来源：The repeated exposure to rising pH starts costly regulation programs and reduces production performance in Corynebacterium glutamicum（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
工业规模生物反应器中普遍存在的pH波动是导致生产性能下降的关键因素之一。本研究利用STR-PFR两区隔尺度缩减系统，模拟工业反应器中真实的短期碱性pH波动（ΔpH=+0.3），系统考察了对产氨基苯甲酸的谷氨酸棒状杆菌AB01菌株的多层次影响。研究发现，反复pH冲击使产物得率下降16%，而维持能耗增加38%。转录组分析揭示了应激防御与蛋白质质量控制机制的激活，以及翻译系统的协同重塑。能量成本分析与转录组数据的整合为工业动态pH条件下菌株定向优化提供了新靶点。
研究背景
谷氨酸棒状杆菌是工业生物制造中广泛应用的生产菌株。然而，实验室规模开发的生物工艺在放大至工业规模时往往面临显著性能损失。混合限制导致的混合时间延长使细胞暴露于营养物、溶解气体、温度和pH的梯度环境中，大型反应器因此成为与实验室均匀混合条件截然不同的复杂动态系统。微生物对这些频繁而快速的环境波动会做出适应性响应——这种响应虽对短期生存至关重要，却常以代谢效率为代价，将细胞资源从生产代谢转向应激反应，在工业容器的瞬变条件下未必带来实际益处。这种权衡可严重损害大规模生产中的生产率和得率，构成工业生物制造竞争力的重要挑战。
研究方法
2.1 菌株、培养基、缓冲液与储备液
本研究所用菌株见表1（原文未提供）。脑心浸液（BHI）琼脂平板通过将37 g BHI粉末和18 g琼脂溶解于1 L去离子水后高压灭菌制备。预种子1（PS1）培养基：将16 g L⁻¹大豆蛋白胨、10 g L⁻¹酵母提取物和5 g L⁻¹ NaCl溶解于1 L去离子水，高压灭菌前用KOH调pH至7.5。葡萄糖（16 g L⁻¹）在灭菌后通过无菌添加600 g L⁻¹葡萄糖溶液单独加入。预种子2（PS2）培养基：将10 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、5 g L⁻¹尿素、62 g L⁻¹ MOPS缓冲液、5 g L⁻¹酵母提取物、1 g L⁻¹ KH₂PO₄、1 g L⁻¹ K₂HPO₄、0.25 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O和0.01 g L⁻¹ CaCl₂·2H₂O溶解于1 L去离子水，高压灭菌前用KOH调pH至7.5。灭菌后通过无菌600 g L⁻¹葡萄糖溶液单独添加葡萄糖至终浓度40 g L⁻¹。补充生物素2 mg L⁻¹，并添加1 mL L⁻¹微量元素溶液。种子培养基：在1 L去离子水中加入50 g L⁻¹颗粒状Solulys（玉米浆固形物），溶解5 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、6.67 g L⁻¹ KH₂PO₄、6.67 g L⁻¹ K₂HPO₄、3.33 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.067 g L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、8.33 g L⁻¹酵母提取物、4.2 g L⁻¹聚丙二醇2000（消泡剂），高压灭菌前用KOH调pH至7.2。灭菌后通过无菌600 g L⁻¹葡萄糖溶液单独添加葡萄糖至终浓度30 g L⁻¹。补充生物素3.3 mg L⁻¹，添加16 mL L⁻¹微量元素溶液。