
3.5 木质素衍生化合物辅助共培养体系的萘生物转化机制
图6展示了木质素衍生化合物辅助共培养体系（CC）在萘生物转化中的作用机制。设计策略（图6a）表明，EDA-PL通过其表面活性剂特性增强萘的生物可利用性，促进微生物对疏水性底物的摄取。比较EDA-PL辅助CC与CC（图6b），以及EDA-PL与对羟基苯甲酸辅助CC（图6c）的差异，揭示了木质素衍生化合物通过多重途径协同强化萘的生物转化。EDA-PL通过上调ABC转运蛋白和鞭毛组装相关基因加速了萘的摄取和转运。在对羟基苯甲酸存在下，与细菌趋化和脂肪酸生物合成相关的基因上调，进一步增强了萘的生物转化效率。
【数据】机制通路：ABC转运蛋白、鞭毛组装、细菌趋化、脂肪酸生物合成
讨论与解读
本研究系统评估了木质素衍生化合物辅助生物修复策略在萘降解中的应用潜力，并通过多组学分析深入解析了PAHs生物转化的机制。经优化后，K. marina H-2与P. putida B6-2共培养体系的萘降解率达42.2%。向共培养体系中添加EDA-PL和对羟基苯甲酸可将萘降解率显著提升至68.5%。EDA-PL通过上调鞭毛组装和ABC转运蛋白相关基因，增强了萘的生物可利用性和摄取效率。此外，在对羟基苯甲酸存在下，细菌趋化和脂肪酸生物合成相关通路进一步促进了萘的转运和生物转化。
编译者解读：本研究巧妙地将木质素预处理产物——原本可能被视为废弃物或副产物的物质——转化为强化PAHs生物修复的功能性辅助因子，体现了"以废治废"的循环经济理念。EDA-PL兼具表面活性剂和共代谢底物的双重功能，这种"一石二鸟"的策略为疏水性有机污染物的生物修复提供了新思路。值得关注的是，研究从表型优化（响应面法）到机制解析（转录组+代谢组）形成了完整闭环，逻辑严谨。然而，从实验室到实际污染场地的放大应用中，木质素衍生化合物的复杂组成、土壤基质的异质性以及土著微生物的竞争等因素可能影响修复效果，这些仍需进一步验证。未来若能将木质素预处理工艺与生物修复工程系统整合，有望构建更加经济高效的PAHs污染修复技术方案。
参考来源
Cui J.-Q. Lignin-derived compounds assisted with Kocuria marina H-2 and Pseudomonas putida B6-2 co-culture enhanced naphthalene biodegradation. Bioresource Technology, 2024. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131512
DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131512