来源：Deciphering and harnessing promoter-driven feedback controllers to mitigate metabolic burden in Corynebacterium glutamicum（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
代谢负担是合成生物学中制约微生物细胞性能的核心瓶颈。本研究在工业重要菌株谷氨酸棒杆菌中建立了一套基因组编码的实时监测与反馈控制系统，通过筛选早期负担响应启动子Pcg1940并结合CRISPRi-dCas9框架，实现了对多种遗传负担场景的动态调控，显著改善了细胞生长、蛋白质合成能力、胞内ATP水平及氨基酸生物合成。该技术已达到技术就绪水平3-4级，为微生物智能制造提供了可推广的调控架构。
研究背景
异源基因的稳健表达是生物技术和合成生物学的基石，精确控制基因表达对于优化代谢途径和实现目标产品的高产量至关重要。然而，将合成构建体引入宿主细胞往往会给细胞资源带来沉重负担，表现为生长速率下降、蛋白质合成受损和进化稳定性降低。这一现象被广泛称为代谢负担，源于对有限细胞资源——如氨基酸、核苷酸、核糖体、聚合酶和能量——的竞争，这些资源从天然生理过程中被分流以支持合成基因表达。尽管代谢负担对细胞性能和产品产量影响深远，但在大多数工业相关微生物中，其潜在机制仍未得到充分探索。在自然系统中，细胞进化出了精密的反馈机制以在波动环境条件下维持稳健生长和代谢稳态，但合成构建体常常绕过或破坏这些途径，施加不受控制的需求并扰乱宿主代谢。
研究方法
菌株与质粒构建
携带基于GFP的监测器或启动子驱动的负担反馈控制器的谷氨酸棒杆菌菌株，采用温度敏感型质粒pCRD206通过两步同源重组方法获得。为避免极性效应，生成了无标记的染色体框内突变体。以Δcg1940突变体的构建为例：使用Phusion高保真DNA聚合酶，分别以引物对cg1940-1F/cg1940-2R和cg1940-3F/cg1940-4R从谷氨酸棒杆菌基因组DNA扩增cg1940基因座的上游和下游区域。随后，利用ClonExpress® II一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech，中国），通过无缝克隆策略将这些PCR产物与BamHI/XbaI线性化的pCRD206骨架组装，生成敲除质粒。将pCRD206-GOI质粒通过电穿孔导入谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，并通过两步筛选过程选择染色体破坏突变体。所有基因敲除和整合突变体均采用类似程序生成，并通过Sanger测序确认其正确性。用于构建敲除突变体的引物列于补充信息在线表S6中。
采用大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXMJ19作为构建基于质粒的诱导型基因表达系统的骨架。pTRCmob穿梭载体用作开发负担响应型生物传感器的骨架。质粒pTRCmob-PhtpG1-mCherry由GenScript Biotech合成。在PhtpG1启动子两端引入BamHI和XbaI限制性酶切位点，使其能够被其他可测试的负担响应启动子替换。测试的负担启动子双链DNA片段通过退火补充信息在线表S6中列出的引物对生成。所有pTRCmob-Pburden-mCherry质粒均采用类似程序获得。为清晰起见，所有重组质粒的核心组件序列列于补充信息在线表S7中。
【数据】菌株：谷氨酸棒杆菌ATCC 13032；质粒：pCRD206、pXMJ19、pTRCmob；工具酶：Phusion高保真DNA聚合酶；试剂盒：ClonExpress® II一步克隆试剂盒；筛选方法：两步同源重组+电穿孔+Sanger测序
荧光监测器的性能评估
