来源：Engineering compartmentalized utilization of glycerol with glucose for high-level chondroitin production in Corynebacterium glutamicum（Carbohydrate Polymers）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
软骨素硫酸盐是重要的糖胺聚糖，传统提取依赖动物组织，微生物合成提供了可持续替代方案，但产量低下长期制约其产业化。本研究以谷氨酸棒杆菌为底盘，通过敲除乳酸和乙酸合成途径、阻断糖酵解、引入经RBS文库优化的甘油利用途径，构建了葡萄糖-甘油并行碳代谢系统，并强化氧化还原稳态以缓解代谢压力。最终工程菌株CgC40在5 L发酵罐中产量达12.37 ± 0.51 g/L，碳源得率102.94 ± 4.90 mg/g，较亲本分别提升24.20%和30.07%，为迄今报道的最高水平。多组学分析证实了软骨素合成增强与TCA循环活性降低的同步发生。
研究背景
软骨素硫酸盐因抗炎、保护软骨和润滑关节等功能，在生物医药、营养保健品和功能性食品领域应用广泛，临床覆盖骨关节炎治疗、组织工程支架构建及药物递送系统设计。然而，全球需求持续增长却仍高度依赖鲨鱼软骨、牛气管等动物源提取。该方法面临不可持续、批次差异大、病原体或残留抗生素污染风险等关键限制，且多步纯化推高成本，与绿色制造理念相悖，制约商业化规模扩大。
微生物合成因此成为可持续替代方案。一步法微生物合成软骨素硫酸盐通常硫酸化程度和产量均较低，两步法策略——先由微生物生产未硫酸化的软骨素前体，再经磺基转移酶进行酶法硫酸化——日益受到关注。然而，软骨素产量低下仍是高效生物合成的核心瓶颈。本研究旨在构建高效的谷氨酸棒杆菌细胞工厂，通过系统的代谢重编程提升软骨素产量。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
本研究所用质粒和菌株详见表S1。pXMJ19质粒作为表达载体。谷氨酸棒杆菌中靶向乳酸和乙酸合成途径及碳分配的基因敲除采用pK18mobsacB自杀载体系统。质粒构建使用Gibson Assembly® Master Mix（NEB，美国）。质粒在大肠杆菌DH5α中扩增后，用质粒小提试剂盒（天根生化，中国）提取。构建好的质粒在优化条件（1800 V，5 ms脉冲）下电转化至谷氨酸棒杆菌。
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌DH5α在LB培养基中37°C培养，固体培养基含15 g/L琼脂。质粒扩增时，菌株在含5 mL液体培养基的试管中200 rpm振荡培养。谷氨酸棒杆菌在LBB培养基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母提取物5 g/L，脑心浸液10 g/L）中培养，转化子在LBB琼脂平板（15 g/L琼脂）上筛选。液体培养（试管中5 mL工作体积）于30°C、250 rpm振荡培养。
软骨素发酵包含三个阶段：活化、种子液培养和生产发酵。活化从−80°C冷冻保存的甘油菌种划线接种至LBB琼脂平板开始，随后30°C静置培养36 h以恢复代谢活性。种子液在30°C、250 rpm振荡培养至对数生长后期（OD₆₀₀ ≈ 22.0）。发酵培养基采用前期优化的组成（Shi et al., 2025）。批次发酵采用500 mL锥形瓶、80 mL工作体积，条件同上（30°C，250 rpm）。补料分批发酵采用5 L生物反应器（百仑生物，中国），工作体积2.5 L。碳源浓度通过反馈控制补料动态维持，60%（w/v）葡萄糖溶液间歇补充以维持残余碳低于10 g/L。同时，通过自动添加14%（v/v）氨水维持pH为6.9 ± 0.1，兼作补充氮源。如需要，培养基中添加抗生素和诱导剂，浓度如下：卡那霉素25 mg/L、氯霉素12.5 mg/L、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）0.1 mM。
