来源：Systematic optimization of fed-batch fermentation for enhanced heparosan production in engineered Corynebacterium glutamicum（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
肝素是临床广泛使用的抗凝血药物，而低分子量肝素（LMWH）因其更高的安全性和便利性成为现代医学首选抗凝剂。然而，动物组织提取和化学合成路线存在批次差异、污染风险及成本高等固有缺陷。本研究以工程化谷氨酸棒杆菌为宿主，系统优化补料分批发酵策略，通过变速率补料结合搅拌转速优化，使乙酰肝素（heparosan，肝素前体多糖）产量达到8.02 g/L，较批次发酵提高3.93倍，纯化后表观纯度达98.4%，为肝素类药物的酶化学合成提供了可持续的生产平台。
研究背景
乙酰肝素（HS）是糖胺聚糖（GAG）家族的重要成员。肝素作为HS的高度硫酸化形式，长期用于临床抗凝血和抗血栓治疗。然而，商业化肝素主要从动物组织中提取，存在生物安全性、供应一致性及患者相容性等隐患。化学合成虽可替代，但耗时费力且效率低下——由于聚合物分子量高、结构多样，合成产物往往难以重现天然肝素的生物活性。目前，Arixtra（磺达肝癸钠）是唯一市售且临床可用的合成低分子量肝素，本质为化学合成的五糖复合物。
低分子量肝素（LMWH，平均分子量4–5 kDa）作为肝素衍生物，安全性更优、给药更方便、监测需求更低，已成为现代医学首选抗凝剂。开发生物合成路线成为关键研究方向——微生物基因工程凭借安全性、可扩展性和成本效益，已成为GAG生产的主流平台，而酶化学合成策略在肝素类药物制备方面展现出良好前景。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用重组谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum ATCC13032）菌株由实验室自行构建，可生产乙酰肝素。菌株以甘油保存于−80 °C。
恢复培养基（LBHIS）用于试管或固体平板培养：蛋白胨 5 g/L、酵母粉 2.5 g/L、NaCl 5 g/L、脑心浸出液（BHI）18.5 g/L、山梨醇 9 g/L。相应固体培养基添加 2% 琼脂粉。
种子培养基（LBG）：蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L、一水葡萄糖 20 g/L。
发酵培养基：一水葡萄糖 50 g/L、尿素 5 g/L、玉米浆粉 20 g/L、生物素 4×10⁻⁴ g/L、VB1 4×10⁻⁴ g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、二水氯化钙 29.4 mg/L、七水硫酸镁 1.2325 g/L、微量元素 0.2%。微量元素配制方法：FeSO₄·7H₂O 1 g、MnSO₄·H₂O 1 g、ZnSO₄·7H₂O 0.1 g、CuSO₄ 0.2 g、NiCl₂·6H₂O 0.002 g，加水定容至 100 mL，加入 100 μL 浓盐酸，过膜灭菌。
【数据】菌株：重组谷氨酸棒杆菌 ATCC13032；保存温度：−80°C；LBHIS 培养基：蛋白胨 5 g/L、酵母粉 2.5 g/L、NaCl 5 g/L、BHI 18.5 g/L、山梨醇 9 g/L；LBG 培养基：蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L、一水葡萄糖 20 g/L；发酵培养基：一水葡萄糖 50 g/L、尿素 5 g/L、玉米浆粉 20 g/L、生物素 4×10⁻⁴ g/L、VB1 4×10⁻⁴ g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、二水氯化钙 29.4 mg/L、七水硫酸镁 1.2325 g/L、微量元素 0.2%
2.2 菌株培养与发酵
