底物信息指导的谷氨酸棒状杆菌代谢工程

来源：Substrate-informed metabolic engineering of Corynebacterium glutamicum enables balanced glucose–xylose co-utilization for the valorization of lignocellulosic feedstocks（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

木质纤维素及造纸废弃物水解液中的葡萄糖与木糖共利用，长期受制于碳代谢物阻遏效应导致的底物层级利用。本研究以纸板水解液（CBH）中4:1的葡萄糖:木糖组成为设计依据，在谷氨酸棒状杆菌中构建了34株工程菌，系统优化木糖异构酶途径与转运蛋白，最终获得不依赖转录调控、由动力学平衡驱动的稳定共利用菌株XYL-6A，并成功应用于L-赖氨酸生产。

研究背景

木质纤维素和造纸来源水解液中的主要糖类为葡萄糖与木糖，二者的同步利用是微生物代谢工程领域的核心难题。多数微生物存在严格的底物层级利用现象，由碳代谢物阻遏（CCR）调控——葡萄糖优先被消耗，木糖等其他糖类的摄取和分解受到抑制。这种调控逻辑虽有利于微生物在自然环境中的生存竞争，却严重限制了工业生物加工中混合糖原料的利用效率。造纸和纸板废弃物是极具潜力的资源：尽管回收率较高，每年仍有数百万吨不可回收材料产生。这些残余物流经酶解后可获得纸板水解液（CBH），其葡萄糖与木糖比例稳定在约4:1（木糖:葡萄糖=0.25），与半纤维素纤维组成一致，是可持续生物制造的重要碳源。谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）作为稳健的工业微生物平台，具备利用此类底物的潜力。

研究方法

2.1 菌株、质粒与基因

C. glutamicum 菌株 DSM 20300（ATCC 13032）和 LYS-12 来自前期工作（Becker et al., 2011）。质粒扩增以 E. coli DH10B（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）为宿主菌。X. campestris（DSM 3586）、L. brevis（DSM 20054）和 C. phytofermentans（DSM 18823）的基因组 DNA 购自德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ, Braunschweig, Germany）。E. coli K-12 MG1655（Hoffmann et al., 2018）和 B. subtilis 168（Kohlstedt et al., 2014）来自前期工作，用于基因组 DNA 提取。C. glutamicum 的游离基因表达使用质粒 pClik5a MCS（Buschke et al., 2011）。本研究构建和分析的所有 C. glutamicum 菌株列于表1，所有质粒列于表 S1（补充文件1）。

【数据】菌株：C. glutamicum DSM 20300、LYS-12；宿主菌：E. coli DH10B；供体菌：X. campestris DSM 3586、L. brevis DSM 20054、C. phytofermentans DSM 18823、E. coli K-12 MG1655、B. subtilis 168；质粒：pClik5a MCS

2.2 基因工程

克隆策略使用 SnapGene 软件（6.1版，GSL Biotech, Chicago, IL, USA）设计，操作流程参照前期报道（Rohles et al., 2016）。DNA 片段通过 PCR 从基因组 DNA 扩增，使用特异性引物和 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（New England Biolabs, Frankfurt am Main, Germany）。质粒载体用限制性内切酶 BamHI（FastDigest, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）线性化。PCR 产物与线性化载体通过 Gibson assembly（Gibson et al., 2009）进行体外组装。构建的质粒通过热激转化（Inoue et al., 1990）导入 E. coli DH10B，通过电转化（Becker et al., 2010）导入 C. glutamicum。构建完整性通过菌落 PCR 验证（Phire Green Hot Start II PCR Master Mix, Thermo Fisher Scientific），并经 Sanger 测序确认（Azenta, Chelmsford, MA, USA）。为在 C. glutamicum 中实现木糖利用，构建了多种操纵子并通过质粒 pClik5α 表达。操纵子在基因顺序、基因拷贝数和启动子强度上有所不同，置于 Ptuf 启动子（Becker et al., 2005）、Psod 启动子（Becker et al., 2007）或突变型 Psod 变体（命名为 Psod,opt；Pauli et al., 2023）的控制之下。多基因构建体用串联基因符号表示（如 xylABE、xylAAB、xylABB），表示操纵子按所列顺序包含各基因，每个基因间由合成核糖体结合位点隔开。例如，xylABE 编码 xylA–xylB–xylE，而 xylAAB 和 xylABB 分别包含 xylA 或 xylB 的重复拷贝。