生产培养基：将5 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、3 g L⁻¹ KH₂PO₄、3 g L⁻¹ K₂HPO₄、1.5 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.1 g L⁻¹ CaCl₂·2H₂O、1.25 g L⁻¹聚丙二醇2000（消泡剂）溶解于1.32 L去离子水，高压灭菌前用KOH调pH至7.5。灭菌后通过无菌600 g L⁻¹葡萄糖溶液单独添加葡萄糖至终浓度40 g L⁻¹。补充生物素5 mg L⁻¹，添加12.5 mL L⁻¹微量元素溶液，并加入4.5 mg L-色氨酸（溶解于50 mL去离子水并过滤）。接种前用生物反应器pH控制将pH调至7.8。600 g L⁻¹葡萄糖储备液：将660 g一水葡萄糖溶解于554 mL去离子水，高压灭菌。微量元素溶液：将10 g MnSO₄·H₂O、10 g FeSO₄·7H₂O、1 g ZnSO₄·7H₂O和0.2 g CuSO₄·5H₂O溶解于800 mL水，用HCl酸化至pH 1.0，无菌过滤后储存于4°C。葡萄糖-色氨酸溶液：将200 mL无菌色氨酸储备液（8 g L⁻¹）与800 mL无菌葡萄糖储备液（600 g L⁻¹）混合，终组成为480 g L⁻¹葡萄糖和1.6 g L⁻¹色氨酸。碱混合液：在通风橱中混合324 mL高压灭菌去离子水、368 mL 25 wt% NH₄OH和308 mL 5 M NaOH（以处理可能的氨气释放）。该碱混合液与25 wt% H₃PO₄共同用于发酵过程中的pH滴定。用于胞内AXP池提取的淬灭液含80 µM EDTA（溶解于35% v/v高氯酸）。细胞样品用无菌0.9% m/V NaCl溶液稀释。
【数据】BHI琼脂：37 g L⁻¹ BHI+18 g L⁻¹琼脂；PS1：16 g L⁻¹大豆蛋白胨+10 g L⁻¹酵母提取物+5 g L⁻¹ NaCl，pH 7.5，葡萄糖16 g L⁻¹；PS2：含MOPS 62 g L⁻¹，pH 7.5，葡萄糖40 g L⁻¹，生物素2 mg L⁻¹；种子培养基：pH 7.2，葡萄糖30 g L⁻¹，生物素3.3 mg L⁻¹；生产培养基：pH 7.5→7.8，葡萄糖40 g L⁻¹，生物素5 mg L⁻¹，L-色氨酸4.5 mg；葡萄糖储备液600 g L⁻¹；微量元素溶液pH 1.0；葡萄糖-色氨酸溶液：480 g L⁻¹葡萄糖+1.6 g L⁻¹色氨酸；碱混合液：324 mL水+368 mL 25 wt% NH₄OH+308 mL 5 M NaOH；淬灭液：80 µM EDTA+35% v/v高氯酸
2.2 生产菌株的构建
本研究使用一株工程改造的谷氨酸棒状杆菌生产氨基苯甲酸。野生型菌株C. glutamicum ATCC 13032经过实验室进化获得对高浓度氨基苯甲酸的抗性，得到菌株C. glutamicum Evo1。然而，适应过程中产生的具体基因组突变尚未被表征。随后，Evo1经过遗传改造以实现氨基苯甲酸生物合成，构建了菌株C. glutamicum Evo1 ΔtrpD trpD5 Δppc aroLAC cg3132::Ptuf_aroGnew，以下称为C. glutamicum AB01，由Covestro AG为本项目提供。
【数据】菌株：C. glutamicum AB01（Evo1 ΔtrpD trpD5 Δppc aroLAC cg3132::Ptuf_aroGnew）；亲本：ATCC 13032；进化菌株：Evo1（抗氨基苯甲酸）
2.3 生物反应器装置
