来源：Engineering Corynebacterium glutamicum for efficient l-homoserine production（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-高丝氨酸是天冬氨酸家族必需氨基酸及多种生物基产品的重要前体，在化妆品、食品和制药行业应用广泛。本研究以L-苏氨酸生产菌株为底盘，通过敲除thrB、定点饱和突变 homoserine kinase（HK）第240位精氨酸、以及过表达外排蛋白等策略，最终获得一株可高效生产L-高丝氨酸的谷氨酸棒杆菌。摇瓶产量达29.9 g/L，15 L发酵罐中产量达78.3 g/L，为C. glutamicum生产L-高丝氨酸及其衍生物提供了系统性改造范例。
研究背景
L-高丝氨酸在L-天冬氨酸家族氨基酸的生物合成中扮演关键角色，是L-苏氨酸和L-甲硫氨酸的主要前体。结构上，L-高丝氨酸与L-苏氨酸相似，均含有一个氨基、一个羟基和一个羧基。凭借这些特性，L-高丝氨酸广泛用于化妆品、食品和制药领域。此外，它还作为多种化学产品的前体，包括新型除草剂L-草铵膦、抗衰老化合物亚精胺及保湿剂1,3-丙二醇。为满足可持续工业发展的需求，研究者正探索利用可再生生物质资源生产L-高丝氨酸。目前，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是研究最广泛的L-高丝氨酸生产宿主。近期研究表明，某些大肠杆菌菌株的生产能力显著高于谷氨酸棒杆菌——60小时内最高产量达125.07 g/L，得率0.62 g/g葡萄糖，生产强度2.08 g/L/h。相比之下，谷氨酸棒杆菌中L-高丝氨酸的最大积累量在96小时内仅为63.5 g/L。这凸显了谷氨酸棒杆菌在L-高丝氨酸生产方面仍有巨大的提升空间。
研究方法
2.1 菌株、质粒与引物
本研究所用菌株、质粒及引物详见表1-3。E. coli DH5α用作质粒pK18及其衍生质粒、pXTuf及其衍生质粒的克隆宿主。下划线表示限制性酶切位点，加粗黑色字母表示突变碱基，小写字母表示质粒上的同源序列。
2.2 基因操作
本研究主要涉及三类菌株构建：敲除菌株、质粒过表达菌株和定点突变菌株。前两类的构建方法已有详细报道（Zhao et al., 2024）。此处重点描述定点突变菌株的构建流程。
首先构建19个突变质粒。突变位点设计在上、下游同源臂的交接处（表3）。这些质粒通过同源重组方法构建，使用南京Vazyme Biotech的ClonExpress II一步克隆试剂盒完成。随后，将19个质粒分别转化至TWZ023菌株的感受态细胞中。经过一轮重组后，使用引物HK-jd-1和pK18-jd-2（或pK18-jd-1和HK-jd-2）进行鉴定。当凝胶电泳条带大小正确时，进行第二轮重组。从含链霉素的BHI平板上挑取10个单菌落，用引物HK-jd-1和HK-jd-2克隆thrB序列。通过上海Sangon Biotech Co., Ltd提供的Sanger测序服务鉴定正确的突变菌株。若10个菌落中未获得正确突变株，则加大筛选力度或额外进行一轮重组。通过此方法，成功实现了thrB第240位氨基酸残基的定点饱和突变。
【数据】突变质粒数：19个；筛选菌落数：10个/平板；测序服务商：Sangon Biotech（上海）
2.3 摇瓶发酵与分析
摇瓶发酵的种子培养基和发酵培养基配方与前述文章（Zhao et al., 2024）一致，发酵条件也与之前实验相同。细胞生长、残留葡萄糖浓度和氨基酸浓度的测定均采用前述研究的方法。当需要添加L-苏氨酸和L-异亮氨酸时，制备无菌储备液：L-苏氨酸100 g/L，L-异亮氨酸30 g/L。将储备液加入发酵摇瓶，使每种氨基酸的终浓度达到0.5 g/L。由于菌株生长受限，将发酵时间延长至72小时，取样间隔增加至每24小时一次。
