来源：Heterologous expression of cryptic biosynthetic gene cluster from Streptomyces prunicolor yields novel bicyclic peptide prunipeptin（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPPs）是一类结构多样、生物活性丰富的天然产物。本研究从放线菌 Streptomyces prunicolor 基因组中挖掘到一个仅含两个基因的ω-酯键合肽（OEP）生物合成基因簇，通过在大肠杆菌中的异源共表达成功获得新型双环肽prunipeptin。定点突变与化学裂解相结合的策略确定了其双环桥接模式——一个酯键加一个异肽键，并证实单个ATP-grasp连接酶PruB具有双重催化功能。该研究为理解RiPPs的生物合成逻辑提供了新案例。
研究背景
核糖体合成及翻译后修饰肽（RiPPs）是天然存在的肽类大家族，包含二十多个亚类。近年来，一类新的RiPPs——含ω-酯键的肽（OEPs）被提出。OEPs的生物合成基因簇通常仅含两个必需基因：前体肽编码基因和ATP-grasp连接酶编码基因。基于细菌基因组的生物信息学分析，共发现约1500个候选OEPs，分布在12个组中。此前研究已通过异源表达获得plesiocin（含四个发夹样双环重复结构）和thuringinin（含三个串联发夹样结构）等OEPs。然而，这些已知OEPs的桥接模式存在差异，暗示不同组别的OEPs可能采用不同的环化策略。本研究聚焦于第11组OEPs，该组包含534个生物合成基因簇，主要分布于放线菌中。
研究方法
2.1 表达载体pET-41a-13075的构建
prunipeptin基因簇（1,190 bp，包含pruA和pruB基因）经Eurofins Genomics K.K.（日本东京）提供的算法按大肠杆菌密码子偏好性优化后化学合成，并插入克隆载体pEX-K4J2中，获得pEX-K4J2-13075。pEX-K4J2-13075载体与pET-41a(+)载体分别用XbaI和HindIII-HF（New England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇）按制造商说明书进行双酶切。将两个DNA产物——含pruA和pruB的DNA片段与酶切后的pET-41a(+)——使用Ligation-Convenience Kit（Nippon gene Co., Ltd.，日本东京）连接，获得载体pET-41a-13075。取10 μL连接混合物通过化学感受态转化法转化大肠杆菌DH5α，涂布于含卡那霉素（终浓度30 μg/mL）的LB琼脂平板上。使用FastGene Plasmid Mini Kit（Nippon Genetics Co., Ltd.，日本东京）纯化载体pET-41a-13075。最后，将该载体通过化学感受态法转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，用于prunipeptin的异源表达。
【数据】基因簇长度：1,190 bp；限制酶：XbaI、HindIII-HF；转化体积：10 μL；卡那霉素浓度：30 μg/mL；宿主菌：E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)
2.2 pruA基因的定点突变
所有定点突变均通过重叠延伸PCR反应完成（Bryksin和Matsumura, 2010）。以pET-41a-13075为模板DNA，使用携带突变的引物组（表S1）通过PCR获得含突变的DNA片段。PCR管中依次加入4.0 μL dH₂O、5.0 μL 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix（Nippon Genetics Co., Ltd.）、0.3 μL正向引物和反向引物（10 μM）、0.4 μL载体pET-41a-13075（150 pg/μL）。DNA扩增按制造商说明书进行。取10 μL PCR混合物通过化学感受态转化法转化大肠杆菌DH5α，涂布于含卡那霉素（终浓度30 μg/mL）的LB琼脂平板。含突变的载体使用FastGene Plasmid Mini Kit（Nippon Genetics Co., Ltd.）纯化。测序由Fasmac Co., Ltd.（日本神奈川）完成。
【数据】PCR体系：dH₂O 4.0 μL、2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix 5.0 μL、引物各0.3 μL（10 μM）、模板0.4 μL（150 pg/μL）；卡那霉素浓度：30 μg/mL
2.3 prunipeptin及其变体的异源表达