【数据】工具酶：BamHI（FastDigest）；PCR 酶：Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer、Phire Green Hot Start II PCR Master Mix；组装方法：Gibson assembly；转化方法：热激转化（E. coli）、电转化（C. glutamicum）；启动子：Ptuf、Psod、Psod,opt

2.3 培养基

C. glutamicum 的第一次预培养在 BHI 培养基（37 g L⁻¹ Brain Heart Infusion；Becton Dickinson, Heidelberg, Germany）中进行。第二次预培养和主培养使用确定成分的极限培养基。每升培养基含：20 g 葡萄糖、5 g 木糖、15 g (NH₄)₂SO₄、1 g NaCl、200 mg MgSO₄·7H₂O、55 mg CaCl₂、20 mg FeSO₄·7H₂O、1 mg 盐酸硫胺素、1 mg 泛酸钙、0.5 mg 生物素、100 mL 2 M 磷酸钾缓冲液（pH 7.8）、10 mL 微量元素溶液（200 mg L⁻¹ FeCl₃·6H₂O、200 mg L⁻¹ MnSO₄·H₂O、50 mg L⁻¹ ZnSO₄·7H₂O、20 mg L⁻¹ CuCl₂·2H₂O、20 mg L⁻¹ Na₂B₄O₇·10H₂O、10 mg L⁻¹ (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O；用 HCl 调至 pH 1.0）以及 30 μg L⁻¹ 3,4-二羟基苯甲酸。为维持质粒，培养基中添加 50 μg mL⁻¹ 相应抗生素。固体培养基在液体配方中添加 20 g L⁻¹ Difco 琼脂（Becton Dickinson）。在底物组成影响实验中，极限培养基补充确定的葡萄糖–木糖混合物。除非另有说明，标准条件含 20 g L⁻¹ 葡萄糖和 5 g L⁻¹ 木糖（反映纸板水解液 4:1 的特征比例）。另配制不同葡萄糖:木糖比例的混合物，覆盖从 100% 葡萄糖（25 g L⁻¹）到 100% 木糖（25 g L⁻¹）的全范围，中间条件含 25%、50% 或 75% 木糖，总糖浓度恒定为 25 g L⁻¹。不可回收纸和纸板废弃物来自 Renasci NV（Ostend, Belgium），经酶解、过筛、过滤和浓缩处理（由 Bio Base Europe Pilot Plant, BBEPP, Ghent, Belgium 完成）。浓缩水解液含葡萄糖 363.7 g L⁻¹ 和木糖 83.8 g L⁻¹（4:1 比例），另含乳酸 19.6 g L⁻¹ 和乙酸 6.2 g L⁻¹。使用前，水解液经滤膜除菌并以 5%（v/v）稀释于极限培养基中，以提供与确定条件相当的糖浓度。

【数据】葡萄糖：20 g L⁻¹；木糖：5 g L⁻¹；(NH₄)₂SO₄：15 g L⁻¹；MgSO₄·7H₂O：200 mg L⁻¹；CaCl₂：55 mg L⁻¹；FeSO₄·7H₂O：20 mg L⁻¹；磷酸钾缓冲液：2 M，pH 7.8；抗生素：50 μg mL⁻¹；CBH 浓缩液：葡萄糖 363.7 g L⁻¹、木糖 83.8 g L⁻¹、乳酸 19.6 g L⁻¹、乙酸 6.2 g L⁻¹；CBH 使用浓度：5%（v/v）