发酵采用两区隔尺度缩减装置，设计用于重现大型生物反应器中出现的梯度。该系统包括作为主培养容器的搅拌釜反应器（STR）和作为次级区隔的活塞流反应器（PFR），后者用于模拟瞬态pH变化。两个单元连接形成循环回路。PFR在培养24 h后接入回路，使部分培养物在剩余24 h内暴露于波动pH条件，总处理时长为48 h。STR为3 L实验室生物反应器（Bioengineering, Wald, Switzerland），配备导流挡板和两个六叶Rushton搅拌桨以确保高效混合和气体传质。次级单元为定制PFR，内径20 mm，总体积约380 mL。通过从PFR底部经连接管线通入无菌空气实现通气，由气流控制器控制。在入口和出口附近安装两个pO₂传感器以监测沿反应器的氧分布。PFR温度通过保温被动控制，入口和出口之间最大温度下降约2°C。使用隔膜计量泵（Sigma/1, ProMinent, Heidelberg, Germany）在反应器连接后将生物悬浮液从STR转移至PFR。此外，PFR配备自动化取样口，可在PFR下部、中部和上部三个位置（P1、P2和P3）进行快速精确取样。pH使用两个探针（Mettler Toledo, Columbus, CO, USA）监测和控制。一个pH探针安装在STR中，第二个通过定制适配器定位在PFR出口处，实现探针在STR-PFR循环回路中的安全集成。每次过程前使用相同缓冲液同时校准两个pH探针。该系统示意图见图1。
pH波动通过在PFR下端19 mm插口处添加碱液实现，使细胞暴露于较高pH。底物补料、用于pH波动的碱液以及用于pH调节的碱和酸由蠕动泵（Watson Marlow, Falmouth, United Kingdom）连续输送，并通过记录补料容器质量减少的平衡装置定量。消泡剂（聚丙二醇2000）通过活塞注射泵添加，速率根据观察到的泡沫形成在50–200 µL h⁻¹之间调节。PFR通过直接蒸汽注入灭菌；压力阀使内部压力达到1.6 bar，温度接近120°C。灭菌循环持续40 min，在每次发酵前后进行。此外，实施原位清洗（CIP）程序以去除PFR可能的死区中积累的残余生物质：在STR和PFR之间以60°C循环2 L 0.5 M NaOH溶液1 h。尾气中的氧气和二氧化碳浓度使用气体分析仪（BlueSens, Herten, Germany）连续分析。
【数据】STR体积：3 L；PFR内径：20 mm，体积约380 mL；PFR接入时间：24 h；总培养时间：48 h；PFR温度降：≤2°C；灭菌：1.6 bar/120°C/40 min；CIP：2 L 0.5 M NaOH，60°C，1 h；消泡剂速率：50–200 µL h⁻¹
2.4 STR-PFR尺度缩减系统表征
培养液以恒定泵速和通气速率从STR连续循环至PFR，实现PFR中受控的平均停留时间和活塞流行为。为确定合适的泵速（原文截断于此，后续内容原文未提供）。
【数据】原文未详述（该段在原文节选中不完整）
研究结果
3.1 生物量（gCDW）、氨基苯甲酸产量、CO₂释放与葡萄糖消耗
培养前24 h内，生物量形成、葡萄糖摄取、氨基苯甲酸生产和CO₂释放在参考条件和波动pH条件下相当。这符合预期，因为两次发酵在相同条件下进行。随后PFR接入STR，使部分培养物持续循环，同时pH从7.8升至8.1。±0.3 pH的上升/下降被认为可模拟细胞在大规模非均质条件下的经历。在参考运行中，次级管线保持断开，培养物维持在恒定pH。
一旦暴露于波动pH条件，培养物表现出与参考实验明显不同的行为。生物量形成在大部分过程中较高，导致总体生物量得率（YX/S = 0.260 ± 0.017 gCDW gGlc⁻¹）高于参考条件（0.232 ± 0.023 gCDW gGlc⁻¹）。相比之下，氨基苯甲酸生产受到pH波动的负面影响；相应的产物得率（YP/S）从参考条件下的0.082 ± 0.011 gP gGlc⁻¹降至波动条件下的0.069 ± 0.011 gP gGlc⁻¹。生物量和产物形成过程见图2。