【数据】L-苏氨酸储备液：100 g/L；L-异亮氨酸储备液：30 g/L；添加终浓度：各0.5 g/L；发酵时间：72h；取样间隔：24h
2.4 补料分批发酵
首先，将菌株R240I/pXTuf-Cgl2344从保藏管转接至5 mL BHI液体培养基中。20小时后，取200–400 µL培养物涂布于12块含氯霉素的BHI琼脂平板上。平板倒置，30°C培养约40小时，待菌落完全覆盖平板后，转移至12个含50 mL种子培养基的摇瓶中。种子培养基含5 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl、5 g/L (NH4)2SO4、2 g/L尿素、1 g/L KH2PO4、2 g/L K2HPO4、1 g/L MgSO4和1 mg/L生物素，pH调至7.2。培养基在121°C灭菌20分钟。无菌葡萄糖储备液（800 g/L）在115°C灭菌15分钟后加入摇瓶，终浓度为40 g/L。200 rpm培养12小时后，将600 mL种子培养液转入含发酵培养基的15 L发酵罐中。
发酵培养基含10 g/L玉米浆粉、8 g/L (NH4)2SO4、4 g/L KH2PO4、4 g/L MgSO4、1.5 g/L FeSO4·7H2O、50 mg/L MnSO4·H2O、20 mg/L ZnSO4·7H2O、20 mg/L CuSO4、10 mg/L VB1、3, 5, 6, 12, 0.5 mg/L生物素、5 g/L酵母提取物，补至4.7 L。培养基在罐内115°C灭菌15分钟。接种前用氨水调pH至7.2，加入700 mL无菌葡萄糖溶液（含540 g葡萄糖）及氯霉素至终浓度40 μg/mL。发酵过程中，通过自动供应空气和搅拌速度控制，维持培养基中溶解氧（DO）水平为30%（v/v）。当发酵液中残糖浓度降至15 g/L以下时，开始补糖。葡萄糖溶液（800 g/L）以受控流速自动加入发酵罐，使最终葡萄糖浓度维持在1–10 g/L之间。
【数据】BHI培养时间：20h；涂布量：200–400 µL；平板数：12块；培养温度：30°C；培养时间：约40h；种子培养基体积：50mL/瓶；种子培养基pH：7.2；灭菌条件：121°C/20min；葡萄糖储备液灭菌：115°C/15min；种子葡萄糖终浓度：40 g/L；种子培养转速：200rpm；种子培养时间：12h；接种量：600mL；发酵罐体积：15L；发酵培养基组分：玉米浆粉10g/L、(NH4)2SO4 8g/L、KH2PO4 4g/L、MgSO4 4g/L、FeSO4·7H2O 1.5g/L、MnSO4·H2O 50mg/L、ZnSO4·7H2O 20mg/L、CuSO4 20mg/L、VB1 10mg/L、生物素3,5,6,12,0.5mg/L、酵母提取物5g/L；培养基体积：4.7L；灭菌条件：115°C/15min；pH：7.2（氨水调节）；补糖量：540g葡萄糖（700mL溶液）；氯霉素浓度：40μg/mL；DO：30%（v/v）；补糖阈值：残糖<15g/L；补糖后维持浓度：1–10g/L
2.5 HK的纯化与酶活测定
