来源：Bioconversion of lignin-derived aromatics into the building block pyridine 2,4-dicarboxylic acid by engineering recombinant Pseudomonas putida strains（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料污染与化石资源枯竭催生了生物基塑料单体的需求。吡啶-2,4-二甲酸（2,4 PDCA）是对苯二甲酸的类似物，在生物基塑料领域具有重要价值。本研究通过阻断恶臭假单胞菌KT2440的内源β-酮己二酸途径，引入外源LigAB双加氧酶，并过表达转运蛋白PcaK或单加氧酶PobA，构建了静息细胞生物转化体系。结果显示，从原儿茶酸（PCA）生产2,4 PDCA的体积生产力达到0.58 g L⁻¹h⁻¹，为迄今报道的最高值；从对羟基苯甲酸（HBA）和对香豆酸（pCA）的生产力分别达到0.056 g L⁻¹h⁻¹和0.012 g L⁻¹h⁻¹，比红球菌Rhodococcus jostii生物催化剂高出15倍以上。研究还首次实现了以聚合木质素为原料的生物转化。
研究背景
循环经济不仅要求最终产品的回收，更要求将工业和生活废弃物重新纳入生产-消费循环。植物生物质中，纤维素和半纤维素已被用于造纸、尼龙和生物燃料生产，而木质素——全球年提取量超过5000万吨——大多被视为废料。仅少部分用于粘合剂、吸附剂或碳纳米纤维原料，大部分在工厂设施中燃烧供热发电。然而，木质素是可再生芳香族化合物最丰富的来源。已有研究证明，利用基因改造细菌可将木质素流转化为粘康酸、己二酸、吡啶二甲酸等具有明确商业价值的化合物。本研究的目标是构建高效的恶臭假单胞菌重组菌株，将木质素衍生的单芳香族化合物转化为2,4 PDCA。
研究方法
2.1 化学试剂、菌株、质粒与培养条件
所有化学试剂均购自Merck，除非另有说明。Green Value Protobind 1000 soda lignin（GVPL）最初购自Green Value SA（Orbe, Switzerland）。3%（w/v）GVPL储备液的配制方法如下：先将木质素溶于水，加入NaOH至pH 11.5；然后用HCl将pH调至8，溶液经高压灭菌后室温保存。芳香底物pCA和PCA的0.1 M储备液制备方法为：用等摩尔NaOH中和相应酸至pH 7.5后溶于水，于−20°C保存。HBA的0.1 M储备液则直接将对羟基苯甲酸钠溶于水（无需加NaOH）。本工作所用菌株和质粒详见表1。P. putida KT2440菌株在液体LB培养基或M63、M9基本培养基中培养，碳源按各实验指定。E. coli菌株在LB培养基中、37°C、200 rpm振荡条件下培养。需要时，向培养基中添加庆大霉素（10 μg/ml）、卡那霉素（50 μg/ml）或氯霉素（30 μg/ml）。
【数据】GVPL浓度：3%（w/v）；pCA/PCA储备液：0.1 M，pH 7.5；HBA储备液：0.1 M；庆大霉素：10 μg/ml；卡那霉素：50 μg/ml；氯霉素：30 μg/ml；E. coli培养：37°C、200 rpm
2.2 分子生物学技术
标准分子生物学技术按此前描述的方法进行。质粒DNA提取使用“High Pure plasmid isolation kit”（Roche Applied Science）。DNA片段从琼脂糖凝胶或PCR混合物中分别用“Gene Extraction Kit”或“PCR purification Kit”（Qiagen）纯化。所用寡核苷酸由Sigma提供。所有克隆插入片段和DNA片段均通过ABI Prism 377自动DNA测序仪测序确认。E. coli转化采用RbCl法。质粒通过三亲本滤膜接合或电穿孔（Gene Pulser, Bio-Rad）转入P. putida KT2440细胞。三亲本滤膜接合以E. coli DH10B（pK18_ligAB）为供体菌，E. coli HB101（pRK600）为辅助菌，P. putida KT2440为受体菌。
