来源：Engineering Corynebacterium glutamicum for 1,5-pentanediamine production via enhanced product tolerance and efflux transport（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
1,5-戊二胺（PDA）是合成聚酰胺PA5X的关键单体，应用遍及纺织、医药和农业领域。其微生物合成长期受制于产物细胞毒性——发酵过程中PDA在胞内快速积累，严重抑制菌株生长与生产。本研究在谷氨酸棒杆菌中构建了"胞内+胞外"双重耐受工程策略：通过理性筛选与适应性实验室进化（ALE）鉴定新型胞外耐受靶点cgl1283，同时改造高效CgmA外排转运体突变体减轻胞内积累毒性。最终工程菌株LF6.1在5-L生物反应器中以葡萄糖为底物产PDA达130 g/L，产率0.40 g/g，生产强度3.94 g/L/h，为迄今报道的最高水平。
研究背景
PDA是合成PA5X等聚酰胺的关键单体，在聚合物材料、农业、航空航天和医疗器械领域应用广泛。传统PDA生产依赖化学合成，主要是戊二腈加氢路线。然而石油资源枯竭与气候变化问题日益严峻，推动了对可再生替代路线的需求。PDA的生物生产已通过两步全细胞催化和一步微生物发酵两条途径实现。前者先将葡萄糖转化为赖氨酸，再由赖氨酸脱羧酶（LDC）脱羧生成PDA——工程化的LDC突变体M3（EcCadA V12C/D41C）在碱性条件下稳定性增强，通过全细胞催化在5-L生物反应器中实现了418 g/L PDA生产。但该路线需要两种不同的微生物宿主（赖氨酸生产菌和LDC表达菌），工艺设计复杂、生产周期长。因此，PDA的直接微生物发酵日益受到关注。然而，PDA对生产菌株的细胞毒性——尤其是发酵过程中胞内快速积累导致的毒性——是制约其高效生物合成的关键瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与质粒
所有细菌菌株（表S1）、质粒（表S2）和引物（表S3）列于补充信息中。菌株和质粒的构建使用Vazyme Biotech的一步克隆试剂盒和Takara Bio的连接克隆完成。谷氨酸棒杆菌中的所有基因组基因敲除、替换和插入均通过使用pK18mobsacB质粒的同源重组进行。
【数据】菌株/质粒/引物：详见补充信息表S1–S3；克隆试剂盒：Vazyme Biotech一步克隆、Takara Bio连接克隆；基因编辑：pK18mobsacB同源重组
2.2 培养基
LB培养基（酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L）用于大肠杆菌培养。LBGB培养基（LB补充5 g/L葡萄糖和18.5 g/L脑心浸液）用于谷氨酸棒杆菌培养。种子培养基（玉米浆粉10 g/L、葡萄糖60 g/L、(NH4)2SO4 25 g/L、KH2PO4 3 g/L、FeSO4·7H2O 120 mg/L、MnSO4·H2O 120 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 6 mg/L、生物素2.4 mg/L、泛酸钙18 mg/L）用于细菌活化。发酵培养基（葡萄糖40 g/L、MgSO4 0.9 g/L、(NH4)2SO4 20 g/L、玉米浆粉12 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 120 mg/L、MnSO4·H2O 120 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.6 mg/L、CuSO4·5H2O 0.6 mg/L、生物素1 mg/L、泛酸钙5 mg/L）用于PDA生产。灭菌条件为121°C、15 min。