从−80 °C冰箱取出菌株，于30 °C水浴中解冻，接种至固体培养基，在摇床中30 °C培养36 h。挑取单菌落接种至试管培养16 h，随后转接至种子培养基培养12 h，直至OD₆₀₀达到8–10。上述菌体在含50 mg/L卡那霉素和5 mg/L氯霉素的培养基中，按5%（v/v）接种量，于30 °C、200 rpm摇床中培养。
发酵实验在5 L发酵罐（BXBIO，上海，中国）中进行，初始工作体积1.5 L。发酵过程中，通过在线pH控制系统自动维持培养液pH为7.0 ± 0.2，酸碱调节剂为：硫酸溶液（浓H₂SO₄按1:14（v/v）稀释）和25%（w/w）氨水溶液。培养温度通过夹套式循环水系统精确控制在30.0 ± 0.1 °C，通气速率恒定保持在3 L/min。培养7–8 h后（OD₆₀₀ = 20–30），加入IPTG至终浓度0.8 mM以诱导目的基因表达。定期取样分析生物量（OD₆₀₀）、细胞干重（DCW）、残余葡萄糖浓度及乙酰肝素滴度。
【数据】接种量：5%（v/v）；抗生素：卡那霉素 50 mg/L、氯霉素 5 mg/L；发酵罐：5 L（BXBIO），初始工作体积 1.5 L；pH：7.0 ± 0.2；温度：30.0 ± 0.1 °C；通气速率：3 L/min；IPTG 诱导：终浓度 0.8 mM，培养 7–8 h 后（OD₆₀₀=20–30）
2.3 补料分批培养
发酵培养基初始葡萄糖浓度为30 g/L，补料液含800 g/L葡萄糖。培养9 h后开始补料。
（1）变速率补料培养：根据发酵培养基中葡萄糖浓度变化调整补料速率，64 h内总葡萄糖消耗量为687 g。
（2）脉冲补料培养：当残余葡萄糖浓度低于10 g/L时，通过脉冲补料将葡萄糖浓度恢复至50 g/L，64 h发酵培养中总葡萄糖消耗量为686 g。
（3）恒速率补料培养：蠕动泵以恒定速率供料，每次运行2.5 s、间隔100 s，64 h培养中总葡萄糖消耗量为771 g。
（4）DO-stat补料培养：当发酵罐DO值高于30%后进行补料，80 h总补料量为650 g。
【数据】初始葡萄糖浓度：30 g/L；补料液葡萄糖浓度：800 g/L；补料起始时间：培养 9 h 后；变速率补料总耗糖：687 g/64 h；脉冲补料总耗糖：686 g/64 h；恒速率补料：2.5 s 运行/100 s 间隔，总耗糖 771 g/64 h；DO-stat 补料：DO>30% 触发，总补料 650 g/80 h
2.4 咔唑硫酸法测定
一轮发酵结束后，从−20 °C冰箱取出发酵液，解冻后8000 rpm离心20 min，细胞沉淀用去离子水洗涤两次，用去离子水稀释并沉淀至OD₆₀₀为40。使用低温超高压连续流细胞破碎仪（JNBIO，广州，中国）在1400 bar压力下破碎细胞膜，每个样品循环处理五次。样品于4 °C、8000 rpm离心20 min，向上清液中加入3%（w/v）氯化钠，再加入3倍体积无水乙醇，混合物置于4 °C冰箱中2–4 h。再次离心弃上清，沉淀风干。
将样品溶于去离子水，取100 μL样品置于1.5 mL离心管中。加入500 μL冰浴硼砂硫酸溶液，混匀后置于冰上。冷却后在95 °C金属浴中反应10 min。冰上冷却后加入20 μL咔唑试剂，于95 °C金属浴中反应15 min。
硼砂硫酸溶液的配制方法：将100 mL浓硫酸与0.954 g硼砂充分混合。咔唑试剂的配制方法：将100 mL无水乙醇与0.125 g咔唑充分混合。
用酶标仪（Thermo，Waltham，马萨诸塞州，美国）测定样品吸光度，根据葡萄糖醛酸标准曲线计算样品中葡萄糖醛酸浓度，进一步计算乙酰肝素滴度。D-葡萄糖醛酸购自Alfa Aesa。乙酰肝素滴度（g/L）= 葡萄糖醛酸浓度 / 0.4656。
【数据】离心：8000 rpm、20 min；细胞破碎：1400 bar、循环 5 次；OD₆₀₀ 调整至 40；NaCl 添加：3%（w/v）；无水乙醇：3 倍体积；4°C 沉淀 2–4 h；样品量：100 μL；硼砂硫酸溶液：500 μL（浓硫酸 100 mL + 硼砂 0.954 g）；95°C 反应 10 min；咔唑试剂：20 μL（无水乙醇 100 mL + 咔唑 0.125 g）；95°C 反应 15 min；换算系数：滴度 = 葡萄糖醛酸浓度 / 0.4656