【数据】质粒提取：High Pure plasmid isolation kit；DNA纯化：Gene Extraction Kit / PCR purification Kit；测序：ABI Prism 377；转化：RbCl法；接合转移：三亲本滤膜法；电穿孔：Gene Pulser, Bio-Rad
2.3 P. putida KT::ligAB重组菌株的构建
P. putida KT::ligAB菌株（表1）的构建方法为：利用pK18_ligAB自杀质粒（表1），通过双同源重组事件，将KT2440菌株染色体上的野生型pcaG基因替换为来自Sphingobium sp. SYK-6的ligAB基因。该质粒携带lacIq基因和Ptac启动子，驱动ligAB基因的诱导型表达；ligAB基因序列针对P. putida进行了密码子优化，并工程化了双顺反子Shine-Dalgarno序列BCD2以提高LigAB蛋白产量。BCD2-ligAB片段由GeneMill公司（Liverpool）合成。pK18_ligAB通过三亲本滤膜接合导入P. putida KT2440。第一次位点重组事件的接合子用含1%甘油为唯一碳源的卡那霉素-十六烷基三甲基溴化铵（Sigma-Aldrich）平板筛选。第二次位点重组事件通过含0.2%柠檬酸盐和5%蔗糖的M63培养基平板筛选。对蔗糖抗性、卡那霉素敏感菌株的正确等位基因交换，用两对引物ligAB_Fw_pK18/pcaH_Rv和lacIq_Rv/trmA_Fw进行PCR验证。两个PCR产物均经测序确认重组P. putida KT::ligAB菌株构建正确。
【数据】筛选标记：卡那霉素-十六烷基三甲基溴化铵平板、1%甘油；二次重组筛选：M63平板含0.2%柠檬酸盐、5%蔗糖；验证：PCR + 测序
2.4 pcaK和pobA基因的克隆与表达
pcaK基因（PP_1376）以P. putida KT2440基因组DNA为模板，用引物pcaK_Fw_XbaI和pcaK_Rv_SacI进行PCR扩增，克隆至XbaI和SacI双酶切的pIZ2载体中，生成质粒pLasP8（表1）。pobA基因（PP_3537）采用类似策略，经pobA_Fw_SpeI_SD和pobA_Rv_HindIII引物扩增后，插入SpeI和HindIII双酶切的pIZ2中，生成质粒pLasH42（表1）。两种情况下，基因表达均由lacIq/Ptac调控系统驱动。携带pcaK或pobA的质粒通过电穿孔转入P. putida KT::ligAB，基因表达通过添加0.5 mM IPTG诱导。
【数据】pcaK基因：PP_1376；pobA基因：PP_3537；载体：pIZ2；诱导剂：0.5 mM IPTG
2.5 与细菌生长偶联的2,4 PDCA生产
P. putida KT::ligAB在含0.5 mM IPTG的LB培养基中培养。在200 rpm、30°C孵育3小时后，细胞沉淀用于接种含0.5 mM IPTG、50 mM NH4Cl、1 mM PCA和0.4%（w/v）葡萄糖为碳源的M9基本培养基。培养期间，在5天内收集1 mL上清液样品，经0.45 µm孔径滤膜过滤，于−20°C保存用于HPLC分析。
【数据】培养：LB + 0.5 mM IPTG，3 h，200 rpm，30°C；M9培养基：0.5 mM IPTG、50 mM NH4Cl、1 mM PCA、0.4%（w/v）葡萄糖；采样：5天；滤膜：0.45 µm
2.6 静息细胞中的2,4 PDCA生产