2.4 摇瓶培养

菌株划线于 BHI 琼脂平板，30°C 培养 24 h。挑取单菌落接种第一次预培养（100 mL 带挡板摇瓶装 10 mL BHI），在旋转摇床（230 rpm，85% 湿度；Multitron, Infors AG, Bottmingen, Switzerland）上 30°C 培养 8–16 h。离心收集细胞（3 min，8800×g，室温），用于接种第二次预培养（250 mL 带挡板摇瓶装 25 mL 极限培养基），培养条件同上。指数生长中期再次离心收集细胞（3 min，8800×g，室温），接种主培养至初始 OD₆₆₀ 为 0.5。主培养设三次生物学重复（250 mL 带挡板摇瓶装 25 mL），30°C 旋转摇床，条件同上。

【数据】温度：30°C；转速：230 rpm；湿度：85%；离心：3 min，8800×g；初始 OD₆₆₀：0.5；生物学重复：3次

2.5 微生物反应器培养

不同葡萄糖–木糖比例的培养基测试使用微生物反应器系统（BioLector; Beckman Coulter GmbH, Baesweiler, Germany），操作条件为 1300 rpm、30°C、85% 相对湿度（Kohlstedt et al., 2018）。培养在 48 孔微量滴定板中进行，在线监测 620 nm 处细胞生长（OD₆₂₀）（Becker et al., 2018）。每孔装 1 mL 含确定葡萄糖和木糖浓度的极限培养基。预培养步骤同上。主培养接种至初始 OD₆₆₀ 为 0.5。

【数据】转速：1300 rpm；温度：30°C；相对湿度：85%；每孔体积：1 mL；检测波长：620 nm；初始 OD₆₆₀：0.5

2.6 细胞浓度、底物和产物的定量

细胞浓度通过分光光度法测定 660 nm 处光密度（OD₆₆₀）确定。细胞干重（CDM）浓度根据先前确定的相关系数由 OD₆₆₀ 计算（CDM [g L⁻¹] = 0.32 × OD₆₆₀）（Rohles et al., 2016）。葡萄糖和木糖通过 HPLC 定量，使用 Agilent 1260 Infinity Series 系统（Agilent Technologies）（Rohles et al., 2016）。分离在 MetaCarb 87C 色谱柱（300 × 7.8 mm，85°C；Agilent Technologies）上进行，流动相为 100% Milli-Q 水，流速 0.5 mL min⁻¹。检测使用示差折光检测器（1260 RID, G1362A），操作温度 55°C。浓度通过外标法确定。赖氨酸通过 HPLC（Agilent 1200 Series）定量，方法参照前期报道（Krömer et al., 2005）。样品以 1:10 稀释于含 α-氨基丁酸（200 μM）内标的溶液中。赖氨酸浓度通过以相同方式制备的外标（1:10 稀释于含 200 μM α-氨基丁酸的溶液）计算。

【数据】CDM 换算系数：0.32 g L⁻¹/OD₆₆₀；HPLC 柱温：85°C；流速：0.5 mL min⁻¹；检测器温度：55°C；内标：α-氨基丁酸 200 μM；稀释倍数：1:10

2.7 木糖异构酶和木酮糖激酶活性测定

细胞在指数生长中期通过离心收集（5 min，8800×g，4°C），用裂解缓冲液洗涤，缓冲液含 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂ 和 0.75 mM DTT。细胞沉淀重悬于相同缓冲液至终浓度 0.25 g 细胞湿重 mL⁻¹。等分样品转移至裂解基质 B 管（MP Biomedicals, Eschwege, Germany），在 ribolyser（Precellys 24, Bertin Technologies, Ile de France, France）中裂解两个循环，每循环 30 s、5500×g，循环间冰浴冷却 2 min。细胞碎片通过离心去除（

【数据】离心：5 min，8800×g，4°C；裂解缓冲液：100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM MgCl₂、0.75 mM DTT；细胞浓度：0.25 g 湿重 mL⁻¹；裂解条件：2 × 30 s，5500×g，间隔冰浴 2 min