2.5 分析方法
使用分光光度计（Mapada，上海，中国）测定细胞密度（OD₆₀₀）。葡萄糖浓度使用葡萄糖测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）测定。α-酮戊二酸（α-KG）浓度使用商业试剂盒（Solarbio，北京，中国）或配备示差折光检测器（Shimadzu，日本）的HPLC（Waters e2695，HPX-87H色谱柱，Bio-Rad，美国）测定。流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.5 mL/min，柱温维持65 °C。所有化学标准品购自Macklin（上海，中国）。
【数据】HPLC：Waters e2695、HPX-87H 柱、示差折光检测器；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.5 mL/min；柱温：65°C
2.6 乙酰肝素的分离纯化
将风干的乙酰肝素溶于去离子水，用冰醋酸调节pH至4.5。静置4 h后，通过等电沉淀去除残余蛋白。上清离心后冻干，获得粗乙酰肝素。
使用AKTA色谱系统（Amersham 900）进一步纯化。色谱柱（DEAE Sephadex A-25，Cytiva）用缓冲液A（50 mM NaCl、50 mM NaAc，pH 4.5）平衡至UV基线（215 nm）稳定。将1 g粗样品溶于20 mL缓冲液A，上样后用5倍柱体积缓冲液A洗去未结合物质。使用缓冲液B（1.5 M NaCl、50 mM NaAc，pH 4.5）进行梯度洗脱（0–100%），流速0.5 mL/min。根据215 nm UV吸收收集乙酰肝素主峰。
为去除盐分，将洗脱液置于截留分子量（MWCO）为3500 Da的透析袋中，用去离子水透析24 h；或使用PD-10脱盐柱脱盐。最后通过冷冻干燥获得白色絮状乙酰肝素纯品。
乙酰肝素表观纯度 = 乙酰肝素含量检测值 / 冻干质量 × 100%
乙酰肝素由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的重复二糖单元组成。将纯化乙酰肝素溶于水（5 mg/mL），采用GPC（Waters 1515，水相）测定分子量。随后通过¹H NMR（Bruker，AV600）分析确认结构。
【数据】等电沉淀：pH 4.5、静置 4 h；色谱柱：DEAE Sephadex A-25；缓冲液 A：50 mM NaCl、50 mM NaAc（pH 4.5）；上样量：1 g/20 mL；洗脱：缓冲液 B（1.5 M NaCl、50 mM NaAc，pH 4.5）0–100% 梯度，0.5 mL/min；检测波长：215 nm；透析：MWCO 3500 Da、24 h；GPC：Waters 1515 水相；NMR：Bruker AV600
2.7 统计分析
所有数据通过Origin 2022或GraphPad Prism 8软件分析。数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。统计比较采用Student's t检验，显著性水平：p < 0.05；p < 0.01；p < 0.001。
【数据】统计软件：Origin 2022 / GraphPad Prism 8；数据表示：mean ± SD；检验方法：Student's t 检验；显著性阈值：p<0.05、p<0.01、p<0.001
研究结果
3.1 批次发酵中的乙酰肝素生物合成
近年来，利用基因工程菌生产乙酰肝素的研究显著增加。本研究聚焦工程化谷氨酸棒杆菌，旨在通过发酵工艺优化提高乙酰肝素滴度。
批次培养在5 L发酵罐中进行（图1B），初始葡萄糖浓度为46 g/L。DCW在20 h达到最大值22.8 g/L，乙酰肝素滴度在发酵16 h后达到峰值2.04 g/L。最大细胞生长速率和产物形成速率分别为2.61 g/L/h和0.21 g/L/h。细胞内和细胞外乙酰肝素分布如图1C所示。