将1 mL P. putida KT2440::ligAB菌株（含对照质粒pIZ2、pLasP8（pcaK）或pLasH42（pobA））的LB过夜种子培养物接种至200 mL新鲜LB培养基，30°C孵育3小时。然后加入0.5 mM IPTG诱导ligAB基因表达，以及分别诱导pLasP8和pLasH42菌株中pcaK或pobA的表达，继续孵育3小时至OD600约为1.8。收集细胞并重悬于10 mL静息细胞培养基中：50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5），添加0.1 M氯化铵和芳香底物（优化浓度为5 mM PCA、1 mM HBA、1 mM pCA或1.5%（w/v）GVPL）。这些静息细胞混合物（0.1 g干重）随后在50 mL烧瓶中、30°C、200 rpm振荡孵育。在不同时间点取1 mL样品，经0.45 µm孔径滤膜过滤，于−20°C保存，用于后续上清液中代谢物的HPLC分析。使用GVPL时，上清液直接于−20°C保存，后续用二氯甲烷萃取和HPLC分析。
【数据】接种：1 mL过夜培养物 → 200 mL LB；诱导：0.5 mM IPTG，3 h，30°C；OD600：约1.8；静息培养基：50 mM磷酸钠缓冲液 pH 7.5 + 0.1 M NH4Cl；底物浓度：5 mM PCA、1 mM HBA、1 mM pCA、1.5%（w/v）GVPL；细胞量：0.1 g干重；反应条件：30°C、200 rpm、50 mL烧瓶
2.7 代谢物分析
为监测芳香底物（即pCA、4HBA或PCA）的2,4 PDCA产量，收集的上清液样品用0.25 M HCl酸化，直接在Agilent Technologies 1260 Infinity II HPLC仪上分析，使用C18 ZORBAX Eclipse Plus（95 Å，4.6 × 250 mm，5 µm，Agilent）反相色谱柱。2,4 PDCA、4-羧基-2-羟基粘康酸半醛（CHMS）和pCA在二极管阵列UV/VIS检测器（DAD）280 nm处检测和定量；HBA和PCA在260 nm处检测和定量。HPLC分析所用溶剂为：水/0.1%三氟乙酸（溶剂A）和甲醇/0.1%三氟乙酸（溶剂B）。分析梯度为11分钟内溶剂B从15%至50%，随后两次色谱柱再平衡步骤：1分钟内50–15% B，再加4分钟15% B。流速始终保持在1 mL/min。样品生成的色谱图与真实标准品进行比较。对于GVPL来源样品的HPLC分析，增加了一步萃取：加入一倍体积的二氯甲烷，剧烈涡旋后13000 rpm离心5分钟。回收上层水相，用0.25 M HCl酸化，再次涡旋和离心。弃去沉淀（含可沉淀的聚合木质素），上清液用于HPLC分析，使用与上述相同的色谱柱和设备。HPLC洗脱条件为：溶剂A（水）和B（甲醇）用0.1%甲酸酸化，流速保持在0.5 mL/min，B溶剂梯度为10分钟15–50%，随后10分钟50–70%，最后10分钟70–15%再平衡。上清液样品也进行了HPLC-MS（高效液相色谱-质谱联用）分析。
【数据】HPLC：Agilent 1260 Infinity II；色谱柱：C18 ZORBAX Eclipse Plus（95 Å，4.6 × 250 mm，5 µm）；检测波长：280 nm（2,4 PDCA、CHMS、pCA）、260 nm（HBA、PCA）；溶剂：水/0.1% TFA + 甲醇/0.1% TFA；梯度：15–50% B 11 min；流速：1 mL/min；GVPL萃取：二氯甲烷、13000 rpm、5 min；GVPL-HPLC：0.1%甲酸、流速0.5 mL/min、梯度15–50% B 10 min + 50–70% B 10 min + 70–15% B 10 min
研究结果
3.1 重定向P. putida KT2440的β-酮己二酸途径用于静息细胞中2,4 PDCA的生产
在P. putida KT2440中，木质纤维素混合物中存在的多种木质素衍生单体（如pCA、松柏醇或阿魏酸）的分解代谢被引导至中心中间体PCA，后者进一步通过β-酮己二酸途径代谢，最终产生乙酰辅酶A并为三羧酸循环提供燃料。为了将PCA重定向至2,4 PDCA，研究人员构建了P. putida KT2440衍生菌株，将天然的内切型3,4-原儿茶酸双加氧酶活性（pcaGH基因）替换为来自Sphingobium sp. SYK-6的异源间切型4,5-原儿茶酸双加氧酶（由ligAB基因编码）（图1）。不出所料，这个新菌株（P. putida KT::ligAB，表1）失去了以某些汇聚至PCA的芳香族化合物（如HBA或香草酸）为唯一碳源的能力，因为该细菌无法代谢PCA的间切产物。
