来源：Evolution and engineering of pathways for aromatic O-demethylation in Pseudomonas putida KT2440（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
木质素解聚产物中富含甲氧基芳香化合物，其O-脱甲基化常是生物转化途径的限速步骤。本研究在恶臭假单胞菌KT2440中系统比较了天然Rieske型加氧酶VanAB与异源四氢叶酸依赖性脱甲基酶LigM两条途径，并通过适应性实验室进化（ALE）优化菌株性能。进化后的菌株生长速率显著提升，其中携带天然VanAB途径的进化菌株生长速率约为异源LigM途径菌株的1.8倍。通过将三个关键突变组合到单一菌株，获得了香草酸消耗速率较野生型提升约5倍的优良菌株ACB418。
研究背景
木质素解聚后经生物转化生产燃料和化学品，是可持续生物制造的重要策略。自然界中，白腐真菌和放线菌等微生物通过胞外氧化酶解聚木质素，并利用释放的芳香化合物。然而，生物法木质素解聚程度有限，工业应用受限。化学催化解聚（还原、氧化、溶剂解）可产生芳香单体与寡聚物混合物，随后通过"生物漏斗"策略由工程菌将其转化为单一高价值产品。
木质素衍生芳香化合物常含甲氧基，O-脱甲基化往往是影响分解代谢效率的限速反应。已知多个酶家族可催化芳香族O-脱甲基化，但缺乏体内系统比较。本研究在恶臭假单胞菌KT2440中对两种O-脱甲基化途径进行了平行对比——天然Rieske非血红素铁单加氧酶VanAB与异源四氢叶酸依赖性脱甲基酶LigM，并借助适应性进化优化菌株性能。
研究方法
本研究所用菌株列于表S1，质粒列于表S2，引物列于表S3，自定义合成基因列于表S4。菌株构建方法及其他实验的详细内容见补充材料。
菌株构建与培养基条件
以恶臭假单胞菌KT2440野生型为亲本菌株。该菌株天然利用Rieske非血红素铁单加氧酶系统VanAB将香草酸脱甲基化为原儿茶酸。为研究vanAB过表达效应，将天然vanAB操纵子敲除并替换为受强组成型tac启动子控制的vanAB表达盒，构建菌株ACB122。另一菌株设计为表达THF依赖性脱甲基酶LigM：首先敲除vanAB操纵子并替换为来自SYK-6的ligM基因（菌株ACB101），但仅表达ligM不足以支持香草酸分解代谢。在SYK-6中，ligM与metF和ligH构成操纵子，后两者为THF介导的C1代谢所必需，但表达ligM与metF:ligH的ΔvanAB菌株（ACB102）仍无法以香草酸为唯一碳源和能源生长。
推测ACB102生长失败源于THF再生优化不足，因此将类似菌株AG5349在含5 mM香草酸、10% LB的极限培养基中培养。经一次传代后，培养物达到高细胞密度，提示香草酸被利用。对分离菌株测序，各菌株均在PP_1942（基因组中与C1代谢基因相邻的LysR型转录调控因子）含单核苷酸多态性。将E226K突变引入PP_1942后，所得菌株ACB143能够以香草酸为唯一碳源和能源生长，但生长速率远低于KT2440野生型或ACB122。E226K突变并非功能缺失突变——敲除PP_1942反而抑制香草酸生长（菌株ACB144）。此外，在不含metF:ligH操纵子情况下表达PP_1942E226K（菌株ACB125）同样无法以香草酸生长。上述结果共同表明，ACB143的香草酸分解代谢由非天然ligM、metF、ligH基因过表达与天然代谢另一组分的失调共同促成。
LysR型调控因子通常影响其反向转录基因的表达。检查PP_1942发现其反向转录一个操纵子，包含PP_1943（purU-III，甲酰四氢叶酸脱甲酰酶）、PP_1944（参与C1代谢的氨基甲基转移酶）和PP_1945（folD-I，5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化水解酶）。以香草酸生长时，ACB143中purU-III和folD-I的转录水平较ACB102或ACB144显著升高（p < 0.02），表明PP_1942转录因子的E226K突变增强了其相邻操纵子的表达。PP_1943–1945编码恶臭假单胞菌中的THF介导C1代谢途径，当THF依赖性LigM作为香草酸O-脱甲基酶时，这些天然基因的表达增强可能对生长至关重要。
