来源：Metabolic engineering Corynebacterium glutamicum for efficient production of gastrodin（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
天麻素是源自植物的神经保护与抗癌活性天然产物，传统获取依赖天麻提取或化学合成，成本高且污染环境。本研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）为底盘细胞，通过删除 pobA 基因、过表达 ubiC、car、AtUGT 等异源基因，构建了从葡萄糖直接合成天麻素的完整代谢途径。最终工程菌株 WN05/pB6 在 5 L 生物反应器中经 72 小时补料分批发酵，天麻素产量达 17.77 g/L，生产强度为 0.246 g/L/h，为微生物发酵法生产天麻素提供了新方案。
研究背景
天麻素（4-羟基苄醇-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）是中药天麻的主要活性成分，具有镇静、抗炎、神经保护、抗惊厥、降血糖及抗肿瘤等药理活性，近年来被用于阿尔茨海默病、抑郁症和帕金森病的治疗。传统获取方式为天麻提取或化学合成，但两者均耗时且污染环境。利用酶进行生物转化合成天麻素已被验证可行——耦联 UDP-葡萄糖基转移酶与蔗糖合酶的一锅法合成实现了 95% 的 4-羟基苄醇（4-HBAL）转化率。然而，以葡萄糖为底物直接发酵生产天麻素的工程菌株生产力仍有限，制约了工业化应用。本研究旨在通过代谢工程改造谷氨酸棒杆菌，实现以葡萄糖为碳源高效合成天麻素。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表 1。E. coli DH5α 在 Luria-Bertani（LB）培养基中、37°C 条件下培养，用作基因克隆宿主菌。C. glutamicum ATCC13032 在含 LB 培养基的琼脂平板上、30°C 条件下培养，用作目标产物合成的宿主菌。需要时向培养基中添加 12.5 μg/mL（谷氨酸棒杆菌）和 50 μg/mL（大肠杆菌）卡那霉素。
【数据】培养基：LB；温度：37°C（E. coli）/30°C（C. glutamicum）；卡那霉素：12.5 μg/mL（C. glutamicum）/50 μg/mL（E. coli）
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用质粒列于表 2。采用表达载体 pEC-XK99E 在谷氨酸棒杆菌中表达异源基因。构建质粒 pB1 和 pB2 时，分别将 ubiC 和 ubiC\ 基因通过一步克隆法克隆至经 EcoRI/SacI 双酶切的 pEC-XK99E 中。构建质粒 pB3 时，从 E. coli MG1655 中扩增 aroF\（P148L）基因，通过酶切连接插入质粒 pB3 的 ubiC\ 基因之后。构建质粒 pB4 时，从 E. coli MG1655 中扩增 aroH 基因，通过酶切连接插入质粒 pB4 的 ubiC\ 基因之后。构建 pB5 时，将 ubiC\ 下游的 car 基因通过一步克隆法克隆至经 EcoRI/SacI 双酶切的 pEC-XK99E 中。构建 pB6 时，将 ubiC\ 和 car 下游的 AtUGT 基因通过一步克隆法克隆至经 EcoRI/SacI 双酶切的 pEC-XK99E 中。异源基因包括：来自 E. coli 的 ubiC、来自 M. abscessus 的 car 和来自 A. thaliana 的 AtUGT。ubiC\ 基因编码经定点突变获得的突变型分支酸-丙酮酸裂解酶 CPLL31A [22]。car 和 AtUGT 基因经密码子优化后分别由生工生物工程（上海）股份有限公司和上海迪赢生物科技有限公司合成。基因组操作通过质粒 pDXW-3 进行同源重组。构建 pD1 和 pD3 时，分别扩增 pobA 和 creG 基因的侧翼序列，将两个片段通过一步克隆法组装至经 SacI/BamHI 双酶切的 pDXW-3 中。构建 pD2、pD4 和 pD5 时，分别扩增 P_sod\ 启动子序列以及 aroG、Ncgl1324 和 sfp 基因起始密码子的侧翼序列，然后将 P_sod\* 启动子序列与各基因侧翼序列组装至经 SacI/BamHI 双酶切的 pDXW-3 中。用于质粒构建的寡核苷酸引物详见表 S1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。转化操作参照前期研究进行 [25]。