【数据】LB培养基：酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；LBGB：LB+5 g/L葡萄糖+18.5 g/L脑心浸液；种子培养基：玉米浆粉10 g/L、葡萄糖60 g/L、(NH4)2SO4 25 g/L、KH2PO4 3 g/L、FeSO4·7H2O 120 mg/L、MnSO4·H2O 120 mg/L、ZnSO4·7H2O 6 mg/L、CuSO4·5H2O 6 mg/L、生物素2.4 mg/L、泛酸钙18 mg/L；发酵培养基：葡萄糖40 g/L、MgSO4 0.9 g/L、(NH4)2SO4 20 g/L、玉米浆粉12 g/L、KCl 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 120 mg/L、MnSO4·H2O 120 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.6 mg/L、CuSO4·5H2O 0.6 mg/L、生物素1 mg/L、泛酸钙5 mg/L；灭菌：121°C、15 min
2.3 培养条件
种子培养的制备：预培养在LBGB培养基中、30°C、200 rpm振荡条件下进行。种子培养在种子生物反应器中制备，接种200 mL预培养液（在LBGB中培养至OD562为6）。培养条件维持在33°C、溶解氧（DO）水平30–35%、pH 7.0（通过添加氨水自动调节）。培养持续至OD562达到53–55。5-L生物反应器发酵：将活化后的种子培养液以20%（v/v）的接种量转入含有发酵培养基的5-L生物反应器。基础发酵参数控制如下：温度37°C、通气速率恒定为3.0 vvm、DO 30–35%、pH 7.0（通过氨水自动调节）。初始碳源和氮源耗尽后启动补料分批策略。碳源补料为800 g/L葡萄糖溶液。0–18 h内，发酵液中残余葡萄糖浓度维持在1 g/L以下；18 h至发酵结束，维持在10 g/L以下。同时，以450 g/L (NH4)2SO4的氮源补料溶液维持NH4+浓度在0–18 h内低于1 g/L，18 h至发酵结束维持在1–2 g/L范围内。
【数据】预培养：LBGB、30°C、200 rpm；种子培养：33°C、DO 30–35%、pH 7.0、OD562至53–55；5-L发酵：接种量20%（v/v）、37°C、通气3.0 vvm、DO 30–35%、pH 7.0；碳源补料：800 g/L葡萄糖，0–18 h残糖<1 g/L，18 h后<10 g/L；氮源补料：450 g/L (NH4)2SO4，0–18 h NH4+<1 g/L，18 h后1–2 g/L
2.4 赖氨酸脱羧酶的全细胞催化筛选
使用质粒pCRB12在谷氨酸棒杆菌中过表达赖氨酸脱羧酶。携带重组质粒的菌株接种于LBGB培养基，在30°C、200 rpm条件下培养20 h。通过5000 rpm离心收集细胞，用PBS缓冲液洗涤两次，重悬获得湿菌体用于催化测定。反应混合物由5 mM L-赖氨酸、0.1 mM磷酸吡哆醛（PLP）和0.1 M磷酸钠-柠檬酸缓冲液（pH 5.6）组成，添加湿菌体（20 g/L）。反应在37°C下进行15 min，通过100°C煮沸3 min终止。混合物离心（12,000 rpm，10 min），上清液中L-赖氨酸和PDA浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定。酶活定义为37°C下每分钟产生1 μM PDA所需的湿菌体量。
【数据】培养：LBGB、30°C、200 rpm、20 h；收集：5000 rpm离心；反应体系：5 mM L-赖氨酸、0.1 mM PLP、0.1 M磷酸钠-柠檬酸缓冲液（pH 5.6）、湿菌体20 g/L；反应条件：37°C、15 min；终止：100°C煮沸3 min；离心：12,000 rpm、10 min；检测：HPLC