2.3 谷氨酸棒杆菌甘油代谢途径的构建
编码肺炎克雷伯氏菌甘油脱氢酶（dhaD）和弗氏柠檬酸杆菌二羟丙酮激酶（dhaK）的密码子优化基因由金唯智生物（苏州，中国）基于大肠杆菌密码子偏好性合成。dhaD、dhaK和glpF（编码大肠杆菌甘油易化蛋白）片段经PCR扩增后依次连接至pXMJ19。每个基因前均添加RBS序列AAAGGAGGACAACC，生成质粒pXMJ19-DKF。dhaD、dhaK和glpF的RBS采用前期描述的方案（Shi et al., 2025; Wei et al., 2022）进行工程改造，将天然序列替换为简并的AAAGGANNNNNNNN变体。修饰后的片段通过Gibson组装连接至线性化的pXMJ19，所得质粒转化至大肠杆菌DH5α，构建含不同RBS的质粒文库，包含超过10⁴个单克隆。随后将质粒文库电转化至CgC33。转化细胞在以甘油（10 g/L）为唯一碳源的CGXII基本培养基中连续培养10代。每24 h转接一次至新鲜培养基，并在每次转接时测定OD₆₀₀（图S1A）。经10轮连续传代后，甘油利用能力增强的变体成为优势群体。适应培养物经梯度稀释后涂布于甘油基琼脂平板，30°C培养72 h。根据菌落大小，选取10个大型菌落变体提取基因组DNA并进行Sanger测序。所选10个变体培养12 h后的OD₆₀₀值见图S1B。测序分析详见表S2。整体流程示意图见图3A。
2.4 谷氨酸棒杆菌生长曲线测定
谷氨酸棒杆菌生长动力学在5 L生物反应器（2.5 L工作体积）中使用限定成分CGXII基本培养基（碳源10 g/L，硫酸铵20 g/L，尿素5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，CaCl₂ 10 mg/L，MgSO₄ 125 mg/L，FeSO₄∙7H₂O 10 mg/L，MnSO₄∙H₂O 10 mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 1 mg/L，CuSO₄ 2 mg/L，NiCl₂∙6H₂O 2 mg/L，原儿茶酸30 mg/L，生物素2 mg/L，维生素B1 1 mg/L，MOPS 42 g/L）分析，并根据实验需要补充不同碳源。操作条件：30°C，溶解氧维持在饱和度30%以上；用1 M HCl和NaOH维持pH为6.9 ± 0.1。定期取样测定OD₆₀₀和残余碳含量。
2.5 代谢物、底物含量及重均摩尔质量的测定
发酵液中乳酸和乙酸浓度采用HPLC（Aminex® HPX-87H色谱柱，7.8 × 300 mm；Bio-Rad）测定，UV检测波长210 nm。等度洗脱采用0.005 M硫酸（HPLC级）流动相，流速0.6 mL/min。柱温箱温度维持在65°C以提高分离度。细胞干重（CDW）由光密度值经预校准的公式换算：CDW（g/L）= 0.25 × OD₆₀₀（Wei et al., 2022）。葡萄糖和甘油浓度按照已发表方法（Wu et al., 2021）采用HPLC-RID测定。软骨素含量采用咔唑-硫酸法测定（Shi et al., 2025）。重均摩尔质量采用SEC-MALS按照既定流程（Shi et al., 2025）测定，分析所用dn/dc值为0.16 mL/g。
2.6 NAD⁺/NADH和NADP⁺/NADPH比值测定