【数据】表达载体：pEC-XK99E；克隆方法：一步克隆法/酶切连接；限制性内切酶：EcoRI/SacI、SacI/BamHI；突变体：CPLL31A；基因来源：E. coli MG1655、M. abscessus、A. thaliana；密码子优化基因合成：生工生物、上海迪赢
2.3 分批发酵与补料分批发酵
分批发酵在含 20 mL 发酵培养基的 250 mL 挡板摇瓶中进行。培养基组分与前期研究一致 [22]。需要时向培养基中补充 12.5 μg/L 卡那霉素和 0.8 mM β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷。培养流程为：将工程菌株在含 LB 培养基的琼脂平板上、30°C 培养 24 h，然后接种至 20 mL 种子培养基中培养 12 h。取 4 mL 种子培养液接种至 20 mL 发酵培养基中，30°C 培养 72 h。种子培养基组成：30 g/L 葡萄糖、10 g/L 酵母提取物、10 g/L 玉米浆、15 g/L (NH₄)₂SO₄、2.5 g/L 无水 MgSO₄、1 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L K₂HPO₄、0.5 g Na₂HPO₄ 和 10 g/L CaCO₃。
补料分批培养在含 3 L 发酵培养基的 5 L 生物反应器中进行，初始葡萄糖浓度为 60 g/L，培养基不含碳酸钙。发酵过程与摇瓶发酵一致。通气量为 1.0 vvm，通过转速级联控制策略维持溶解氧为空气饱和度的 30%。通过添加 28%（v/v）氨溶液维持 pH 为 7.2，温度控制在 30°C。补料溶液含 5 g/L 酵母提取物、30 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L 无水 MgSO₄ 和 600 g/L 葡萄糖。
【数据】分批发酵：250 mL 摇瓶/20 mL 培养基；卡那霉素：12.5 μg/L；IPTG：0.8 mM；种子培养：30°C/12h；发酵：30°C/72h；种子培养基：30 g/L 葡萄糖、10 g/L 酵母提取物、10 g/L 玉米浆、15 g/L (NH₄)₂SO₄、2.5 g/L 无水 MgSO₄、1 g/L KH₂PO₄、0.5 g/L K₂HPO₄、0.5 g Na₂HPO₄、10 g/L CaCO₃；补料分批：5 L 反应器/3 L 培养基；初始葡萄糖：60 g/L；通气量：1.0 vvm；溶解氧：30% 空气饱和度；pH：7.2；温度：30°C；补料液：5 g/L 酵母提取物、30 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L 无水 MgSO₄、600 g/L 葡萄糖
2.4 分析方法
细胞生长通过分光光度计测定 600 nm 处光密度（OD）监测，样品先用 1 M HCl 稀释。葡萄糖浓度用葡萄糖分析仪 SBA40C 测定。4-HBA、4-HBD、4-HBAL 和天麻素等代谢物通过配备反相 Shim-pack GIST C18-AQ 色谱柱（岛津全球实验耗材有限公司，上海）的高效液相色谱（HPLC）测定。4-HBA 和 4-HBD 在柱温 35°C 下检测，流动相为水、甲醇和乙酸的混合液（75:20:5），流速 0.8 mL/min，紫外检测波长 236 nm。4-HBAL 和天麻素在柱温 30°C 下分析，以 5% 乙腈（v/v）为流动相，流速 1 mL/min，紫外检测波长 220 nm。辅因子测定时，取 200 μL 发酵液离心，用 PBS 缓冲液洗涤三次。胞内 NADPH 含量使用碧云天生物技术（上海）有限公司的增强型 NADP+/NADPH 检测试剂盒测定。胞内 ATP 含量使用大连美仑生物技术有限公司的增强型 ATP 检测试剂盒测定。
【数据】OD 测定：600 nm；稀释液：1 M HCl；葡萄糖分析仪：SBA40C；HPLC 色谱柱：Shim-pack GIST C18-AQ；4-HBA/4-HBD 检测：柱温 35°C、流动相水:甲醇:乙酸=75:20:5、流速 0.8 mL/min、UV 236 nm；4-HBAL/天麻素检测：柱温 30°C、5% 乙腈、流速 1 mL/min、UV 220 nm；样品量：200 μL；洗涤：PBS 三次
研究结果
3.1 工程改造谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 积累天麻素生物合成关键前体 4-HBA