2.5 适应性实验室进化（ALE）提高PDA耐受性
底盘菌株（CCTCC 2023742）的过夜培养物用于接种三个250 mL摇瓶，每瓶在50 mL含30 g/L PDA的LBGB中起始OD562为0.2。培养前用HCl将培养基pH调至7.0。培养物在30°C、200 rpm条件下培养24 h，然后测定OD562。每次传代时，将细胞浓度最高的培养物转移至下一轮摇瓶培养。当最大OD562超过6.0时，在下一轮进化中额外添加5 g/L PDA。待细胞在70 g/L PDA下恢复生长后，从每瓶中选择24个单菌落进行70 g/L PDA胁迫测试，筛选出最佳9株菌FM1-9。随后，将抗性最好的三株菌（FM2、FM6和FM9）重新筛选用于重测序，以比较基因组突变。
【数据】起始条件：OD562 0.2、50 mL LBGB+30 g/L PDA、pH 7.0（HCl调节）；培养：30°C、200 rpm、24 h；传代规则：最高OD562培养物转移；PDA递增：OD562>6.0时每次+5 g/L；筛选：70 g/L PDA胁迫、每瓶24个单菌落、筛选9株（FM1-9）、选3株（FM2/FM6/FM9）重测序
2.6 细胞膜完整性分析
细胞完整性通过共聚焦荧光显微镜分析。在发酵过程中收集谷氨酸棒杆菌细胞，或在对数期培养后用不同浓度PDA在30°C、200 rpm振荡条件下处理。样品离心后用PBS（pH 7.4）洗涤两次。随后样品进行SYTOX Green和FM4-64染色20 min，置于载玻片上盖上盖玻片。SYTOX Green在细胞膜完整性受损时可穿透细胞并发出绿色荧光，常用作标记死细胞的荧光探针；FM4-64对膜结构具有高亲和力，在荧光显微镜下显示明亮的红色荧光信号，适用于实时观察和记录生物膜的动态变化。图像使用配备Nikon DS-Ri1相机的Nikon ECLIPSE 80i显微镜采集。
【数据】染色：SYTOX Green + FM4-64、20 min；PBS洗涤：pH 7.4、两次；处理条件：30°C、200 rpm；显微镜：Nikon ECLIPSE 80i + Nikon DS-Ri1相机
2.7 细胞活力测定
为评估发酵过程中不同阶段产生的PDA的细胞毒性，将来自生物反应器的细胞离心，用PBS缓冲液洗涤两次，重悬至OD562为0.2。然后向样品中加入3 μL碘化丙啶（PI）（生工生物，中国上海），在4°C、避光条件下孵育20 min。PI是一种核荧光染料，当细胞膜完整时不能进入细胞，也不与胞内DNA结合。然而，当细胞膜受损时，PI可穿透细胞，与胞内DNA结合并发出红色荧光。因此，使用流式细胞仪上的PE-Cy5-A红色通道（695/40 nm检测滤光片）检测样品中的死细胞数量。每个样品至少记录20,000个计数。数据使用CellQuest软件采集和分析。
【数据】样品制备：重悬至OD562 0.2；PI染色：3 μL、4°C、20 min、避光；检测：流式细胞仪PE-Cy5-A通道（695/40 nm）；计数：≥20,000 events/样品；软件：CellQuest
2.8 分析方法
OD使用分光光度计（Shimazu，日本）在562 nm处测定。氨氮测定：发酵液离心后，上清液与8 g/L NaCl溶液按1:1比例混合，使用E10铵离子分析仪（深圳斯曼科技有限公司）测定氨氮含量。残余葡萄糖使用M100生物传感器分析仪（深圳斯曼科技有限公司）定量。L-赖氨酸和PDA测定方法：样品首先用衍生化试剂二乙氧基甲基丙酸二乙酯（DEEMM）衍生化。随后样品在12,000 rpm离心5 min，经0.22 μm滤膜过滤。使用配备Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）的HPLC系统分析样品，柱温35°C。流动相由100%乙腈（A）和25 mmol/L乙酸钠溶液（pH 4.8）（B）组成，流速1.0 mL/min。溶剂梯度如下：0–2 min，20–25% A；2–20 min，25–60% A；20–25 min，60–20% A。胞内PDA和赖氨酸测定方法：将细胞调整至OD562为20，重悬于1.5 mL 0.9%（w/v）NaCl溶液中，然后使用高压匀浆机破碎。随后加入1/10（v/v）冷的100%三氯乙酸进行蛋白沉淀。样品涡旋1 min，冰上孵育15 min，然后在12°C下12,000 rpm离心。之后进行分析。