对于荧光监测器的性能评估，将携带和不携带质粒构建体的谷氨酸棒杆菌细胞在含适当抗生素的CGXII培养基中过夜培养。次日，当谷氨酸棒杆菌培养物达到对数生长后期时，将细胞以0.02的初始OD600接种于96孔板（Costar）中，每孔终体积200 μl。然后将板转移至微孔板读数器（BioTek Synergy Neo2 Hybrid），在807 cpm（1 mm轨道）的轨道摇动下孵育4小时。培养物在测定启动前生长30分钟，该时间点被定义为实验起点。选择诱导前2.5小时的预孵育期，以确保细胞已退出延迟期并进入稳定的早期指数生长状态。在此阶段进行诱导，可以在活跃生长条件下评估负担响应，此时细胞资源分配和翻译能力的限制最为显著。每30分钟记录一次荧光（GFP）和光密度（OD600）。GFP的测量采用488 nm激发波长和520 nm发射波长。菌株的相对负担容量通过每小时GFP产生速率归一化至细胞密度来量化，计算公式为：GFP·h⁻¹t2=[(GFPt3-GFPt1)/(t3-t1)]/OD600 t2。该方法通过将GFP产生动态与细胞生长相关联，实现了对菌株性能的精确评估。
【数据】培养基：CGXII；接种OD600：0.02；孔板：96孔Costar板；仪器：BioTek Synergy Neo2 Hybrid；转速：807 cpm（1 mm轨道）；孵育时间：4h；预培养：30min；诱导前预孵育：2.5h；GFP激发/发射波长：488/520nm；检测间隔：30min
RNA-seq转录组分析
为探索代谢负担响应中的全局转录变化，将携带负担质粒的谷氨酸棒杆菌菌株首先在LBHIS培养基中过夜培养。随后将培养物转移至含CGXII基本培养基的摇瓶中，初始OD600为0.1，预培养2.5小时以确保在诱导负担质粒前保持一致的生理状态。在诱导后30分钟收集转录组样本，以捕获指示宿主对代谢负担早期适应性反应的快速体内变化。这一短采样窗口得到了实时监测数据的支持——数据显示，在引起负担的诱导后，相对表达能力的下降迅速发生，而可测量的生长迟滞仅在较晚时间点才显现。为控制诱导剂的任何非特异性效应，实验设计包含一个平行的IPTG诱导空质粒对照，其中携带不含任何负担诱导基因的骨架载体的细胞暴露于相同的诱导条件。通过将每个负担诱导菌株与该IPTG诱导对照进行比较进行差异表达分析，从而去除仅由诱导剂暴露引起的转录变化。
为进一步研究cg1940基因在代谢负担细胞响应中的功能，使用携带TK0537-TK1085或cg0501负担质粒的谷氨酸棒杆菌野生型和Δcg1940菌株进行RNA-seq分析。所有菌株在LBHIS培养基中过夜培养，随后以0.1的初始OD600转移至CGXII培养基中，以确保同步的生长条件。进入指数生长期后用IPTG诱导质粒表达，并在诱导后30分钟收获细胞，以捕获与代谢负担相关的早期转录响应。使用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit（天根生物技术，北京，中国）从谷氨酸棒杆菌细胞中分离总RNA。使用Agilent Bioanalyzer 2100系统（Agilent Technologies，Palo Alto，美国）的RNA Nano 6000检测试剂盒评估RNA完整性。cDNA文库构建、Illumina测序及后续RNA-seq数据分析由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。原始数据通过去除含接头的读数、含poly-N的读数和低质量读数进行过滤，并使用Bowtie2比对器比对至谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的参考基因组。该项目的RNA-seq原始数据已存入NCBI SRA数据库，登录号为PRJNA1261577和PRJNA1261585。基因表达使用RPKM算法（每千碱基转录序列每百万映射读数的读数数）进行量化。两组间的RNA-seq差异表达分析使用DESeq2 R包进行，该包采用适度估计的离散度估计和对log2倍数变化的收缩，以增强分析结果的稳定性和可解释性。|log2(倍数变化)|>0且padj<0.05被统计学设定为基因差异表达的阈值。在该框架内，能够在生物学重复中显示微小但一致可重复表达变化的基因，可以以较强的统计置信度被检测到。
【数据】培养基：LBHIS、CGXII；初始OD600：0.1；预培养：2.5h；诱导后采样时间：30min；诱导剂：IPTG；RNA提取试剂盒：RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit；比对工具：Bowtie2；差异表达阈值：|log2(fold change)|>0且padj<0.05；数据库登录号：PRJNA1261577、PRJNA1261585