在含0.4%（w/v）葡萄糖为碳源和1 mM PCA为生物转化底物的基本培养基中，检测了P. putida KT::ligAB菌株与生长偶联的2,4 PDCA生产。然而，在生长曲线结束时仅消耗了0.4 mM PCA，产生了0.05 mM 2,4 PDCA。这一结果表明转化率（5%）非常有限，并提示PCA间切产物——一种高反应活性的半醛化合物（图1）——可能对活跃生长的P. putida细胞产生毒性，对高浓度发酵生产构成挑战。
众所周知，静息（非生长）细胞适用于生产生长抑制性或毒性化学品。因此，研究人员设想用P. putida KT::ligAB进行静息细胞生物转化可能特别有用。为此，P. putida KT::ligAB细胞在LB培养基中生长后收集，重悬于含5 mM PCA或1 mM HBA的静息细胞缓冲液中。在不同时间点收集上清液样品以评估生物转化时间进程。与生长细胞实验相反，底物被完全消耗（图2A和2B）。从PCA和HBA生产2,4 PDCA的生产力分别约为0.069 g L⁻¹h⁻¹和0.011 g L⁻¹h⁻¹，高于此前报道的R. jostii生长细胞从HBA生产2,4 PDCA的生产力（0.003 g L⁻¹h⁻¹）。因此，这些结果首次揭示，静息细胞工艺是利用P. putida KT::ligAB重组生物催化剂高效生产2,4 PDCA的合适策略，与生长细胞工艺相比，既显著缩短了生物转化时间，又显著提高了生物转化效率。
【数据】生长偶联：0.4%葡萄糖 + 1 mM PCA；PCA消耗：0.4 mM；2,4 PDCA产量：0.05 mM；转化率：5%；静息细胞PCA生产力：0.069 g L⁻¹h⁻¹；HBA生产力：0.011 g L⁻¹h⁻¹；文献对照（R. jostii HBA）：0.003 g L⁻¹h⁻¹
3.2 检测到限制2,4 PDCA产率的PCA环裂解副产物
虽然上文表明P. putida KT::ligAB静息细胞能够转化所添加的芳香底物，但2,4 PDCA的产率不足50%（图2A和2B），提示有其他产物积累。已知LigAB双加氧酶裂解PCA生成黄色中间体4-羧基-2-羟基粘康酸半醛（CHMS），该中间体在铵存在下自发环化为2,4 PDCA（图3A）。然而，CHMS也可以自发环化为其半缩醛形式（闭环形式），开环和闭环形式处于pH依赖的平衡中。在中性或酸性pH下，半缩醛已被证明是主要形式，而开环形式（CHMS）在碱性pH下才存在（图3A）。尽管生物转化反应（pH 7.5）中提供了高浓度的铵（0.1 M），但在HPLC色谱图中观察到一个与2,4 PDCA（洗脱时间8分钟）信号强度相似的峰（洗脱时间6.5分钟）（图3A）。这个6.5分钟的峰的m/z（186）与CHMS的预测值吻合（图3A），且在碱性条件下呈现深黄色（图3B），强烈提示约一半的PCA间切产物以半缩醛形式积累，从而将2,4 PDCA产率限制在50%以下。
研究人员尝试了多种方法来防止半缩醛形式的积累，例如在生物转化过程中使用更高量的铵、使用更高pH（最高至9）以促进开环形式的存在从而实现更有效的2,4 PDCA环化，但迄今为止均未提高2,4 PDCA产率。CHMS与2,4 PDCA并行生成可能对生长中的细胞造成某种胁迫。此前使用改良P. putida菌株（pcaHG被ligAB替换）在10-L生物反应器中以葡萄糖为碳源、HBA为底物生产2,4 PDCA的尝试，未显示PDCA的显著积累，而芳香底物或PCA中间体持续积累。然而，使用额外修饰的P. putida菌株（pcaHG被ligAB和ligC基因替换）在葡萄糖和HBA中生长，通过LigC催化的CHMS酶促脱氢生产PDC（2-吡喃-4,6-二甲酸），滴度达到58 g/L。这些结果表明，表达ligAB的P. putida菌株中CHMS不产生以及底物积累，与影响芳香底物运输或代谢的碳分解代谢物现象无关，也与缺乏最佳培养条件无关，而是由CHMS的毒性所致——CHMS被生成但无法进一步代谢。这一假说也解释了为什么CHMS以及2,4 PDCA能在本工作的静息细胞条件下生成，但在生长细胞条件下积累很差。