关于葡萄糖消耗，图3显示暴露于波动pH导致葡萄糖摄取低于参考发酵。CO₂释放也呈现类似模式，在波动pH条件下降低。参考培养中，葡萄糖摄取、产物形成和生长的比速率分别为0.21 ± 0.02 gGlc gCDW⁻¹ h⁻¹、0.017 ± 0.001 gP gCDW⁻¹ h⁻¹和0.049 ± 0.009 h⁻¹。在碱性pH波动下，各速率均下降（qS = 0.16 ± 0.02 gGlc gCDW⁻¹ h⁻¹，qP = 0.012 ± 0.003 gP gCDW⁻¹ h⁻¹，µ = 0.043 ± 0.012 h⁻¹）。比较两种条件下的呼吸参数，比耗氧速率从3.1 ± 0.04降至2.8 ± 0.15 mmolO₂ gCDW⁻¹ h⁻¹，而CO₂释放速率从2.9 ± 0.00降至2.4 ± 0.21 mmolCO₂ gCDW⁻¹ h⁻¹。
【数据】YX/S：波动0.260 ± 0.017 vs 参考0.232 ± 0.023 gCDW gGlc⁻¹；YP/S：波动0.069 ± 0.011 vs 参考0.082 ± 0.011 gP gGlc⁻¹；参考比速率：qS=0.21 ± 0.02 gGlc gCDW⁻¹ h⁻¹，qP=0.017 ± 0.001 gP gCDW⁻¹ h⁻¹，µ=0.049 ± 0.009 h⁻¹；波动比速率：qS=0.16 ± 0.02，qP=0.012 ± 0.003，µ=0.043 ± 0.012；比耗氧速率：3.1 ± 0.04→2.8 ± 0.15 mmolO₂ gCDW⁻¹ h⁻¹；CO₂释放速率：2.9 ± 0.00→2.4 ± 0.21 mmolCO₂ gCDW⁻¹ h⁻¹；pH波动范围：7.8→8.1（±0.3）
3.2 胞内AXP池与AEC评估
从STR和PFR采集样品以记录对pH波动的长期和短期细胞响应。在连接PFR之前，即pH波动暴露开始前，AEC值与参考实验相当。在过程时间22 h和24 h（对应pH波动阶段开始前从STR采集的样品），参考条件的AEC为0.77（22 h）和0.78（24 h），pH波动实验在扰动前条件下为0.78 ± 0.02（22 h）和0.87 ± 0.02（24 h）。如图4所示，参考培养物的AEC值不仅高于STR和PFR中波动pH条件下测得的数值，而且在整个培养期间保持该水平。相比之下，在后期阶段（46 h）沿PFR观察到AEC下降。类似地，pH扰动STR的AEC随运行时间从0.78 ± 0.02降至0.70 ± 0.05。
表3（原文未提供）显示了pH扰动前（22 h）和扰动后（46 h）测得的生物量特异性腺嘌呤核苷酸池。参考培养物的相应值也包括在内。研究中识别出两个趋势：1）参考条件中池大小保持恒定，而pH扰动后总AXP池增加，其中AMP表现出最大的相对增加。2）pH扰动的影响增加了ATP和AMP含量。前者表现为较弱的统计趋势，而AMP的增加在统计上可靠且超过其他变化。相比之下，ADP浓度在同一时期略有下降。
【数据】AEC（22 h）：参考0.77 vs 波动0.78 ± 0.02；AEC（24 h）：参考0.78 vs 波动0.87 ± 0.02；AEC（46 h沿PFR）：下降；STR AEC：0.78 ± 0.02→0.70 ± 0.05；趋势：总AXP池增加，AMP增幅最大，ADP略降
3.3 差异基因表达分析
工程菌株AB01按前述方法培养。将48 h后获得的基因表达谱与24 h采集的样品（作为参考）进行比较（图5A）。分析了四个取样点：STR和三个PFR位置（P1、P2和P3）。转录响应区分了STR和PFR。与参考相比，识别出以下三组转录动态：
1）基因表达降低：发生在基因类别C、E、F、G、P、T和V中，分别编码能量产生与转换（C）、氨基酸代谢（E）、碳水化合物代谢（G）、无机离子转运（P）、信号转导（T）和防御机制（V）。具体而言，C在PFR中逐渐下降前略有上调，在P2和P3达到最低值。E在所有取样位置均保持下调。G在所有样品中下调，并朝P3方向呈现下调加剧趋势。F在P1出现短暂下降，随后恢复至基线水平。P在STR、P2和P3下调，但在P1显示瞬时激活。T和V在STR、P1和P2与参考相当，但在P3强烈下调。