负担响应启动子的筛选
将pTRCmob-Pburden-mCherry和pXMJ19-TK0108-pdxS共转化至大肠杆菌后，从平板上随机挑选单个菌落，在LB培养基中振荡过夜培养。与GFP监测器的性能评估类似，将指定菌株的过夜培养物收获并重悬于M9培养基中，初始OD600为0.02。然后将板转移至微孔板读数器（BioTek Synergy Neo2 Hybrid），在807 cpm（1 mm轨道）的轨道摇动下孵育4小时。培养物在测定启动前生长30分钟，该时间点被定义为实验起点。测量mCherry荧光（激发：590 nm，发射：645 nm）和细胞生长（OD600）。
【数据】共转化宿主：大肠杆菌；培养基：LB、M9；初始OD600：0.02；仪器：BioTek Synergy Neo2 Hybrid；转速：807 cpm（1 mm轨道）；孵育时间：4h；预培养：30min；mCherry激发/发射波长：590/645nm
研究结果
用于评估代谢负担的荧光监测器的开发
越来越多的证据表明，细菌基因表达过程与细胞生长生理紧密耦合，基因表达机制是胞内资源分配的主要决定因素。受大肠杆菌容量监测器概念的启发，本研究探索了一种基于荧光的方法，用于实时评估谷氨酸棒杆菌中的代谢负担。GFP表达盒缺乏专用调控元件，被整合到谷氨酸棒杆菌基因组中，作为细胞表达能力的非调控报告器。在此配置下，GFP表达反映基因表达所需细胞资源的全局可用性，荧光变化为细胞资源分配和整体代谢状态的改变提供了定量代理指标（图1A）。遗传修饰和环境胁迫都会引入对必需细胞资源——包括转录和翻译机制——的竞争，从而限制RNA聚合酶、核糖体、核苷酸、氨基酸、辅因子和ATP的可用性。随着代谢负担的增加，这种加剧的资源竞争降低了基因组GFP表达的能力，导致荧光强度出现可检测的下降。总体而言，该报告器为定量谷氨酸棒杆菌中的代谢负担提供了一种先进且高效的实时方法。
为实现这一目标，我们将GFP表达盒引入谷氨酸棒杆菌基因组中的一个中性基因座（图1A）。该表达盒设计为在组成型启动子控制下运行，从而最大限度地减少宿主调控网络的影响，确保稳定、非调控的表达。为消除相邻基因组元件的潜在干扰，在表达盒两侧加入了转录终止子。选择基因组中cg1121-cg1122的基因间区域作为整合位点，因为该基因座已被广泛报道可支持合成构建体的稳定表达，且不会对细胞生长或活力产生不利影响。为创建稳健的基于GFP的表达盒，我们基于谷氨酸棒杆菌的保守−10和−35基序构建了一个合成启动子文库，以鉴定强的组成型人工启动子。延伸−10基序（NTANANT）、−35基序（TGNCN）和核糖体结合位点序列（AAAGGA）被设计为功能性共有元件，代表核心启动子元件的最佳序列，以确保高表达效率（图1B）。经过荧光激活细胞分选（FACS）筛选和选定构建体的稳定基因组整合后，随机选择100个单菌株进行GFP荧光强度的定量测量，以评估启动子性能（补充信息在线图S1a）。其中，46号菌株表现出最高的归一化至细胞生物量的相对荧光强度，约为广泛使用的Ptac组成型启动子对照菌株的1.6倍（图1B）。46号菌株的启动子序列列于补充信息在线表S1中。进一步研究证实，将基于GFP的表达盒整合到cg1121-cg1122基因间区域对谷氨酸棒杆菌的生长没有明显影响（补充信息在线图S1b），同时成功赋予工程菌株稳健的GFP荧光（补充信息在线图S1c）。
【数据】荧光报告器：GFP；整合位点：cg1121-cg1122基因间区；启动子元件：−10基序NTANANT、−35基序TGNCN、RBS序列AAAGGA；筛选方法：FACS；最高荧光菌株：No.46，为Ptac对照的1.6倍
高水平基因表达引发谷氨酸棒杆菌的代谢负担