细胞内NAD⁺、NADH、NADP⁺和NADPH采用商业酶法试剂盒（碧云天生物，上海，中国）定量。在对数生长期通过离心（12,000 ×g，4°C，10 min）收集细胞，用冰预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后立即投入液氮淬灭。淬灭的细胞沉淀在预冷提取缓冲液（试剂盒提供）中机械匀浆，随后按照制造商方案进行代谢物提取和定量。
2.7 转录组学研究和中心碳代谢分析
菌株在含80 mL优化培养基的500 mL锥形瓶中、标准批次发酵条件下（30°C，250 rpm）培养。接种后36 h，无菌收集发酵液。菌体立即通过离心（5000 ×g，10 min，4°C）收获，用冰预冷PBS洗涤三次并调整至相同OD₆₀₀值，随后液氮速冻。总RNA使用RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit（天根生化）提取，并在Illumina NovaSeq 6000平台（诺禾致源，中国）上测序。靶向代谢组学由百趣生物（上海，中国）采用HPLC-MS/MS（Thermo Fisher Scientific）联用AB SCIEX 6500 QTRAP+质谱仪完成。代谢物在IonPac AS11-HC分析柱（2 × 250 mm）上分离，配AG11-HC保护柱（2 × 50 mm），柱温25°C。电喷雾电离（ESI）以多反应监测（MRM）模式运行。
2.8 透射电子显微镜（TEM）分析
培养60 h的细菌样品收集后用PBS洗涤两次，2.5%戊二醛4°C固定12 h。随后用1%四氧化锇进行后固定。样品经梯度乙醇系列脱水后包埋于EPON 812树脂中。制备80 nm超薄切片。
【数据】电转化条件：1800 V，5 ms脉冲；大肠杆菌培养：LB培养基，37°C；谷氨酸棒杆菌培养：LBB培养基，30°C，250 rpm；活化时间：36 h；种子液OD₆₀₀：≈22.0；批次发酵：500 mL锥形瓶/80 mL工作体积；补料分批：5 L反应器/2.5 L工作体积；补糖：60%（w/v）葡萄糖，残余碳<10 g/L；pH：6.9 ± 0.1（14%氨水自动调节）；抗生素：卡那霉素25 mg/L，氯霉素12.5 mg/L；IPTG：0.1 mM；RBS序列：AAAGGAGGACAACC；简并RBS：AAAGGANNNNNNNN；质粒文库规模：>10⁴克隆；甘油适应性进化：10 g/L甘油为唯一碳源，10代，每24 h转接；菌落筛选：30°C培养72 h；CGXII培养基组分：碳源10 g/L，硫酸铵20 g/L，尿素5 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，CaCl₂ 10 mg/L，MgSO₄ 125 mg/L，FeSO₄∙7H₂O 10 mg/L，MnSO₄∙H₂O 10 mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 1 mg/L，CuSO₄ 2 mg/L，NiCl₂∙6H₂O 2 mg/L，原儿茶酸30 mg/L，生物素2 mg/L，维生素B1 1 mg/L，MOPS 42 g/L；生长条件：30°C，溶解氧>30%饱和度，pH 6.9 ± 0.1（1 M HCl/NaOH）；HPLC条件：Aminex® HPX-87H柱，210 nm，0.005 M硫酸，0.6 mL/min，65°C；CDW换算：CDW (g/L) = 0.25 × OD₆₀₀；SEC-MALS dn/dc：0.16 mL/g；辅酶测定：12,000 ×g，4°C，10 min离心；转录组取样：36 h，5000 ×g，10 min，4°C；TEM固定：2.5%戊二醛，4°C，12 h；后固定：1%四氧化锇；切片厚度：80 nm
研究结果
3.1 阻断副产物合成以增强葡萄糖代谢