本研究主要针对HK-WT和HK-R240I的蛋白纯化与酶活测定。首先，从WM001基因组克隆野生型thrB基因片段，从质粒pK18-thrB R240I（表2）克隆突变型thrB基因片段。两个片段分别与线性化的pET28a片段通过同源重组连接，导入BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB琼脂平板。用引物pET28a-jd-1和pET28a-jd-2（表3）通过琼脂糖凝胶电泳验证重组菌株。确认正确条带后，将对应菌株转接至5 mL LB液体培养基。培养物以1%比例接种至新鲜LB培养基中扩大培养。当OD600达到0.6–0.8时，加入0.1 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，温度从37°C降至20°C。培养14–16小时后，用低温离心机在4000 rpm离心10分钟收集细胞。细胞沉淀用10 mM PBS洗涤两次，然后用高压匀浆机破碎。所得粗酶液再次离心，分别收集上清和沉淀。蛋白凝胶电泳显示，大量目标蛋白存在于沉淀中，且几乎没有其他非特异性条带。为从沉淀中获得目标蛋白，使用6 M尿素溶解沉淀至完全澄清。随后用10 kDa截留分子量超滤膜进行离心过滤浓缩蛋白溶液，去除尿素。最后，使用增强型BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime）测定蛋白浓度。
HK酶活通过终点法测定，以底物L-高丝氨酸的消耗量来衡量。每个酶在30°C下反应10分钟，反应体系含100 nM酶、1 mM L-高丝氨酸、2 mM ATP、10 mM MgSO4和50 mM KCl，缓冲液为10 mM PBS pH 7.5。随后加入等体积甲醇终止反应。离心去除蛋白沉淀，用高效液相色谱测定L-高丝氨酸的消耗量。
【数据】卡那霉素浓度：50mg/L；诱导剂IPTG：0.1mM；诱导温度：20°C；诱导时间：14–16h；离心条件：4000rpm/10min/低温；洗涤缓冲液：10mM PBS；破碎方式：高压匀浆机；尿素浓度：6M；超滤膜截留：10kDa；蛋白定量：增强型BCA试剂盒；酶活反应体系：100nM酶、1mM L-高丝氨酸、2mM ATP、10mM MgSO4、50mM KCl、10mM PBS pH7.5；反应温度：30°C；反应时间：10min；终止方式：等体积甲醇；检测方法：HPLC
研究结果
3.1 谷氨酸棒杆菌中L-高丝氨酸生产代谢流改造
本研究通过对L-苏氨酸生产菌株进行精确的代谢流分配调控，获得L-高丝氨酸积累的底盘菌株。首先，为采用自杀质粒pK18mobrpsL介导的基因编辑方法，对L-苏氨酸生产菌株WM001进行链霉素突变。实验验证表明，该突变不影响其生长和生产。敲除thrB后，菌株HWZ001的细胞生长和L-苏氨酸产量均显著下降——L-苏氨酸是细菌生长的必需氨基酸，同时也是支链氨基酸L-异亮氨酸的前体。如图2B所示，HWZ001在72小时时达到最大OD600为28.5，较WM001下降了50%。然而，葡萄糖消耗速率仅略有下降，而L-高丝氨酸产量从0.4 g/L增加至15.2 g/L，得率为0.169 g/g葡萄糖。这表明，即使生长减缓，有限的细胞生物量仍具有生产L-高丝氨酸的潜力。
相比之下，在TWZ003和TW007（已通过工程改造削弱L-苏氨酸下游降解途径、增强L-苏氨酸合成途径，图1）中敲除thrB后，所得菌株HWZ002和HW003表现出与HWZ001相似的生长、葡萄糖消耗和生产曲线。L-高丝氨酸产量分别达到15.4 g/L和15.8 g/L，得率分别为0.171 g/g葡萄糖和0.175 g/g葡萄糖。这是因为在截断L-苏氨酸合成后，TWZ003中ilvA编码的苏氨酸脱氨酶和TWZ007中thrC编码的苏氨酸合酶不再影响L-高丝氨酸生产，TWZ003中lysC编码的天冬氨酸激酶和hom编码的高丝氨酸脱氢酶也不再受L-苏氨酸抑制，因此对L-高丝氨酸得率无显著影响。