量化代谢负担是理解工程菌株生理状态的关键步骤，有助于设计更适合高效稳定表达的遗传元件。为评估该GFP容量监测器的运行性能，我们特意选择了六个已知在谷氨酸棒杆菌中引起可测量生长损伤的代表性基于质粒的诱导表达系统。这些系统并非依赖单一类型的应激源，而是模拟代谢工程中常见的广泛细胞资源竞争场景。具体而言，所选构建体涵盖多样且实际相关的遗传配置，包括：（i）同源基因过表达，以thrE（编码L-苏氨酸输出蛋白）和cg0501（编码推定糖转运蛋白）为代表，主要挑战膜生物发生及天然蛋白质合成所需的细胞资源分配；（ii）异源蛋白质表达，如bipA（编码来自短乳杆菌的GTP结合蛋白）和gad（编码来自巨大芽孢杆菌的谷氨酸脱羧酶），引入额外的翻译需求和由外源蛋白质合成引起的蛋白质折叠应激；（iii）多基因操纵子表达，以来自嗜热古菌Thermococcus kodakarensis的融合基因簇TK0537-TK1085为代表，由于多基因的协调表达而增加累积的转录和翻译需求；以及（iv）双启动子串联表达，以来自短乳杆菌的clpX（编码Clp蛋白酶）和dnaK（编码分子伴侣）为代表，其中多个功能模块的同时表达进一步加剧了对共享细胞资源的竞争。
重要的是，这些构建体反映了在谷氨酸棒杆菌菌株开发中经常使用的遗传架构和代谢工程策略，旨在改善宿主生理稳健性和实现目标化合物的高水平生产。这种多样性使我们能够评估GFP监测器是否能够可靠地检测不同负担机制下细胞资源分配的全局变化。首先，我们通过检查稳定期的最终生物量积累来比较六个采样系统的生长谱，因为生长迟滞是细胞资源限制的公认下游后果。正如预期的那样，这些代表性合成基因构建体的诱导型过表达显著降低了谷氨酸棒杆菌的细胞生长（图2A和补充信息在线图S2），强化了质粒DNA的维持和复制竞争有限细胞资源从而对宿主细胞施加非天然代谢负担的观点。为详细评估这一效应，使用微孔板读数器进行了在线负担测定（图2B）。携带GFP监测器的菌株与负担质粒共转化，实现对其生理响应的连续实时追踪。每30分钟记录一次GFP荧光和细胞生长参数（OD600），实现在不同代谢负担水平下对菌株生理的实时监测。为量化细胞对施加负担的响应，同时最小化生物量积累的混杂效应，计算GFP产生速率并归一化至细胞密度，得到比GFP产生速率（图2B），该速率可作为细胞表达能力的指标。比较分析表明，原始GFP荧光强度与随时间推移的生物量积累呈强正相关，反映生长相关的总荧光表达能力的增加（补充信息在线图S3）。然而，重要的是，当GFP荧光产生在指定时间点归一化至细胞密度以推导相对负担容量（即比GFP产生速率）时，出现了一个明显而迅速的下降。
【数据】负担构建体：thrE、cg0501、bipA、gad、TK0537-TK1085、clpX、dnaK；检测间隔：30min；检测参数：GFP荧光+OD600；现象：诱导过表达显著降低细胞生长，比GFP产生速率迅速下降
RNA-seq分析揭示多种负担质粒诱导的代谢响应
为从转录组水平理解代谢负担的全局影响，我们对携带不同负担质粒的菌株进行了RNA-seq分析（图3A）。通过比较各负担诱导菌株与IPTG诱导空质粒对照的转录谱，我们能够去除仅由诱导剂暴露引起的转录变化，从而特异性地识别由负担引起的基因表达改变。维恩图显示了不同负担质粒之间上调基因的分布情况（图3B），揭示了不同负担场景下共享和特异的转录响应模块。
【数据】分析方法：RNA-seq；对照：IPTG诱导空质粒对照；比较策略：各负担菌株vs对照
早期负担响应启动子的筛选与评估
基于RNA-seq数据中鉴定的早期负担响应基因，我们构建了启动子筛选系统（图4A）。该系统包含携带候选启动子（Pburden）和mCherry报告基因的负担响应生物传感器，作为检测器。将传感器与负担诱导质粒共转化后，通过监测mCherry荧光强度来评估各候选启动子对代谢负担的响应灵敏度和动态范围。筛选结果显示，多个启动子在负担条件下表现出不同程度的荧光响应变化，其中Pcg1940启动子展现出最强的负担响应灵敏度和最宽的动态范围，被选为后续反馈控制系统开发的核心启动子。
【数据】报告基因：mCherry；筛选系统：pTRCmob-Pburden-mCherry+pXMJ19-TK0108-pdxS；最优启动子：Pcg1940
Cg1940在代谢负担响应中的潜在功能探索
为深入理解Pcg1940启动子对应基因cg1940的生物学功能，我们对其基因组位点进行了分析。图5A展示了cg1940-cg1941操纵子的基因组位置，并使用AlphaFold工具预测了蛋白质结构，在结构模型中标注了预测的信号肽酶切割位点。为探究Cg1940在代谢负担响应中的功能角色，我们构建了Δcg1940突变株，并在携带负担质粒的条件下比较了野生型与突变株的生长和基因表达差异（图5B）。结果表明，cg1940的缺失影响了细胞在代谢负担条件下的适应性响应，提示该基因可能参与谷氨酸棒杆菌对代谢负担的感知或缓解机制。