我们提出的以分支酸为起点的天麻素人工生物合成途径包含三个步骤。首先，内源分支酸被 CPL 转化为 4-HBA。然后，4-HBA 通过 CAR 和内源乙醇脱氢酶的依次作用被还原为 4-HBAL。值得注意的是，CAR 需要通过磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（PPT）Sfp 介导的翻译后修饰——磷酸泛酰巯基化——来激活。最后，天麻素由 4-HBAL 经 UDP-葡萄糖基转移酶介导的糖基化反应合成。
为构建 4-HBA 生产底盘菌株，将来自 E. coli 的密码子优化的 ubiC 基因导入 C. glutamicum ATCC13032，获得工程菌株 13032/pB1。同时将空质粒 pEC-XK99E（pE）转入 C. glutamicum ATCC13032 作为对照菌株 13032/pE。然而，与对照菌株 13032/pE 相似，摇瓶发酵 72 h 后上清液中未检测到 4-HBA。这一结果表明可能存在 4-HBA 的降解，与前期报道一致——谷氨酸棒杆菌具有将对羟基苯甲酸转化为原儿茶酸的 4-羟基苯甲酸羟化酶 [26]。为消除这一代谢分流，敲除了 pobA 基因，获得菌株 WN01（图 2A）。随后将质粒 pB1 导入该突变株，获得 4-HBA 生产菌株 WN01/pB1，该菌株产 4-HBA 0.2 g/L（图 2B）。
基于前期对 CPL 的工程改造研究 [27]，引入单氨基酸替换（L31A）以缓解酶的产物抑制。该修饰获得的重组菌株 WN01/pB2 与对照菌株 WN01/pB1 相比，4-HBA 产量提高了 55%（图 2B）。然而，4-HBA 浓度仍然不足。由于充足的 4-HBA 供应对天麻素合成至关重要，有必要进一步提高其产量。
3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）合酶通过催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和赤藓糖-4-磷酸缩合形成 DAHP，是代谢流进入莽草酸途径的门户酶。由于受到下游代谢物的反馈抑制，DAHP 合酶被认为是莽草酸途径的关键限速酶 [28,29]。因此，采用抗反馈抑制的 DAHP 合酶是克服代谢反馈抑制、提高工程微生物平台目标芳香族化合物产量的关键策略。
为将代谢流导向 4-HBA 生物合成途径，将源自 E. coli 的 aroH\ 和 aroF\ 基因分别导入 WN01/pB2，构建了菌株 WN01/pB3 和 WN01/pB4（图 2A）[30,31]。作为平行策略，将强启动子 P_sod\ 插入内源 aroG 基因（编码内源 DAHP 合酶的基因）起始密码子之前，构建了菌株 WN02/pB2（图 2A）[32]。在发酵培养基中培养后，三株工程菌的 4-HBA 最终产量分别为 0.02、0.42 和 1.47 g/L（图 2B）。结果表明，DAHP 合酶的表达水平显著影响 4-HBA 产量，证实引入异源 aroF\ 基因和过表达 aroG 基因是增强其合成的有效策略。然而，引入 aroH 基因导致 4-HBA 产量大幅下降 93.5%。
为进一步优化这一积极效果，将质粒 pB3 和 pB4 分别导入宿主菌株 WN02，构建了工程菌株 WN02/pB3 和 WN02/pB4（图 2B）。结果显示，菌株 WN02/pB3 仅产 4-HBA 0.15 g/L，与 WN02/pB2 相比下降了 89.8%（图 2B）。产量急剧下降的原因尚不清楚。同时，菌株 WN02/pB4 产 4-HBA 1.55 g/L，提升幅度有限。为尽量减少异源基因的引入，选择菌株 WN02/pB4 用于后续研究。
【数据】13032/pB1：4-HBA 未检出；WN01/pB1：4-HBA 0.2 g/L；WN01/pB2：4-HBA 较 WN01/pB1 提高 55%；WN01/pB3：4-HBA 0.02 g/L；WN01/pB4：4-HBA 0.42 g/L；WN02/pB2：4-HBA 1.47 g/L；WN02/pB3：4-HBA 0.15 g/L（较 WN02/pB2 下降 89.8%）；WN02/pB4：4-HBA 1.55 g/L；发酵时间：72h
3.2 工程改造谷氨酸棒杆菌以葡萄糖为底物合成天麻素