L-天冬氨酸是连接中心代谢途径与L-高丝氨酸生物合成的重要桥梁。大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌均具有两条L-天冬氨酸合成途径，即AspB途径（在大肠杆菌中称为AspC途径）和AspA途径。研究表明，同时结合AspC和AspA途径可显著提高L-高丝氨酸得率，主要归因于辅酶平衡的促进。借鉴L-苏氨酸生物合成的经验，推测增强AspB和EcAspA途径也能促进谷氨酸棒杆菌中L-高丝氨酸的积累——通过过表达aspB和引入EcaspA实现（图2A）。结果确实如此：菌株HWZ004（由TWZ011敲除thrB获得）的L-高丝氨酸产量达17.8 g/L，得率0.198 g/g葡萄糖，分别提高了12.6%和2.3%。在此基础上，菌株HWZ005（由TWZ017敲除thrB获得）通过促进pyc、ppc、pyk1、pyk2表达并删除pck和odx构建（图2A），L-高丝氨酸产量达18.7 g/L，得率0.207 g/g葡萄糖。随后，通过突变dapA和删除alaT、avtA进一步减少或阻断L-赖氨酸和L-丙氨酸这两种主要副产物（图2A），获得菌株HWZ006（由TWZ023敲除thrB获得），产L-高丝氨酸20.8 g/L，得率0.231 g/g葡萄糖，分别提高11.2%和2.4%。
总体而言，通过逐步优化各模块，成功将代谢流从L-苏氨酸转向L-高丝氨酸生物合成，获得高效底盘菌株，为后续工程改造奠定了基础。与亲本菌株WM001相比，菌株HWZ006的生长受到严重抑制。为评估其L-高丝氨酸生产潜力，需通过添加L-苏氨酸和L-异亮氨酸恢复生长。如图2C所示，仅添加0.5 g/L L-苏氨酸，最终OD达到48.5，增加83%。仅添加0.5 g/L L-异亮氨酸，OD为50.2，增加89.4%。两种氨基酸各添加0.5 g/L时，OD达到53.5，几乎与亲本菌株持平，生长增加101.9%，与葡萄糖消耗速率吻合良好。这一显著改善归因于L-苏氨酸下游途径的削弱——仅添加L-苏氨酸时，L-异亮氨酸合成较慢。尽管生长显著增加，L-高丝氨酸得率仅略有提高。添加L-苏氨酸或L-异亮氨酸的菌株生产能力分别提高2.6%和4.1%，而两种氨基酸联合添加则使产量提高12.8%。
综上，敲除thrB完全灭活高丝氨酸激酶所获得的菌株，其生长能力被抑制一半，但生产能力仅受轻微影响。换言之，该缺陷型菌株已接近其L-高丝氨酸生产的最大潜力。因此，研究目标是寻找在不影响菌株生长的情况下最大化L-高丝氨酸生产潜力的方法。
【数据】HWZ001最大OD600：28.5（72h）；较WM001下降：50%；L-高丝氨酸产量：0.4→15.2g/L；得率：0.169g/g葡萄糖；HWZ002产量：15.4g/L；得率：0.171g/g葡萄糖；HWZ003产量：15.8g/L；得率：0.175g/g葡萄糖；HWZ004产量：17.8g/L；得率：0.198g/g葡萄糖；提高幅度：12.6%和2.3%；HWZ005产量：18.7g/L；得率：0.207g/g葡萄糖；HWZ006产量：20.8g/L；得率：0.231g/g葡萄糖；提高幅度：11.2%和2.4%；添加0.5g/L苏氨酸后OD：48.5（+83%）；添加0.5g/L异亮氨酸后OD：50.2（+89.4%）；双添加OD：53.5（+101.9%）；单添加产量提高：2.6%和4.1%；双添加产量提高：12.8%
3.2 突变HK实现谷氨酸棒杆菌TWZ023细胞生长与L-高丝氨酸生产优化
为鉴定谷氨酸棒杆菌HK的关键活性位点，选取四种细菌进行序列比对。通过DNAMAN软件分析，四种菌株之间的氨基酸序列相似性为49.1%，两株革兰氏阴性菌之间为68.5%，两株革兰氏阳性菌之间为29.3%。近缘物种之间可能存在一些保守序列。这些保守序列在进化过程中被高度保留，因为它们通常与重要的生物学功能相关，如酶活性位点和转录因子结合位点。据目前所知，在大肠杆菌中，借助序列比对，已确定HK的几个潜在氨基酸位点用于检测，如图3A所示。以这五个突变为例，构建了五种突变菌株：H137L、N203L、R212Q、R240H和R240L。