【数据】分析方法：AlphaFold结构预测、Δcg1940突变株构建；观察指标：生长差异、基因表达差异
启动子驱动的负担反馈控制系统的开发与评估
基于Pcg1940启动子的负担响应特性，我们开发了启动子驱动的反馈控制系统。图6A展示了基于CRISPRi-dCas9框架的启动子驱动反馈控制器示意图。在该系统中，Pcg1940启动子感知代谢负担信号，驱动dCas9的表达，进而对负担诱导基因进行转录抑制，形成负反馈调控环路。我们比较了携带和不携带Pcg1940反馈控制器的菌株在负担条件下的生长和基因表达表现（图6B）。结果显示，引入反馈控制器后，菌株在负担条件下的生长抑制得到显著缓解，目标基因的表达更加稳定。
【数据】反馈控制框架：CRISPRi-dCas9；核心启动子：Pcg1940；效果：生长抑制缓解、基因表达稳定性提高
Pcg1940反馈控制器在ATP生成和氨基酸生产调控中的应用
为验证该反馈控制系统的实际应用价值，我们将其应用于ATP生成和氨基酸生产的关键代谢途径调控。图7A展示了F0F1-ATP多亚基合酶复合物的示意图。我们比较了携带和不携带Pcg1940反馈控制器的菌株在生长性能和ATP积累方面的差异（图7B、7C）。结果表明，反馈控制器的引入改善了菌株的生长表现，并提高了胞内ATP水平。在氨基酸生产方面，反馈控制器同样表现出积极效果，氨基酸生物合成产量得到提升。这些结果证实了Pcg1940反馈控制器在平衡细胞生长与目标代谢物生产方面的潜力。
【数据】应用场景：ATP生成调控、氨基酸生产；效果：生长改善、ATP水平提高、氨基酸产量提升
讨论与解读
代谢负担是微生物工程中的根本性挑战，源于遗传修饰或环境扰动引起的资源重新分配。重组蛋白或合成途径的过表达常常压倒宿主细胞的细胞机制，导致毒性中间产物积累和代谢通量失衡。这种重新分配扰乱了代谢的自然平衡，并引发应激症状，如生长速率减慢、代谢效率降低和蛋白质合成受损。作为工业生物技术的关键平台生物，谷氨酸棒杆菌在工程条件下经常面临基因表达不当的挑战，导致非预期的代谢负担和随后的生长迟滞。本研究开发了基于体内荧光的监测系统来定量代谢负担，并整合转录组分析来揭示不同质粒负担构建体过表达引发的细胞响应。研究结果突显了谷氨酸棒杆菌对代谢负担的普遍宿主响应，其特征在于蛋白质降解相关基因的激活。
Pcg1940启动子在不同物种间的响应活性——在大肠杆菌中同样表现出负担感应能力——支持了该感知机制的一般性。基于此，该技术定位于技术就绪水平3-4级，即在相关生物系统中的实验室规模验证。未来工作应聚焦于更深入地理解负担反馈动力学、在更多微生物宿主和产品中验证性能，并将其整合到微生物生物制造的系统级控制架构中。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将"负担感知"从静态表征推进到动态闭环控制——Pcg1940启动子不仅是检测元件，更被转化为CRISPRi反馈控制的输入信号，实现了代谢负担的自适应缓解。这种"感知-调控"一体化设计思路对合成生物学中的动态调控模块开发具有方法论价值。不过，当前反馈控制器的调控精度和响应速度仍受限于单一启动子的动态范围，且Pcg1940在谷氨酸棒杆菌中的具体生物学功能尚未完全阐明。未来若能将此类负担响应启动子与更多样的效应器偶联，并拓展至其他工业菌株，有望形成通用的代谢健康管理平台，为复杂途径的稳健高效表达提供基础设施。
参考来源
Zhang H. Deciphering and harnessing promoter-driven feedback controllers to mitigate metabolic burden in Corynebacterium glutamicum. Trends in Biotechnology, 2026. DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.02.020
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.02.020