葡萄糖作为细胞生长和乙酰肝素合成的主要碳源，在12 h时已完全耗尽。然而，玉米浆粉继续支持生物量积累——OD₆₀₀在12至16 h间从89增至124。16 h后，生物量和乙酰肝素滴度均下降，可能归因于营养限制和代谢副产物积累。
【数据】初始葡萄糖：46 g/L；最大 DCW：22.8 g/L（20 h）；最大乙酰肝素滴度：2.04 g/L（16 h）；最大细胞生长速率：2.61 g/L/h；最大产物形成速率：0.21 g/L/h；OD₆₀₀：12 h 为 89、16 h 为 124；葡萄糖耗尽时间：12 h
3.2 补料分批发酵中的乙酰肝素生物合成
批次培养中底物浓度有限，限制了高密度细胞生长，从而制约了产物积累。补料分批发酵提供动态补料模式，可克服底物限制并提高乙酰肝素滴度。
图2显示了四种补料分批培养模式对乙酰肝素滴度的影响：恒速率培养（A）、变速率培养（C）、脉冲培养（E）和DO-stat培养（G）。各发酵过程对应的乙酰肝素胞内和胞外滴度统计如图2B/D/F/H所示。
恒速率补料中，DCW在64 h达到85.1 g/L，乙酰肝素滴度在56 h达到峰值7.36 g/L，分别较批次培养提高2.95倍和3.61倍。然而，在16–36 h期间，细胞进入指数生长期，葡萄糖消耗迅速。当发酵液中葡萄糖浓度降至0时，DO水平上升。细胞进入稳定生长期后，葡萄糖开始在系统中积累。因此，恒速率补料无法满足细胞动态代谢需求。
变速率策略（图2C/D）中，最大DCW在36 h为74.4 g/L，乙酰肝素滴度在56 h达到8.02 g/L，分别较批次培养提高2.58倍和3.93倍。
脉冲补料（图2E/F）中，生物量在44 h达到73.8 g/L，乙酰肝素滴度在40 h达到峰值7.36 g/L，均约为批次培养的3.6倍。
DO-stat模式（图2G/H）中，当DO超过30%时触发补料，72 h后获得68 g/L DCW和3.74 g/L乙酰肝素。
在这些策略中，变速率补料获得最高乙酰肝素滴度，而恒速率补料获得最高DCW。这表明葡萄糖浓度必须与代谢需求动态匹配，才能优化细胞生长和乙酰肝素生物合成。
整个发酵周期中，菌株在40 h进入生长平台期。恒速率培养系统中，指数生长期葡萄糖消耗速率显著加快。随着葡萄糖浓度降低，微生物耗氧量逐渐下降，发酵液中DO水平急剧上升，细胞维持碳源半饥饿状态（图4B）。进入稳定生长期后，碳源供应变得充足，生物量持续积累。最大生物量和最大DCW均显著高于其他实验组（表1）。值得注意的是，在此阶段乙酰肝素滴度实现了显著提升（图2A/B）。
DO-stat补料策略虽能响应代谢动态，但其核心功能仅限于维持正常细胞生长，难以同时优化乙酰肝素生物合成。细胞最大生物量和最大DCW均低于其他组，乙酰肝素产量显著降低约50%（图2G/H和表1）。
脉冲补料虽缓解了碳源限制，但周期性高浓度葡萄糖冲击会诱导细胞渗透胁迫，对代谢过程产生不利影响。相比之下，变速率补料根据实时细胞代谢需求动态调整葡萄糖输入速率，在最小化环境胁迫的同时显著提高乙酰肝素生物合成效率。
值得注意的是，批次培养系统中乙酰肝素产率为0.044 g/g，高于补料分批培养系统（表1）。这一现象的核心原因在于：补料分批培养中葡萄糖更多分配至细胞生长和基础代谢；而批次培养发酵周期较短，有效减少了葡萄糖向维持代谢的分流，使碳源更高效地导向乙酰肝素生物合成途径。
【数据】恒速率补料：DCW 85.1 g/L（64 h）、乙酰肝素 7.36 g/L（56 h），较批次提高 2.95 倍和 3.61 倍；变速率补料：DCW 74.4 g/L（36 h）、乙酰肝素 8.02 g/L（56 h），较批次提高 2.58 倍和 3.93 倍；脉冲补料：生物量 73.8 g/L（44 h）、乙酰肝素 7.36 g/L（40 h），约为批次 3.6 倍；DO-stat：DCW 68 g/L、乙酰肝素 3.74 g/L（72 h），产量降低约 50%；批次产率：0.044 g/g
3.3 发酵过程中酸碱补充量的量化
pH值是反映微生物在特定环境条件下整体代谢活性的关键参数。它显著影响微生物生长和产物积累，因此在整个发酵过程中需要精确监测和控制pH变化。例如，Liu等人在Streptococcus zooepidemicus WSH-24的生物合成过程中，通过控制pH值使透明质酸产量提高了30%。