【数据】OD测定：562 nm、Shimazu分光光度计；氨氮：E10分析仪、上清:8 g/L NaCl=1:1；葡萄糖：M100生物传感器；HPLC：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、柱温35°C、流速1.0 mL/min、流动相A=100%乙腈、B=25 mmol/L乙酸钠（pH 4.8）；梯度：0–2 min 20–25% A、2–20 min 25–60% A、20–25 min 60–20% A；衍生化：DEEMM；离心：12,000 rpm、5 min；过滤：0.22 μm膜；胞内样品：OD562 20、1.5 mL 0.9% NaCl、高压匀浆破碎、1/10体积100%三氯乙酸、涡旋1 min、冰上15 min、12°C 12,000 rpm离心
研究结果
3.1 谷氨酸棒杆菌高效生产PDA的工程改造
LDC是PDA生物合成中的关键酶促步骤（图1a）。本研究以本实验室保存的赖氨酸超产谷氨酸棒杆菌菌株（CCTCC 2023742；赖氨酸产量数据见补充图1）作为LDC筛选的底盘。五种此前报道的高活性LDC——EcLdcC、EcCadA、HaLdcC、LdcEt和LdcAer——通过全细胞催化在谷氨酸棒杆菌CCTCC 2023742中进行评估。其中，HaLdcC表现出最高的相容性，比酶活达1450 U/mg（图1b）。
为优化表达，HaLdcC被整合到cgl0818基因组位点（一个已表征的中性位点），置于不同启动子（PH30、Ptrc和Psod；启动子强度数据见补充图2）控制下，构建菌株LF1.1–LF1.3。摇瓶发酵显示仅菌株LF1.3产生PDA，其中Psod驱动的HaLdcC表达获得5.6 g/L PDA，伴随7.9 g/L残余赖氨酸和0.17 g/g葡萄糖的产率。在5-L规模下，菌株LF1.3产生78.6 g/L PDA，产率0.18 g/g。低产率主要归因于碳通量流向副产物合成。定量分析鉴定出18.6 g/L乙酸、15.8 g/L N-乙酰-PDA、7.9 g/L乳酸、1.3 g/L丙酮酸和2.4 g/L α-酮戊二酸（补充图3）。为减少这些副产物，参与副产物形成的四个基因（pqo、ldh、ctf和cgl1527）被依次删除，构建菌株LF1.4–LF1.7（图2c）。在5-L发酵中，菌株LF1.7产生84.9 g/L PDA（图1e），总副产物降至<3 g/L（1.6 g/L乙酸和1.2 g/L乳酸）（补充图4）。
尽管有这些改进，菌株LF1.7的PDA产率仍然有限（0.27 g/g），主要原因是赖氨酸过量积累（38 g/L）。因此，增强LDC活性或减少赖氨酸外排被认为是进一步提高产率的有效策略。基于LF1.7，引入了额外的HaLdcC拷贝，构建菌株LF2.1（两个拷贝）和LF2.3（三个拷贝）。同时，进行了赖氨酸外排基因lysE的删除，构建菌株LF2.2和LF2.4。摇瓶发酵表明，增加HaLdcC拷贝数逐渐降低赖氨酸积累（从7.9 g/L降至不可检测水平），而PDA滴度增加（从5.8 g/L增至11.4 g/L）。然而，在LF2.2（双拷贝背景下删除lysE）中，细胞生长严重受损，最大OD降低42.6%，PDA滴度降低27.3%。此现象在以往研究中已有报道。为直接证明胞内赖氨酸积累导致观察到的生产和生长损伤，对LF1.7–LF2.4进行了胞内代谢物分析。结果显示仅在LF2.2中显著积累（补充图5）。这些发现表明，当LDC活性不足时，阻断赖氨酸外排导致胞内赖氨酸积累，从而损害生长和PDA生物合成。