研究结果

3.1 通过异源 xylAB 模块建立木糖分解代谢

为系统建立 C. glutamicum 的木糖分解代谢，我们构建了编码木糖异构酶（xylA）和木酮糖激酶（xylB）的合成 xylAB 表达模块。根据已报道的酶活性、辅因子兼容性和在其他微生物系统中的成功异源表达，选择了四个供体生物。来自 Escherichia coli K-12 MG1655 和 Xanthomonas campestris 的模块——此前已证明可在 C. glutamicum 中发挥功能（Buschke et al., 2011; Gopinath et al., 2011; Meiswinkel et al., 2013）——作为基准参考。此外，Clostridium phytofermentans 的 xylAB 因其 xylA 基因在 Saccharomyces cerevisiae 中已证实有活性而被纳入（Brat et al., 2009; Demeke et al., 2013），而 Levilactobacillus brevis 的 xylAB 操纵子则因其天然支持葡萄糖–木糖共利用而被选中（Kim et al., 2009）。所有构建体置于组成型 Ptuf 启动子（Becker et al., 2005）控制下，获得菌株 XYL-1A 至 XYL-1D（表1，图2B）。为确保生理相关性，菌株表征在反映 CBH 糖组成的确定培养基中进行——CBH 含约 4:1 比例的葡萄糖和木糖（Kinnarinen et al., 2012a）。因此，测试培养基含 20 g L⁻¹ 葡萄糖和 5 g L⁻¹ 木糖（图3A–D）。所有重组菌最终都耗尽了木糖，证实了途径功能，但木糖消耗滞后于葡萄糖，且随 xylAB 供体来源不同而变化。携带 E. coli 和 X. campestris 模块的菌株（XYL-1A 和 XYL-1B）在葡萄糖耗尽前消耗了高达 31% 的木糖，而表达 C. phytofermentans 和 L. brevis 基因的菌株（XYL-1C 和 XYL-1D）仅分别达到 21% 和 18%。这些结果表明，xylAB 来源选择显著影响初始木糖利用动力学，E. coli 和 X. campestris 模块为 C. glutamicum 提供了最有效的切入点。然而，木糖摄取在葡萄糖存在下仍受到抑制，表明碳代谢物阻遏仍然活跃，需要进一步改造转运或调控节点才能实现真正的共利用。

【数据】葡萄糖：20 g L⁻¹；木糖：5 g L⁻¹；葡萄糖耗尽前木糖消耗比例：XYL-1A/1B 达 31%，XYL-1C 为 21%，XYL-1D 为 18%

3.2 通过转运蛋白工程增强木糖摄取

尽管 C. glutamicum 可以通过内源但未鉴定的转运蛋白输入木糖（Blombach and Seibold, 2010; Kawaguchi et al., 2006），但天然摄取能力不足以支持高效分解代谢。为克服这一限制，构建了第二代菌株（XYL-2A 至 XYL-2D），引入 E. coli 的木糖–质子同向转运蛋白 xylE（Yim et al., 2016）（表1，图2B）。在确定的 4:1 葡萄糖–木糖混合物中的摇瓶培养（图 S1，补充文件1）显示，xylE 表达显著增强了木糖同化。与亲本菌株相比，XYL-2A 的共利用比率（CUR；mol 木糖 mol⁻¹ 葡萄糖）提高了 3.4 倍，XYL-2B 提高了 5.2 倍。在 4:1 葡萄糖–木糖混合物中，按比例消耗的理论 CUR 为 0.25 mol mol⁻¹。值得注意的是，XYL-2A（0.39 mol mol⁻¹）和 XYL-2B（0.63 mol mol⁻¹）超过了这一阈值，表明转运蛋白工程不仅提高了摄取能力，还将代谢平衡转向木糖利用——即使木糖是次要底物。与此一致，两株菌都在葡萄糖耗尽前完全耗尽了木糖（图3E 和 F）。相比之下，XYL-2C（0.13 mol mol⁻¹）和 XYL-2D（0.28 mol mol⁻¹）保持在该比率或以下，表明转运蛋白效率强烈依赖于 xylAB 模块背景。综上，这些结果表明 xylE 的异源表达有效缓解了转运限制，并部分逆转了底物偏好，从而为 C. glutamicum 中均衡的葡萄糖–木糖共利用奠定了关键一步（Kim et al., 2012）。