【数据】CHMS洗脱时间：6.5 min；2,4 PDCA洗脱时间：8 min；CHMS预测m/z：186；铵浓度：0.1 M；pH尝试：最高9；文献PDC滴度：58 g/L
3.3 通过过表达PcaK转运蛋白提高从PCA生产2,4 PDCA的效率
PCA可以通过生物法合成，且是工业生产PDCA的重要底物。上文已表明P. putida KT::ligAB能够在静息细胞工艺中将PCA转化为2,4 PDCA。然而，高羟基化芳香族化合物（如PCA）进入细菌细胞的摄取已被证明是限制某些生物技术过程效率的主要瓶颈。在这方面，芳香转运蛋白基因的表达已被证明可以改善目标代谢物的生物生产。因此，研究人员检验了在P. putida KT::ligAB菌株中调控过表达PCA转运蛋白——即pcaK基因——是否能进一步提高2,4 PDCA生产效率。
如图2A所示，P. putida KT::ligAB细胞在静息细胞过程45分钟后消耗了25%的PCA，产生6%的2,4 PDCA产率和0.07 g L⁻¹h⁻¹的生产力。然而，过表达PcaK转运蛋白的细胞（含pLasP8质粒的P. putida KT::ligAB；表1）在诱导（IPTG添加）后，底物PCA被完全消耗，2,4 PDCA产率达到52%（图2D），体积生产力几乎提高了十倍（0.58 g L⁻¹h⁻¹），这是迄今报道的2,4 PDCA生物生产的最高值。因此，这些结果表明，当P. putida KT::ligAB静息细胞以PCA为芳香底物时，调控过表达PcaK转运蛋白是加速2,4 PDCA生产的成功策略，并提示提高芳香转运蛋白的表达水平也可能是关键……
【数据】对照菌株45 min：PCA消耗25%、2,4 PDCA产率6%、生产力0.07 g L⁻¹h⁻¹；PcaK过表达菌株：PCA完全消耗、产率52%、生产力0.58 g L⁻¹h⁻¹
讨论与解读
本研究首次实现了2,4 PDCA在P. putida重组菌株中的生产。研究建立了高效的静息细胞生物转化工艺，该工艺缓解了生长偶联的限制，并允许生物催化剂循环利用。过表达PCA转运蛋白（pcaK）或HBA单加氧酶（pobA）被证明可将2,4 PDCA从PCA（0.58 g L⁻¹h⁻¹）或HBA（0.056 g L⁻¹h⁻¹）的生产力提高至比R. jostii报道值高15倍以上。pobA过表达还提高了从木质素衍生化合物（如pCA）生产2,4 PDCA的生产力，并允许使用聚合木质素进行2,4 PDCA生物生产。
【编译者解读】这项研究的核心价值在于将静息细胞催化策略与靶向转运蛋白工程相结合——前者绕过了生长偶联的毒性限制，后者直接打通了底物摄取的瓶颈。0.58 g L⁻¹h⁻¹的生产力数据为2,4 PDCA的工业化生物制造提供了有竞争力的参考基准。值得注意的是，CHMS半缩醛副产物将产率锁死在50%以下，这一瓶颈提示后续工作需聚焦于CHMS的定向转化或反应条件的精细调控。从合成生物学应用角度看，该工作展示了"途径重定向+转运强化"的组合策略在木质素高值化中的潜力，但聚合木质素的低转化率仍说明真实木质素原料的预处理与解聚是产业化路上不可回避的挑战。
参考来源
Gómez-Álvarez, H. (2022). Bioconversion of lignin-derived aromatics into the building block pyridine 2,4-dicarboxylic acid by engineering recombinant Pseudomonas putida strains. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2021.126638
DOI: 10.1016/j.biortech.2021.126638