在前期研究中，工程菌株谷氨酸棒杆菌CgC25在补料分批发酵中实现了89.23 ± 0.18 mg/g葡萄糖的软骨素得率。这表明大量碳流向副产物或其他途径，这是微生物合成糖胺聚糖中普遍存在的挑战（Hu et al., 2022; Shi et al., 2025）。乳酸和乙酸是主要副产物。乳酸的产生主要来源于丙酮酸经NAD⁺依赖的乳酸脱氢酶（由ldh编码）催化。如图1所示，乙酸生物合成通过三条平行途径发生：（i）丙酮酸经丙酮酸氧化酶（由poxB编码）氧化脱羧，（ii）磷酸转乙酰酶/乙酸激酶途径（由pta和ackA编码），（iii）乙酰辅酶A经乙酰辅酶A水解酶（由coaT编码）水解。
为减少碳分流，通过系统性途径失活依次构建了衍生菌株。菌株CgC29通过在CgC25中敲除ldh构建，以消除乳酸产生。从CgC29中依次敲除poxB、ackA、pta和coaT，生成菌株CgC30-CgC33，从而完全阻断竞争性的乳酸和乙酸生物合成途径。
对菌株CgC25、CgC29和CgC33中乳酸和乙酸积累的实时定量揭示了明显的碳重新分配模式。与亲本菌株CgC25相比，不含乳酸合成途径的菌株CgC29乳酸积累明显降低（图2A）。在48 h时，最大乳酸积累仅为214.22 ± 28.47 mg/L，仅为CgC25的25.14%。值得注意的是，ldh基因敲除意外地增加了乙酸浓度（图2B），表明代谢通量从PEP向乙酸合成重定向作为一种补偿机制（Valle et al., 2019）。在48 h时测定了菌株CgC30-CgC33中的乙酸浓度，结果显示各突变株中乙酸呈依次降低趋势（图2C）。值得注意的是，CgC33有效降低了乳酸和乙酸两者的积累（图2B）。
摇瓶批次发酵表明，软骨素产量（CgC25：2.34 ± 0.10 g/L；CgC29：2.41 ± 0.08 g/L；CgC33：2.38 ± 0.01 g/L）和CDW均无统计学显著差异（图2D），证实乳酸和乙酸途径的缺失并未损害软骨素的生物合成能力或细胞生长。图2E显示了发酵过程中葡萄糖含量和CDW的变化。发酵72 h后，三株菌的CDW无显著差异。菌株CgC33的葡萄糖消耗速率最慢。发酵结束时，CgC33的葡萄糖消耗量为34.67 ± 1.84 g/L，较CgC25降低了13.25%。
与先前通过破坏溢流代谢增强次级代谢物合成的研究不同（Yao et al., 2023; Zhang et al., 2014），在谷氨酸棒杆菌中敲除乳酸和乙酸合成途径未能提高软骨素产量。然而，针对性地破坏乳酸和乙酸合成途径确实提高了谷氨酸棒杆菌中软骨素的得率。如图2F所示，菌株CgC33实现了68.65 ± 0.29 mg/g葡萄糖的比得率，较CgC25（59.24 ± 2.53 mg/g葡萄糖）提高了15.88%。但得率提升幅度有限。一个可能的解释是，从副产物形成中节省的碳可能主要被导向TCA循环，而非有效流向UDP-前体合成，表明代谢重定向并未完全优化。预计通过减少流向TCA循环的通量可以进一步节约碳。
在谷氨酸棒杆菌中，胞外多糖是UDP-糖前体的主要消耗者。糖基转移酶基因cg0420（推定阿拉伯糖基转移酶）和cg0424（推定甘露糖基转移酶）位于与阿拉伯甘露聚糖和甘露聚糖合成相关的基因组簇中。前期研究已证明，敲除cg0420和cg0424可增强透明质酸产量（Wang et al., 2020）。因此，推测敲除这些基因可增强软骨素合成的前体可用性。为验证这一假设，在菌株CgC33中依次敲除cg0420和cg0424，生成菌株CgC34和CgC35。与预期相反，CgC34和CgC35的发酵结果显示软骨素产量显著降低，分别较CgC33下降了12.97%和23.85%（图S2）。因此，敲除cg0420和cg0424的主要效应很可能是扰乱了必需细胞稳态，而非预期的前体节约。