【数据】CUR 提升：XYL-2A 提高 3.4 倍，XYL-2B 提高 5.2 倍；理论 CUR：0.25 mol mol⁻¹；XYL-2A CUR：0.39 mol mol⁻¹；XYL-2B CUR：0.63 mol mol⁻¹；XYL-2C CUR：0.13 mol mol⁻¹；XYL-2D CUR：0.28 mol mol⁻¹

3.3 高效的葡萄糖–木糖共利用需要平衡的 XylA/XylB 活性

为进一步评估不同木糖分解代谢模块的性能，使用第二代菌株的细胞提取物进行了木糖异构酶（XylA）和木酮糖激酶（XylB）的酶活性测定。携带空质粒的对照菌株 XYL-0 仅表现出基础 XylB 活性（0.23 U mg⁻¹），与 C. glutamicum 中天然 xylB 基因的表达一致（Kawaguchi et al., 2006）（图4）。菌株 XYL-2A 和 XYL-2B 表现出显著升高且良好平衡的 XylA/XylB 活性（两种酶均为 0.80–1.10 U mg⁻¹），而 XYL-2C 和 XYL-2D 的 XylA 活性较低（0.17–0.38 U mg⁻¹）但 XylB 活性高（1.30 U mg⁻¹）。XYL-2A 和 XYL-2B 中更均匀的活性分布与其优越的共利用比率（分别为 0.39 和 0.63 mol mol⁻¹）相关，强调异构酶和激酶功能的协调表达对高效木糖代谢至关重要（Xiao et al., 2011）。为测试木糖通量是否可通过酶重组进一步优化，将 X. campestris 的 xylA 与 L. brevis 或 C. phytofermentans 的 xylB 组合，每种均与 E. coli 的 xylE 偶联，构建了杂合模块。这些构建体产生菌株 XYL-2BC 和 XYL-2BD。与预期相反，两种杂合体均未比其亲本模块提高木糖利用。XYL-2BC 表现出中等的 CUR（0.32 mol mol⁻¹）和降低的比生长速率（0.23 h⁻¹，而亲本菌株 XYL-2B 和 XYL-2C 为 0.32–0.35 h⁻¹），XYL-2BD 则表现出极低的共利用（CUR = 0.08 mol mol⁻¹）（图 S2，补充文件1）。这些结果强调，高效的葡萄糖–木糖共利用需要精细平衡的 XylA/XylB 活性比率，而非最大化的单个酶水平。组合来自不同供体的高活性酶可能破坏动力学兼容性或辅因子偶联，最终限制木糖分解代谢途径的通量。

【数据】XYL-0 基础 XylB 活性：0.23 U mg⁻¹；XYL-2A/2B 酶活：0.80–1.10 U mg⁻¹（XylA 和 XylB）；XYL-2C/2D XylA 活性：0.17–0.38 U mg⁻¹，XylB 活性：1.30 U mg⁻¹；XYL-2BC CUR：0.32 mol mol⁻¹，μ：0.23 h⁻¹；XYL-2BD CUR：0.08 mol mol⁻¹