图3A/B描绘了变速率补料培养下的pH动态变化。
整个发酵周期中，尿素在0–8 h阶段逐渐水解产生NH₃。NH₃进一步转化为NH₄OH并释放OH⁻，导致发酵系统pH升高。8 h后，细胞进入指数生长期，伴随pH下降。这一现象主要归因于酸性代谢副产物的持续积累。
在微生物发酵系统中，有机酸作为关键代谢中间体或副产物，显著影响发酵过程的整体性能。它们的积累和相互转化通过多种关联机制直接调节pH稳定性和最终产物产量等关键工艺参数。
24 h后，细胞进入指数生长中后期，酸和碱以恒定速率补充。补碱的核心原因包括：（1）高密度发酵环境可能导致部分细胞死亡；（2）发酵中后期大量胞内产物积累诱导细胞形态变化，导致细胞膜完整性降低，加之搅拌器产生的剪切力，使细胞更易破裂死亡。如图3C所示，细胞在发酵早期（12 h）呈短杆状形态，而在后期（64 h）呈完全球形。
【数据】pH 动态：0–8 h 尿素水解产 NH₃ 致 pH 上升；8 h 后进入指数期 pH 下降；24 h 后酸碱以恒定速率补充；细胞形态：12 h 短杆状、64 h 球形
3.4 残糖对代谢副产物积累的影响
在微生物发酵系统中，有机酸是糖酵解和三羧酸（TCA）循环产生的关键中间体或副产物。它们的生物合成受复杂代谢网络精确调控，并对乙酰肝素产量产生显著影响。
本研究采用HPLC定量了丙酮酸、乳酸、乙酸以及TCA循环关键中间体——包括α-酮戊二酸（α-KG）、琥珀酸、富马酸和苹果酸的浓度。结果表明，仅α-KG呈现明显峰（图4A）。
【数据】检测代谢物：丙酮酸、乳酸、乙酸、α-KG、琥珀酸、富马酸、苹果酸；显著峰：仅 α-KG
3.5 搅拌转速优化
搅拌转速通过影响溶氧水平和剪切力，直接调节细胞代谢和产物合成。图5显示了不同搅拌转速下的发酵表现。
【数据】搅拌转速测试范围：400–700 rpm（原文未详述各转速具体数值）
3.6 乙酰肝素的分离纯化
图6显示了乙酰肝素的分离纯化结果。
【数据】纯化结果详见下文讨论（原文未在此处提供具体数值）
讨论与解读
本研究首次系统优化了工程化谷氨酸棒杆菌生产LMWH的发酵工艺。结果表明，补料分批发酵模式显著优于批次培养，大幅提高了细胞生物量积累和乙酰肝素滴度。具体而言，采用变速率补料策略结合500 rpm搅拌转速（维持DO在15–30%），最大乙酰肝素滴度达到8.02 g/L。将发酵系统中葡萄糖浓度控制在1–10 g/L可有效平衡细胞生长和产物形成，同时最小化副产物积累，优化后工艺的葡萄糖转化效率达到0.021 g/g。经多步纯化后，所得乙酰肝素表观纯度为98.4%；¹H NMR和GPC表征确认产物具有预期的化学性质和分子量（约5.9 kDa）。本研究建立了高效、可扩展的发酵和纯化平台，为肝素类抗凝药物的酶化学合成奠定了可持续基础。
编译者解读
本研究的核心价值在于将发酵工程思维系统性地引入肝素前体生产——变速率补料策略的胜出并非偶然，它精准回应了细胞在不同生长阶段对碳源的动态需求，避免了恒速率补料的"供需错配"和脉冲补料的"渗透冲击"。500 rpm转速与DO 15–30%的组合看似简单，实则是细胞生长、产物合成与能耗之间的精妙平衡点。8.02 g/L的产量和98.4%的纯度已具备工业转化潜力。局限在于：葡萄糖转化效率0.021 g/g仍偏低，大量碳源流向生物量和维持代谢——后续若能通过代谢工程强化乙酰肝素合成通路、削弱竞争分支，产率有望进一步提升。此外，5.9 kDa的产物分子量已接近LMWH区间，这为后续酶法修饰直接制备低分子量肝素铺平了道路。
参考来源
Qiang Xue. Systematic optimization of fed-batch fermentation for enhanced heparosan production in engineered Corynebacterium glutamicum. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149687
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.149687