为检验PP_1942是否也作为香草酸分解代谢的全局调控因子，对ACB143和ACB102进行转录组分析——两者仅在PP_1942等位基因上有差异（ACB143含PP_1942E226K，ACB102含天然PP_1942）。在以葡萄糖加香草酸生长时，ACB143相对ACB102有数百个基因显著差异表达，表明PP_1942调控因子 modulates 多种基因。然而，PP_1942本身及其紧邻基因PP_1943（purU-III）、PP_1944和PP_1945（folD-I）表现出大幅表达升高。将ACB143在含与不含香草酸的葡萄糖培养基中的转录组进行比较，PP_1942–1945再次显著上调。有趣的是，仅以葡萄糖生长时，ACB143中PP_1942相对ACB102出现下调。综合这些分析，PP_1942E226K增加了自身及purU-III操纵子的表达，且香草酸作为该表达的诱导物。
适应性实验室进化（ALE）
对三株恶臭假单胞菌进行ALE以优化香草酸分解代谢和改善生长。KT2440野生型和ACB122（vanAB过表达菌株）的ALE使用含固定浓度20 mM香草酸的极限培养基。共6个KT2440谱系和6个ACB122谱系独立进化约60天（约650代）。KT2440实验中所有谱系在前50天表现出相似的生长进化，在第15天和第40天左右出现小幅生长速率增加。ACB122实验表现出更多进化变异：两个谱系生长速率逐渐增加，其余四个谱系沿进化轨迹出现更明显的生长速率跃升。
由于含ligM的ACB143生长远慢于其他菌株，对其采用耐受性ALE（TALE）方案。共6个ACB143群体独立进化约98天（约430代）。该方法中，培养物初始维持在5 mM香草酸固定浓度，约60天后所有谱系达到0.1 h⁻¹以上的表观生长速率，随后将香草酸浓度逐步提高至20 mM。实验初期，ACB143群体表现出较长延迟期，在5 mM香草酸中生长困难，平均传代间隔为3–4天。随着TALE实验推进，倍增时间缩短，表观生长速率大幅提高。
ALE和TALE实验结束时各谱系取样的群体相对亲本菌株均表现出显著生长改善。对KT2440和ACB122，大部分改善归因于延迟期缩短，但常以生长速率下降为代价。培养物在自动化生长平台中达到阈值OD600nm时传代，这显然选择了延迟期缩短而非生长速率提高，因为达到阈值的时间是两者的综合结果。与此同时，ACB143进化谱系在生长速率和延迟期两方面均表现出显著改善，实验结束时其生长延迟期已接近KT2440野生型。尽管ACB143生长最快的进化群体仍慢于KT2440，但其生长速率与天然利用LigM依赖性分解代谢途径的宿主S. lignivorans SYK-6非常接近。将进化群体以阿魏酸（芳香族分解代谢中香草酸的上游代谢物）培养时，部分生长改善仍然存在，但不如以香草酸培养时明显。需要指出的是，图2中的生长速率在微量滴定板中测定，其通气速率低于ALE实验的充分混合条件，因此测得的生长速率更慢。
研究结果
进化群体的生长特征
六株进化群体（来自ALE和TALE实验终点）与各自未进化亲本菌株的生长曲线比较显示：KT2440进化群体相对野生型主要缩短了延迟期；ACB122进化群体同样以延迟期缩短为主；ACB143的TALE进化群体则在生长速率和延迟期两方面均有大幅改善，其延迟期已接近KT2440野生型水平。尽管ACB143最快生长进化群体仍慢于KT2440，但其生长速率与天然利用LigM途径的S. lignivorans SYK-6相当。
【数据】香草酸浓度：20 mM（KT2440/ACB122 ALE）、5 mM→20 mM（ACB143 TALE）；进化时间：~60天/~650代（KT2440/ACB122）、~98天/~430代（ACB143）；生长速率阈值：0.1 h⁻¹；传代间隔：3–4天（ACB143 TALE早期）；ACB143进化群体生长速率与SYK-6相近
趋同突变分析
对终点群体突变进行Sankey图分析。ACB143 TALE谱系和KT2440/ACB122 ALE谱系中均观察到趋同突变。突变以单核苷酸多态性（SNP）为主，多数SNP预计引起氨基酸改变并修饰蛋白功能，如FghA、PP_3493产物和VanB。部分突变直接涉及香草酸分解代谢相关基因，其他突变则提供更普遍的适应性优势——例如fleQ和gacA/gacS双组分调控系统的突变，此前研究已表明这些突变可减少鞭毛和生物膜形成，在充分混合的培养条件中提高适应性。
【数据】突变类型：SNP为主；谱系数：KT2440共6系、ACB122共6系、ACB143共6系；突变频率范围：min=1，max=6个谱系
ACB143进化菌株分析
对ACB143进化菌株进行基因组图谱分析，突出显示工程化香草酸分解代谢途径中的突变，包括ligM、ligH和PP_1942E226K。柱状图显示各进化分离株中相关基因的相对转录本丰度（FC：倍数变化）。热图进一步展示了转录变化模式。进化过程中积累的突变涉及多个层面——从途径基因本身到全局调控因子，共同促进了香草酸利用能力的提升。
【数据】差异表达基因：数百个（ACB143 vs ACB102，葡萄糖+香草酸条件）；purU-III和folD-I转录水平：p < 0.02显著升高；PP_1942–1945在含香草酸条件下显著上调