3.4 xylA 和 xylB 表达的基因剂量效应

为评估基因剂量对木糖分解代谢的影响，在第二代菌株中引入了额外的 xylA（XYL-3 代）或 xylB（XYL-4 代）拷贝（表1，图2B）。对所得菌株进行了生长、糖利用和代谢性能评估（图 S3、图 S4，补充文件1）。总体而言，增加基因剂量在大多数菌株中增强了木糖消耗，但携带 L. brevis xylAB 模块的菌株（XYL-3D、XYL-4D）除外。最显著的改善出现在源自 E. coli 模块的菌株中：XYL-3B（图3G）和 XYL-4A（图3H）的 CUR 分别提高了 4.1 倍和 2.0 倍。值得注意的是，XYL-3A 在所有菌株中实现了最高 CUR（1.60 mol mol⁻¹），同时保持了中等的比生长速率（0.21 h⁻¹）和总碳摄取速率（22.7 C mmol g⁻¹ h⁻¹）。这种组合——更高的木糖利用率而葡萄糖摄取不变——表明底物偏好发生了真正的转变，而非一般的生长限制，证明强 xylA 表达可以主动重塑两种底物之间的碳分配。类似地，XYL-3B 和 XYL-4B 表现出中等的 CUR 增加（分别为 1.5 倍和 1.1 倍），整体生长性能无重大变化。酶活性测定支持这些观察结果。携带额外 xylA 拷贝的 XYL-3B 的 XylA 活性增加了 2.2 倍，而带有额外 xylB 拷贝的 XYL-4B 仅增加了 1.5 倍（图4）。这些非线性响应证实基因扩增并不直接转化为成比例的酶活性（Sasaki et al., 2008）。XYL-4B 中 XylB 增加的减弱可能反映了转录后或翻译水平的限制，制约了酶的合成或稳定性。总之，这些结果表明提高 xylA 或

【数据】XYL-3B CUR 提升：4.1 倍；XYL-4A CUR 提升：2.0 倍；XYL-3A CUR：1.60 mol mol⁻¹，μ：0.21 h⁻¹，qS：22.7 C mmol g⁻¹ h⁻¹；XYL-3B/4B CUR 提升：1.5 倍/1.1 倍；XYL-3B XylA 活性增加：2.2 倍；XYL-4B XylB 活性增加：1.5 倍

讨论与解读

本研究在 C. glutamicum 中建立了系统性的、基于底物信息的菌株工程框架，以克服葡萄糖–木糖稳定共利用这一长期挑战。此前的努力通过转运蛋白工程、启动子调控或适应性进化实现了部分共利用（Buschke et al., 2011; Ding et al., 2025; Hofer et al., 2025; Yim et al., 2017），但能在不同生长阶段和底物条件下维持近乎恒定的共利用比率和稳定通量分配的菌株仍然稀少。从 34 个工程变体库中，我们鉴定了 XYL-6A 和 XYL-6B 等稳健的共利用菌株，它们结合了快速生长、均衡底物利用和独立于底物水平变化的稳定通量分配。这些表型直接转化到 CBH——一种源自不可回收纸废物的第三代原料——证明理性途径设计可以在现实工业条件下实现稳定的混合糖代谢。近期多项研究通过在 C. glutamicum 中引入木糖同化途径、鉴定合适转运蛋白或应用适应性实验室进化实现了葡萄糖–木糖共利用（如 Ding et al., 2025）。在这些进展基础上，本研究解决了共利用问题中一个独特且互补的层面，即动力学稳定化通量状态的理性设计，使相对底物摄取速率保持不变。

编译者解读： 这项工作的核心价值在于将"底物组成"作为工程设计的出发点——不是追求最大木糖消耗速率，而是根据 CBH 实际的 4:1 糖比，设计动力学上匹配的途径模块。XYL-6A 的"早期通量汇合"策略（在 F6P/G3P 节点合并葡萄糖和木糖来源的通量）展示了合成生物学中"简单即稳健"的设计哲学：通过酶活与转运能力的动力学协调，而非复杂的调控网络重构，即可实现稳定的混合糖代谢。该方法对木质纤维素原料的工业化利用具有直接参考意义，但也需注意，CBH 中乳酸和乙酸的存在可能在实际放大中引入额外的代谢负担，原文对此未作深入探讨。

DOI: 10.1016/j.ymben.2026.02.007