【数据】CgC25得率：89.23 ± 0.18 mg/g葡萄糖；CgC29最大乳酸积累（48 h）：214.22 ± 28.47 mg/L，为CgC25的25.14%；软骨素产量：CgC25为2.34 ± 0.10 g/L，CgC29为2.41 ± 0.08 g/L，CgC33为2.38 ± 0.01 g/L；CgC33葡萄糖消耗量（72 h）：34.67 ± 1.84 g/L，较CgC25降低13.25%；CgC33比得率：68.65 ± 0.29 mg/g葡萄糖，较CgC25（59.24 ± 2.53 mg/g葡萄糖）提高15.88%；CgC34产量较CgC33降低12.97%；CgC35产量较CgC33降低23.85%
3.2 构建甘油和葡萄糖平行代谢途径实现软骨素区室化生产
#### 3.2.1 甘油代谢途径的构建
为最大化葡萄糖向软骨素合成的分配，抑制糖酵解途径和PPP是合理策略。然而，这需要添加一条替代代谢途径，以在正常糖加工途径被破坏时维持细胞正常功能。甘油是首选候选物，因为它直接进入中心代谢，绕过糖酵解上游途径和PPP，且市场价格低廉。在谷氨酸棒杆菌中，甘油利用通过两步酶促转化为磷酸二羟丙酮（DHAP），随后进入糖酵解途径（图1）。尽管谷氨酸棒杆菌含有与甘油代谢相关的基因，但其天然菌株CgC33缺乏功能性甘油分解代谢能力。
为解决这一限制，将携带异源甘油利用基因（dhaD、dhaK和glpF）的pXMJ19电转化至CgC33，生成CgC36。其生长动力学（图3B）表明，CgC36在22 h内消耗了10 g/L甘油。为提高谷氨酸棒杆菌中甘油代谢效率，采用RBS依赖性途径优化策略对甘油途径进行优化。该策略包括RBS文库构建、连续传代富集、单菌落筛选和测序等连续步骤，详见方法2.3和图3A。通过系统筛选，鉴定出dhaD（AAAGGACCTCGGCA）、dhaK（AAAGGATTACGGGT）和glpF（AAAGGACCAGGATG）上游的优化RBS序列，并引入CgC33，生成CgC37。这些工程化的RBS变体预计可优化翻译起始效率，从而协调dhaD、dhaK和glpF的表达水平，实现代谢通量平衡并减少中间代谢物积累。
如图3C所示，CgC37表现出强劲生长，在16 h内完全消耗10 g/L碳源，明显快于CgC36。CgC37的最大比生长速率（μmax）为0.39 h⁻¹，超过CgC36的0.28 h⁻¹。值得注意的是，CgC37的最终OD₆₀₀达到21.16 ± 0.28，与CgC36相当，表明两株菌的生物量得率无显著差异。这些结果表明，RBS优化显著提高了CgC37的甘油利用效率。RBS依赖性途径优化策略能够对多基因进行精细翻译调控，实现协调表达，在优化途径基因表达的同时最小化反馈抑制和代谢物毒性（Shi et al., 2025; Wei et al., 2022）。
为研究菌株CgC37中甘油和葡萄糖的共利用情况，在培养基中补充不同甘油:葡萄糖比例（7:3、5:5和3:7）的混合碳源。这些条件下的碳源消耗和CDW积累动态曲线详见图3D-F。谷氨酸棒杆菌同时消耗两种碳源。
【数据】CgC36甘油消耗时间：22 h消耗10 g/L；CgC37甘油消耗时间：16 h消耗10 g/L；CgC37 μmax：0.39 h⁻¹；CgC36 μmax：0.28 h⁻¹；CgC37最终OD₆₀₀：21.16 ± 0.28；优化RBS序列：dhaD为AAAGGACCTCGGCA，dhaK为AAAGGATTACGGGT，glpF为AAAGGACCAGGATG；混合碳源比例：7:3、5:5、3:7
#### 3.2.2 阻断糖酵解和PPP以建立平行代谢途径
（原文此节内容未在节选范围内完整呈现，以下按原文节选可获取内容翻译）
（此节原文节选未完整包含，按可获取内容处理）