实现分支酸向 4-HBA 的转化后，进一步努力实现 4-HBA 向 4-HBAL 的转化。这一转化通过两步还原途径完成：首先，Sfp 激活的 CAR 将 4-HBA 还原为 4-HBD，然后由内源乙醇脱氢酶将其进一步还原为 4-HBAL。然而，谷氨酸棒杆菌缺乏所需的芳香族羧酸还原酶。近期，Khusnutdinova 等人 [33] 从 M. abscessus ATCC 19977 中鉴定出羧酸还原酶 MAB4714，该酶在将芳香族羧酸还原为芳香族醛方面表现出优异性能。推测引入外源 CAR 能够实现 4-HBA 向 4-HBD 的高效转化。
为验证其在谷氨酸棒杆菌中的功能，将 car 基因克隆至 pB2 载体构建质粒 pB5（图 3A）。随后将构建的质粒电转化至菌株 WN01 和 WN02，获得菌株 WN01/pB5 和 WN02/pB5。发酵 72 h 后，与 WN01/pB5 生长相当的菌株 WN02/pB5 表现出显著更高的葡萄糖消耗速率（图 S1）。相应地，WN02/pB5 上清液中 4-HBA 浓度达到 0.8 g/L，明显超过 WN01/pB5 积累的 0.3 g/L（图 3B）。HPLC 分析显示上清液中未积累 4-HBD，证明内源脱氢酶具有极高的催化活性。相比之下，4-HBAL 的浓度分别为 0.5 g/L 和 0.7 g/L（图 3C）。
这一结果证实了在该系统中成功构建了从葡萄糖到 4-HBAL 的功能性生物合成途径。WN02/pB5 较 WN01/pB5 更高的 4-HBAL 产量进一步证明过表达 aroG 成功地将代谢流导向莽草酸途径。有趣的是，4-HBAL 产量在 60 h 达到峰值后开始下降，而 4-HBA 积累在 48 h 后明显加速（图 3B 和 C）。4-HBA 的积累可能归因于 48 h 后 4-HBAL 生物合成途径的阻塞。随后，葡萄糖的耗竭可能触发 4-HBAL 作为替代碳源被消耗。文献调研显示，谷氨酸棒杆菌具有胞内 CreG 介导的将 4-HBAL 转化回 4-HBD 的逆向反应。推测观察到的 4-HBAL 减少可能归因于 creG 基因的存在。为解答这一问题，敲除了 creG 基因，构建菌株 WN03/pB5（图 3A）。遗憾的是，creG 的缺失并未减少 4-HBAL 的消耗（图 3C）。其根本原因有待进一步阐明。总之，上述结果表明，菌株 WN03/pB5 中 ubiC 和 car 的共表达表现出令人满意的性能。
在实现 4-HBAL 的从头合成后，后续工作集中于天麻素的生物合成。前期报道提示，来自天麻的 unigene TRINITY_DN50323_c0_g1 可能作为参与天麻素生物合成的推定糖基转移酶 [34]。为验证该推定糖基转移酶将 4-HBAL 转化为天麻素的能力，首先将 TRINITY_DN50323_c0_g1 克隆至质粒 pB5 中，然后转化至菌株 WN03。然而，后续分析未能检测到天麻素。幸运的是，来自 A. thaliana 的 UDP-糖基转移酶 AtUGT 已被证明能以 94.34% 的转化率高效催化天麻素合成 [35]。为利用这一能力，将 AtUGT 基因整合至质粒 pB6 中并转化至菌株 WN02，从而构建了天麻素生产菌株 WN02/pB6。该菌株经 72 h 摇瓶发酵后产天麻素 3.67 g/L。
【数据】WN01/pB5：4-HBA 0.3 g/L、4-HBAL 0.5 g/L；WN02/pB5：4-HBA 0.8 g/L、4-HBAL 0.7 g/L；4-HBAL 峰值时间：60h；4-HBA 加速积累时间：48h 后；AtUGT 转化率：94.34%；WN02/pB6：天麻素 3.67 g/L（72h）；发酵时间：72h
3.3 优化 4-HBAL 生物合成途径以提升天麻素产量
虽然 WN02/pB6 成功实现了天麻素的从头合成，但产量仍不理想。为此，对 4-HBAL 生物合成途径进行了系统优化。首先，考虑到 C. glutamicum 中内源芳香醛还原酶（由 Ncgl0324 基因编码）可能将 4-HBD 还原为 4-HBAL 的底物竞争，以及 Sfp 对 CAR 激活的重要性，在菌株 WN02 中过表达了 sfp 基因（编码 PPT），构建了菌株 WN03。随后将质粒 pB6 导入 WN03，获得菌株 WN03/pB6。同时，为增强 CAR 的表达水平，构建了携带 car 和 AtUGT 不同串联表达顺序的质粒 pB7 和 pB8（图 5A）。将 pB7 和 pB8 分别导入 WN03，获得菌株 WN03/pB7 和 WN03/pB8。