从生长数据（图3B）来看，菌株R212Q的OD最高，为54.9，比对照菌株TWZ023高7.6%。菌株R240H和R240L的OD值相近，分别为36.8和37.2，比对照菌株低27.8%和27.1%。五个菌株的糖耗速率与其生长速率基本一致（图3C）。从生产角度看（图3D和3E），生长较差的菌株R240H和R240L分别产生21.5 g/L和23.5 g/L的L-高丝氨酸，得率分别为0.239 g/g葡萄糖和0.261 g/g葡萄糖。值得注意的是，L-高丝氨酸得率最低的菌株R212Q，其L-苏氨酸产量增加了20.5%，这为提高L-苏氨酸产量提供了有用的参考。相比之下，位于非保守区的第209位天冬酰胺突变使L-苏氨酸产量降低25%，同时积累7.9 g/L L-高丝氨酸。位于保守区的第139位组氨酸突变使L-苏氨酸得率降低39.1%，积累11.2 g/L L-高丝氨酸。总体而言，确定了第240位精氨酸突变的重要性，计划在该位点进行饱和突变以筛选最优突变菌株。
与对照菌株TWZ023相比，生长最好的前五个菌株……
【数据】四菌株序列相似性：49.1%；革兰氏阴性菌间：68.5%；革兰氏阳性菌间：29.3%；R212Q最大OD：54.9（+7.6%）；R240H OD：36.8（-27.8%）；R240L OD：37.2（-27.1%）；R240H产量：21.5g/L；得率：0.239g/g葡萄糖；R240L产量：23.5g/L；得率：0.261g/g葡萄糖；R212Q苏氨酸产量增加：20.5%；N203L苏氨酸产量降低：25%；高丝氨酸积累：7.9g/L；H139突变苏氨酸得率降低：39.1%；高丝氨酸积累：11.2g/L
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略，成功提升了谷氨酸棒杆菌的L-高丝氨酸生产能力。首先优化代谢途径选择底盘菌株；随后为避免生长缺陷，放弃敲除thrB的策略，转而通过序列比对分析HK并依据文献研究确定突变位点；接着对第240位精氨酸进行饱和突变，获得19个额外菌株；基于摇瓶发酵测试，筛选出得率最高的菌株R240I；最后通过筛选外排蛋白，进一步提高L-高丝氨酸产量。在15 L发酵罐中，不添加氨基酸时，最大L-高丝氨酸产量达71 g/L，得率0.248 g/g葡萄糖；补充1 g/L L-苏氨酸和L-异亮氨酸后，产量提升至78.3 g/L，得率0.28 g/g葡萄糖。这些代谢工程策略从根本上增强了谷氨酸棒杆菌生产L-高丝氨酸及其衍生物的能力。
编译者解读
本研究展示了一条清晰的代谢工程逻辑链：先通过敲除分支途径建立底盘，再以"序列比对+定点饱和突变"替代完全敲除来规避生长缺陷，最后通过外排蛋白筛选释放产物积累压力。第240位精氨酸突变为异亮氨酸（R240I）的效果说明，单一氨基酸残基的替换可以同时改善菌株生长与产物合成，这是理性设计与高通量筛选结合的典型范例。15 L发酵罐规模验证了工艺放大可行性，但摇瓶与发酵罐产量差异提示，溶氧控制与补糖策略仍有优化空间。从合成生物学应用角度看，该策略可推广至其他以天冬氨酸家族氨基酸为前体的高值化学品生产。
参考来源
Zhao, G. (2025). Engineering Corynebacterium glutamicum for efficient l-homoserine production. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132617
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132617