#### 3.2.3 通过辅因子调控恢复代谢稳态
（原文此节内容未在节选范围内完整呈现，以下按原文节选可获取内容翻译）
3.3 转录组学和中心碳代谢分析
在混合碳源培养基（葡萄糖:甘油 = 1:1）中培养的菌株CgC25和工程菌株CgC40的比较转录组学分析如图5所示。绿色箭头表示基因过表达的反应；红色箭头表示被破坏的反应。数据以平均值±SD表示。
菌株CgC25和工程菌株CgC40在混合碳源培养基（葡萄糖:甘油 = 1:1）中培养的中心碳代谢分析如图6所示。绿色箭头表示基因过表达的反应；红色箭头表示被破坏的反应。数据以平均值±SD表示。
【数据】混合碳源比例：葡萄糖:甘油 = 1:1；数据表示方式：平均值±SD
3.4 5 L发酵罐补料分批发酵性能
菌株CgC25、CgC40和CgC41在5 L发酵罐中的补料分批发酵性能如图7所示。（A）菌株CgC25，以葡萄糖为碳源；（B）菌株CgC40，以葡萄糖和甘油为碳源；（C）菌株CgC41，以葡萄糖和甘油为碳源。数据以平均值±SD表示。
最终工程菌株CgC40实现了12.37 ± 0.51 g/L的软骨素产量，碳源得率为102.94 ± 4.90 mg/g碳源，较亲本菌株CgC25分别提高了24.20%和30.07%。该产量为迄今报道的最高水平。
TEM分析显示Cg（野生型）、CgC25和CgC40细胞的代表性显微照片。红色箭头指示胞内软骨素。CgC40细胞中软骨素的胞内储存容量接近最大，导致严重的形态学不规则。
【数据】CgC40产量：12.37 ± 0.51 g/L；碳源得率：102.94 ± 4.90 mg/g碳源；较CgC25提高：24.20%（产量）和30.07%（得率）
讨论与解读
本研究在产软骨素菌株CgC25中实施了"开源节流"策略，以提升软骨素的产量和得率。敲除竞争途径并建立甘油-葡萄糖共利用系统提高了碳效率和软骨素产量。在工程菌株CgC40中，代谢通量被重定向至软骨素合成，同时伴随TCA循环活性降低。该策略最终在补料分批发酵中实现了12.37 g/L的软骨素产量（提高24.20%），为迄今报道的最高微生物产量。软骨素得率也提高了30.07%。TEM分析表明，软骨素的胞内储存容量正接近最大值，导致严重的形态学不规则。这些发现提示，仅聚焦于提高胞内产量的传统代谢工程策略已到达固有局限。未来研究应转向整合多维度策略：第一，实施形态工程以增加细胞体积或改变细胞形态，从而增强胞内储存能力；第二，优化高密度发酵工艺以提高整体生物量产率和生产稳定性；第三，开发高效分泌机制，如工程化软骨素合酶使其具备跨膜分泌能力。
编译者解读
该研究最值得称道之处在于"开源"与"节流"的同步推进——既敲除副产物途径减少碳流失，又引入非天然甘油利用途径绕开被阻断的糖酵解上游，形成葡萄糖-甘油双碳源并行代谢格局。RBS文库与连续传代筛选的组合策略使异源途径快速适配宿主代谢背景，体现了合成生物学中"定向进化+理性设计"融合的方法论价值。然而，TEM揭示的胞内储存空间饱和问题提示，单纯强化合成通量存在天花板效应。未来若能将代谢工程与形态工程（如增大细胞体积）或分泌工程结合，有望突破当前产量瓶颈。该策略对其它UDP-糖衍生高价值产物的微生物合成具有借鉴意义。
参考来源
Shi, Z. Engineering compartmentalized utilization of glycerol with glucose for high-level chondroitin production in Corynebacterium glutamicum. Carbohydrate Polymers, 2026. DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.124946
DOI: 10.1016/j.carbpol.2026.124946