2）基因表达放大：可见于基因类别J、K、L和O，分别编码翻译、核糖体结构与生物发生（J）、转录（K）、复制、重组与修复（L）以及翻译后修饰与蛋白质周转（O）。J仅在P1上调，在P2和P3恢复至参考水平；K在STR上调但朝PFR出口方向逐渐下降。L在所有位置强烈上调，沿PFR仅略有变化。相比之下，O在STR中略有下调，在P1被诱导，在P2-P3恢复至参考水平。
3）微小或无转录响应：其余所有基因类别均属此类，包括辅酶代谢（H），仅沿PFR显示轻微抑制。
作为比较，研究了野生型C. glutamicum ATCC 13032在7.8至8.1之间短期pH振荡2 h（重现STR-PFR系统中细胞经历的时间频率）下的转录响应（图5B）。尽管暴露时间较短，野生型的全局转录响应与AB01观察到的方向趋势一致，但幅度有所减弱。两种菌株在碱性条件下均显示碳水化合物代谢（G）和核苷酸转运与代谢（F）的下调。翻译和核糖体功能（J）在两种菌株中均适度上调，特别是WT在pH 8.1时与P1相比。类似地，复制与修复（L）和转录（K）在两种情况下均保持上调，尽管AB01中幅度更高。翻译后修饰、蛋白质周转和分子伴侣（O）类别在野生型中也被诱导，但在AB01的P1位点未诱导。防御机制（V）和信号转导（T）在两种菌株中显示相当的抑制趋势。辅酶代谢（H）、核苷酸代谢（F）和次级代谢物生物合成（Q）在野生型中略有上调，而在AB01中不变或弱下调。
【数据】取样点：STR、P1、P2、P3；比较时间：48 h vs 24 h；野生型振荡条件：pH 7.8–8.1，2 h；下调类别：C、E、F、G、P、T、V；上调类别：J、K、L、O；WT与AB01趋势一致但幅度减弱
3.4 增加维持需求量的估算
为量化pH诱导的转录和翻译响应相关的能量成本，计算了差异表达基因的额外ATP需求。分析遵循Loeffler和Ankenbauer [20,22]提出的逻辑，即将mRNA合成和翻译所需的ATP与参考稳态的总NGAM需求相关联。如表4（原文未提供）所示，由于前20个应激响应基因的表达导致的维持能累积增加（原文截断于此，后续内容原文未提供）。
【数据】原文未详述（该段在原文节选中不完整）
讨论与解读
讨论
反复暴露于碱性pH使过程性能与非扰动参考条件逐渐分化。生物量形成是唯一超过参考值的参数，但这一差异在pH扰动开始前就已显现，可能源于接种物浓度的微小批次间差异。pH刺激后的最终生物量滴度低于参考，可能由大量泡沫导致。氨基苯甲酸生产受碱性pH触发因素负面影响，YP/S下降16%，而YX/S较参考增加约12%。这表明在碱性应激条件下，细胞谨慎管理资源，避免能量消耗并减少强制产物合成的能量和前体供应。Limberg和Olughu [13,14]也报道了碱性pH暴露主要损害工程菌株的产物形成。本研究表明产物形成减少而生物量产量增加。显然，补偿ATP需求所需的ATP增加可通过略微降低的呼吸活性来满足，并未导致CO₂产量增加——CO₂增加会减少胞内碳可用性。相反，胞内通量转向增加生物量形成。
编译者解读
本研究的意义在于将尺度缩减实验与转录组学、能量代谢分析相结合，定量揭示了pH波动对工业菌株的代谢代价。方法上，STR-PFR系统有效模拟了工业反应器的真实pH梯度，比传统批次实验更贴近生产实际。尤其值得关注的是，通过将差异表达基因的ATP成本与维持能关联，研究从"知道应激有害"推进到"量化应激多贵"的层面，为菌株理性改造提供了直接靶点清单。局限性在于Evo1的适应性突变尚未表征，且前20个应激基因的具体名单未在本文中完整呈现。未来若能将Crp/Fnr、MarR等调控因子的敲除策略与动态pH条件耦合验证，有望获得真正耐受工业波动环境的稳健生产菌株。
参考来源
期刊：Biochemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110206
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110206