FghA变异体分析
KT2440和ACB122进化中获得的FghA变异体被详细分析。恶臭假单胞菌中依赖谷胱甘肽（GSH）的甲醛解毒途径为：GSH与甲醛自发反应形成S-羟甲基谷胱甘肽（S-HMG），后者被甲醛脱氢酶（FALDH）氧化为S-甲酰基谷胱甘肽。FghA是这一途径的关键酶。进化中fghA基因出现的突变（如W15C）增强了甲醛解毒能力——这对VanAB途径尤为重要，因为VanAB催化香草酸O-脱甲基化时会产生甲醛副产物。FghA变异体的功能分析揭示了特定氨基酸替换如何改善酶的催化性能或稳定性。
【数据】FghA突变：W15C等；甲醛解毒途径：GSH依赖性；关键酶：FALDH、FghA
PP_3493突变相关的表型与转录变化
PP_3493编码LysR型调控因子，其基因组区域与其反向转录基因PP_3494（编码PUF）相邻。携带PP_3493或PP_3494突变的菌株与KT2440野生型进行比较。PP_3493的突变（如P133L）影响了香草酸分解代谢相关基因的表达调控。该调控因子的突变与fghA表达变化相关联——PP_3493作为调控因子，其突变可能导致包括甲醛解毒途径在内的多个下游基因表达改变，从而影响整体香草酸利用效率。
【数据】PP_3493突变：P133L；调控靶标：PP_3494（PUF）、fghA等；比较对象：突变菌株 vs KT2440野生型
优良生物催化剂ACB418的构建与性能
将三个突变——PP_3493P133L、vanB A24P和fghA W15C——组合到ACB122背景中，构建菌株ACB418。将ACB418、ACB122和KT2440野生型在含20 mM香草酸的M9极限培养基中培养，测定香草酸消耗曲线。ACB418在培养前8小时内香草酸消耗速率约为野生型的5倍。这一结果表明，将进化中鉴定到的关键突变进行组合，可以协同增强香草酸O-脱甲基化效率，获得性能显著优于野生型的工程菌株。
【数据】菌株：ACB418（ACB122背景+PP_3493P133L+vanB A24P+fghA W15C）；培养基：M9极限培养基+20 mM香草酸；前8小时香草酸消耗速率：约为野生型的5倍
进化过程中的群体动态
整个ALE实验过程中收集了群体样本。进化轨迹分析显示，不同谱系在进化动力学上存在差异——ACB122实验中两个谱系表现为渐进式生长速率增加，而其余四个谱系出现更明显的"跳跃式"增长。这种进化异质性反映了不同突变组合可能通过不同机制提升适应性。对于ACB143的TALE实验，群体从初期在5 mM香草酸中生长困难（延迟期长、平均传代间隔3–4天）逐步适应，到约60天时所有谱系均达到0.1 h⁻¹以上的表观生长速率，随后在逐步提高的香草酸浓度（最高20 mM）下继续进化。
【数据】ACB122进化模式：2系渐进+4系跳跃；ACB143 TALE：~60天达到0.1 h⁻¹阈值；传代间隔：3–4天（初期）→缩短（后期）
讨论与解读
本研究在恶臭假单胞菌KT2440中表征了两条香草酸利用途径，分别以两种截然不同的酶催化香草酸O-脱甲基化这一关键步骤。各菌株经ALE进化后，生长改善源于香草酸O-脱甲基酶基因本身及辅助基因和途径的突变。与其他细菌ALE实验一致，SNP是本研究所有谱系中最常见的突变类型。多数情况下，SNP预计引起氨基酸改变并修饰蛋白功能，如FghA、PP_3493产物和VanB所展示的那样。部分突变直接涉及香草酸分解代谢基因，其他突变则提供更普遍的适应性优势——如fleQ和gacA/gacS双组分调控系统的突变，可减少鞭毛和生物膜形成，在充分混合的培养条件中提高适应性。许多有益突变无法通过理性设计预测，这充分展示了ALE在获得野生型和工程菌株生长优势变异体方面的强大能力。
编译者解读
本研究的方法论亮点在于将ALE与转录组学、酶动力学分析相结合，系统解析了从突变到表型的完整因果链。尤为值得关注的是，作者不仅比较了两条O-脱甲基化途径的优劣，还通过组合三个关键突变实现了性能的协同提升——这种"进化发现+理性组合"的策略对合成生物学中复杂表型优化具有普适参考价值。然而，ACB418的性能验证仍局限于摇瓶培养和以香草酸为单一底物的条件，其在真实木质素解聚产物混合物中的表现、以及vanB A24P和fghA W15C突变提升酶活的具体分子机制，原文未详述，值得后续深入研究。该平台菌株为木质素芳香化合物的高效生物转化提供了有力工具。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2024
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.06.009
DOI: 10.1016/j.ymben.2024.06.009