这一结论进一步得到以下事实的支持：在单拷贝菌株LF1.7中构建lysE删除衍生物的尝试未获成功。在5-L规模下，菌株LF1.7、LF2.1和LF2.4的PDA滴度相当（分别为84.9、86.6和86.1 g/L；图1e）。尽管滴度相对于LF1.7没有显著增加，但赖氨酸积累显著减少（分别为38 g/L、24 g/L和0 g/L），从而获得更高的PDA产率（0.27、0.29和0.32 g/g）。这些结果凸显了最小化赖氨酸积累对提高PDA产率的关键作用。值得注意的是，三株菌在发酵过程中均出现细胞密度急剧下降，其中LF2.4受影响最严重。OD562下降65.9%（从12 h时的150降至24 h时的51.1），这一现象在此前谷氨酸棒杆菌PDA发酵中未见报道。推测快速PDA积累——尤其是LF2.4（生产强度在30 h达到2.62 g/L/h）——施加了严重的代谢胁迫和毒性，从而损害了细胞活力。
【数据】LDC筛选：HaLdcC比酶活1450 U/mg；LF1.3摇瓶：5.6 g/L PDA、7.9 g/L残余赖氨酸、产率0.17 g/g；LF1.3 5-L：78.6 g/L PDA、产率0.18 g/g；副产物：乙酸18.6 g/L、N-乙酰-PDA 15.8 g/L、乳酸7.9 g/L、丙酮酸1.3 g/L、α-酮戊二酸2.4 g/L；LF1.7 5-L：84.9 g/L PDA、总副产物<3 g/L（乙酸1.6 g/L、乳酸1.2 g/L）、产率0.27 g/g、赖氨酸38 g/L；LF2.2：最大OD降低42.6%、PDA滴度降低27.3%；摇瓶拷贝数实验：赖氨酸7.9 g/L→不可检测、PDA 5.8→11.4 g/L；5-L比较：LF1.7 84.9 g/L（产率0.27 g/g、赖氨酸38 g/L）、LF2.1 86.6 g/L（产率0.29 g/g、赖氨酸24 g/L）、LF2.4 86.1 g/L（产率0.32 g/g、赖氨酸0 g/L）；LF2.4 OD562下降65.9%（150@12h→51.1@24h）；LF2.4生产强度：2.62 g/L/h@30h
3.2 发酵过程中PDA积累的毒性效应表征
从三个角度评估了发酵过程中PDA的抑制作用：PDA合成速率、细胞死亡率和细胞形态。在菌株LF2.4中，PDA合成速率在早期（0–24 h）稳定在2.9 g/L/h，但在24–48 h之间急剧下降至0.67 g/L/h（补充图6）。细胞死亡率从18 h的46%显著增加至24 h的76.5%（补充图7），与PDA生产停止的时间一致。扫描电子显微镜（SEM）揭示了渐进性细胞损伤（图2a）：0–4 h形态完整，12 h出现孔状损伤，12–20 h之间萎缩，24 h严重塌陷，此时几乎无完整细胞残留。为支持PDA毒性导致观察到的细胞损伤这一论点，我们与非生产底盘菌株进行了比较。在相同发酵条件下，底盘菌株在24 h和36 h均保持形态完整性（补充图8）。这一比较强化了我们的结论：观察到的损伤是由PDA毒性而非pH、DO或剪切力等其他因素引起的。这些结果表明，快速PDA积累对谷氨酸棒杆菌施加了严重的细胞毒性胁迫。
为研究发酵后期生产力损失和OD下降的原因，检测了胞内和胞外PDA积累。外源添加实验表明，PDA以浓度依赖性方式抑制生长（图2b）。在45 g/L PDA下，最大OD降低50.1%（IC50 = 33.5 g/L），在≥75 g/L时生长完全被抑制。然而，在对数中后期添加50或75 g/L PDA以模拟原位积累时，未观察到即时的OD下降，与发酵过程中观察到的急剧下降形成对比。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）证实暴露于75 g/L PDA 12 h后出现广泛膜损伤（图2c），尽管细胞死亡率（21%）仍显著低于发酵条件下可比PDA水平（27–30 h）时观察到的死亡率。这些发现表明，胞外PDA单独不能完全解释发酵相关的细胞毒性，且其主要引起生长抑制而非裂解性细胞死亡。胞内PDA的测定排除了内部积累的干扰，确认抑制效应可可靠地归因于胞外PDA胁迫（补充图9）。