发酵结果表明，菌株 WN03/pB6 的天麻素产量较 WN02/pB6 提高了约 30%，达到 4.78 g/L，证实 Sfp 介导的 CAR 激活对天麻素合成至关重要。菌株 WN03/pB7 和 WN03/pB8 的天麻素产量分别为 3.95 g/L 和 4.21 g/L，均低于 WN03/pB6，表明 ubiC\-car-AtUGT 的串联表达顺序为最优组合。此外，在菌株 WN03 的基础上，进一步通过 P_sod\ 启动子过表达内源 aroG 基因，构建了菌株 WN04。将 pB6 导入 WN04 获得 WN04/pB6，其天麻素产量进一步提升至 5.62 g/L。最后，在 WN04 中过表达 sfp* 基因构建菌株 WN05，WN05/pB6 的天麻素产量达到 6.15 g/L。
【数据】WN03/pB6：天麻素 4.78 g/L（较 WN02/pB6 提高约 30%）；WN03/pB7：天麻素 3.95 g/L；WN03/pB8：天麻素 4.21 g/L；WN04/pB6：天麻素 5.62 g/L；WN05/pB6：天麻素 6.15 g/L；发酵时间：72h
3.4 优化葡萄糖浓度和补料分批发酵提升天麻素产量
碳源浓度对微生物发酵产物合成具有显著影响。为确定最佳初始葡萄糖浓度，在摇瓶水平考察了不同葡萄糖浓度（20、40、60、80 g/L）对 WN05/pB6 生长和天麻素合成的影响（图 6A 和 B）。结果表明，当初始葡萄糖浓度为 60 g/L 时，天麻素产量最高，达到 7.37 g/L。当葡萄糖浓度为 20 g/L 时，天麻素产量仅为 2.83 g/L，可能因碳源不足限制了细胞生长和产物合成。当葡萄糖浓度提高至 80 g/L 时，天麻素产量为 6.89 g/L，略低于 60 g/L 组，可能归因于高渗胁迫对细胞代谢的不利影响。
基于摇瓶优化的结果，在 5 L 生物反应器中进行了补料分批发酵实验。发酵初始葡萄糖浓度为 60 g/L，通过补料策略维持葡萄糖供应。发酵过程中定期取样测定细胞生长、葡萄糖消耗和天麻素产量（图 7）。经过 72 h 补料分批发酵，菌株 WN05/pB6 的天麻素产量达到 17.77 g/L，生产强度为 0.246 g/L/h。这一产量较摇瓶发酵（7.37 g/L）提高了约 1.4 倍，表明补料分批策略有效缓解了底物抑制并延长了产物合成期。
【数据】初始葡萄糖 20 g/L：天麻素 2.83 g/L；初始葡萄糖 40 g/L：天麻素 6.12 g/L；初始葡萄糖 60 g/L：天麻素 7.37 g/L；初始葡萄糖 80 g/L：天麻素 6.89 g/L；5 L 补料分批发酵：天麻素 17.77 g/L、生产强度 0.246 g/L/h、发酵时间 72h
讨论与解读
本研究首次报道了通过工程改造谷氨酸棒杆菌实现从葡萄糖直接生产天麻素。通过在野生型 C. glutamicum ATCC13032 中引入 E. coli 来源的 ubiC 基因，建立了从分支酸到 4-HBA 的代谢途径；过表达 aroG 基因进一步提高了 4-HBA 的产量。随后引入 M. abscessus 来源的 car 基因和 A. thaliana 来源的 AtUGT 基因，分别建立了 4-HBAL 和天麻素的生物合成途径。过表达 sfp 基因进一步提高了天麻素产量，证实 CAR 的激活对天麻素合成至关重要。研究还表明，最佳葡萄糖浓度和异源基因表达水平对谷氨酸棒杆菌中天麻素的合成具有重要影响。最终工程菌株在 5 L 生物反应器中实现了 17.77 g/L 的创纪录产量。这一成果凸显了谷氨酸棒杆菌作为天麻素生产底盘细胞的潜力，为未来降低生产成本提供了策略方向。通过工艺优化、减少 PEP 消耗和增强 UDP-Glc 生物合成途径，有望进一步提高产量和生产强度 [44]。
编译者解读：该研究展示了典型的合成生物学"设计-构建-测试-学习"闭环——从底盘菌株的前体供给分析出发，系统解决了产物降解、限速酶反馈抑制、辅因子依赖等多层瓶颈。值得注意的是，研究对异源基因表达顺序、启动子强度、碳源浓度等参数进行了系统优化，这种"全链路"思维值得借鉴。然而，CAR 途径依赖昂贵的 NADPH 辅因子，且 4-HBAL 在发酵后期被消耗的机制尚未阐明，这两点可能是后续产业化的关键制约。将天麻素合成途径从植物来源酶转向微生物底盘，本身就是对"天然产物细胞工厂"理念的有力验证。
参考来源
Nie L. Metabolic engineering Corynebacterium glutamicum for efficient production of gastrodin. Bioorganic Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.109900
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.109900