因此推测胞内PDA积累施加了更强的毒性效应，可能还与赖氨酸积累协同作用（例如LF2.2中lysE删除后的生长缺陷；图1d）。进行了胞内代谢物分析，结果显示菌株LF1.7、LF2.1和LF2.4中均无显著赖氨酸积累（补充图10），排除了胞内赖氨酸作为细胞死亡的原因。相比之下，这些菌株在发酵早期和中后期均观察到显著的胞内PDA积累，最大值随赖氨酸脱羧酶（HaLdcC）表达盒拷贝数的增加而增加：分别为7.90、9.13和13.41 mg/L/OD（图1e）。菌株LF2.4表现出最高的胞内PDA积累，在44 h达到峰值13.41 mg/L/OD——是12 h时的10.3倍。胞内PDA的增加与OD562在12–18 h之间的快速下降同步，表明细胞裂解和死亡。尽管PDA呈强碱性，但胞内pH维持在7左右（补充图11），排除了pH扰动作为致死的主要原因。
【数据】LF2.4合成速率：0–24 h为2.9 g/L/h、24–48 h降至0.67 g/L/h；死亡率：18 h为46%、24 h为76.5%；外源PDA抑制：45 g/L时最大OD降低50.1%、IC50=33.5 g/L、≥75 g/L完全抑制；CLSM：75 g/L PDA暴露12 h、死亡率21%（vs 发酵27–30 h）；胞内PDA峰值：LF1.7为7.90 mg/L/OD、LF2.1为9.13 mg/L/OD、LF2.4为13.41 mg/L/OD（44 h，12 h的10.3倍）；胞内pH：约7
讨论与解读
本研究通过组合HaLdcC表达与副产物形成消除，将碳通量重定向至PDA生物合成，构建了高产PDA的谷氨酸棒杆菌菌株（图6）。系统表征了PDA的胞内和胞外毒性，识别了限制生产的瓶颈。为克服这些限制，通过理性和半理性工程获得了PDA耐受变异株，并优化CgmA转运体获得外排增强突变体。将该转运体变体引入生产菌株后，胞内代谢毒性得到缓解，发酵性能得以提升。经过工艺优化，工程菌株LF6.1在5-L生物反应器中实现130 g/L PDA，生产强度3.94 g/L/h，产率0.40 g/g。这些结果代表了迄今报道的最高PDA发酵性能（表1），并提示胞内和胞外毒性的协同缓解策略可推广至1,4-二氨基丁烷、1,6-二氨基己烷和戊二酸等化学品。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于将"耐受性工程"从单一维度扩展为"胞内+胞外"双管齐下的系统策略：ALE进化发掘新靶点cgl1283解决胞外胁迫，转运体工程改造CgmA缓解胞内积累，两者协同才突破了130 g/L的产量天花板。这种"从发酵现象出发、回到机制解析"的闭环思路——先观察细胞死亡与形态损伤，再区分胞内外毒性贡献，最后针对性设计改造方案——对其它高毒性化学品的微生物生产具有方法论价值。值得注意的是，胞外PDA浓度50-75 g/L时细胞死亡率仅21%，而发酵条件下却高达76.5%，这一差异凸显了仅靠胞外耐受策略的局限，也解释了为何ALE筛选到的靶点必须与外排转运体改造联用才能发挥最大效果。后续研究若能进一步解析CgmA突变体的结构-功能关系，或可推动理性设计更高效的外排系统。
参考来源
Song L. Engineering Corynebacterium glutamicum for 1,5-pentanediamine production via enhanced product tolerance and efflux transport. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134178
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134178