携带pET-41a-13075载体或含突变pET-41a-13075载体的大肠杆菌BL21(DE3)在含卡那霉素（终浓度30 μg/mL）和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度0.1 mM）的两块改良基础琼脂培养基平板上，于30°C培养24小时。改良基础琼脂培养基的配制方法为：在1 L蒸馏水中加入无机盐成分（K₂SO₄ 2 g、K₂HPO₄ 3 g、NaCl 1 g、NH₄Cl 5 g、MgSO₄·7H₂O 80 mg、CuCl₂ 0.5 mg、MnSO₄·H₂O 0.35 mg、FeCl₃ 0.5 mg、CaCl₂·2H₂O 0.5 mg）和15 g琼脂，调pH至7.3。高压灭菌后，分别补充单独灭菌的葡萄糖和酵母提取物溶液，终浓度分别为0.25%和0.4%。用实验室刮刀收集菌体，加入两倍体积的MeOH提取。离心后，将MeOH提取液上样至制备型HPLC，使用Wakopak Handy ODS色谱柱（4.6 × 250 mm，Fujifilm Wako Pure Chemical Co.，日本大阪），采用两种溶剂梯度洗脱模式（溶剂A：含0.05% TFA的H₂O；溶剂B：含0.05% TFA的MeCN）。梯度程序为20分钟内溶剂B从14%升至24%。UV检测波长设为220 nm。
【数据】IPTG浓度：0.1 mM；温度：30°C；时间：24h；培养基无机盐：K₂SO₄ 2 g/L、K₂HPO₄ 3 g/L、NaCl 1 g/L、NH₄Cl 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 80 mg/L、CuCl₂ 0.5 mg/L、MnSO₄·H₂O 0.35 mg/L、FeCl₃ 0.5 mg/L、CaCl₂·2H₂O 0.5 mg/L；葡萄糖：0.25%；酵母提取物：0.4%；pH：7.3；HPLC梯度：14%→24% B，20 min；UV：220 nm
2.4 变体肽prunipeptin 15HW的分离
携带突变表达载体（pruA中His突变为Trp）的大肠杆菌BL21(DE3)在1 L改良基础琼脂培养基（含卡那霉素终浓度30 μg/mL和IPTG终浓度0.1 mM）中于30°C培养24小时。用实验室刮刀收集菌体，以两倍体积MeOH提取。离心后，将MeOH提取液上样至制备型HPLC，使用Wakopak Handy ODS色谱柱（4.6 × 250 mm，Fujifilm Wako Pure Chemical Co.），等度洗脱模式（流速：1 mL/min，溶剂：含0.05% TFA的17% MeCN）。在UV检测波长220 nm下重复进行HPLC纯化，获得prunipeptin 15HW（保留时间：14.0 min）。1 L培养物产量为2.0 mg。
【数据】培养体积：1 L；温度：30°C；时间：24h；流速：1 mL/min；溶剂：17% MeCN含0.05% TFA；保留时间：14.0 min；产量：2.0 mg/L
2.5 prunipeptin 15HW的碱水解
将prunipeptin 15HW（0.5 mg）溶解于0.1 N NaOH溶液（0.8 mL）中。室温孵育30分钟后，加入1 N HCl溶液（80 μL）中和。混合物上样HPLC分析，获得酯键打开的prunipeptin 15HW。HPLC纯化使用Wakopak Handy ODS色谱柱（4.6 × 250 mm，Fujifilm Wako Pure Chemical Co.），梯度洗脱模式（溶剂A：含0.05% TFA的H₂O；溶剂B：含0.05% TFA的MeCN）。梯度程序为20分钟内溶剂B从18%升至23%。UV检测波长220 nm。
【数据】样品量：0.5 mg；NaOH浓度：0.1 N；孵育时间：30 min；HCl浓度：1 N，80 μL；HPLC梯度：18%→23% B，20 min；UV：220 nm
2.6 prunipeptin 15HW的BNPS-skatole处理
将prunipeptin 15HW（0.3 mg）溶解于90%乙酸（0.5 mL）中。加入BNPS-skatole（1.0 mg），于90°C孵育1小时。用旋转蒸发仪蒸干溶液。冷冻干燥机完全去除溶剂后，向反应混合物中加入CHCl₃和H₂O进行两相分配。离心（10,000 rpm，1分钟）后，分离H₂O层并上样HPLC纯化。HPLC纯化使用Wakopak Handy ODS色谱柱（4.6 × 250 mm，Fujifilm Wako Pure Chemical Co.），梯度洗脱模式（溶剂A：含0.05% TFA的H₂O；溶剂B：含0.05% TFA的MeCN）。梯度程序为20分钟内溶剂B从10%升至30%。UV检测波长220 nm。
【数据】样品量：0.3 mg；BNPS-skatole：1.0 mg；温度：90°C；时间：1h；离心：10,000 rpm，1 min；HPLC梯度：10%→30% B，20 min；UV：220 nm
2.7 质谱实验
精确MS和源内碰撞诱导解离（CID）实验使用LC-TOF-MS（JMS-T100LC，JEOL）进行。肽样品溶解于10–20%的MeCN水溶液中。测量按制造商说明书操作。
【数据】质谱仪：LC-TOF-MS（JMS-T100LC，JEOL）；溶剂：10–20% MeCN水溶液
2.8 蛋白酶抑制实验
蛋白酶抑制实验（胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶）参照先前报道的方法进行（Unno et al., 2020）。
【数据】测试酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶；具体参数：原文未详述
研究结果
3.1 第11组OEPs生物合成基因簇分析
在第11组OEPs中，534个生物合成基因簇分布于放线菌门，主要存在于链霉菌属。第11组的生物合成基因簇通常包含两个基因：前体肽编码基因和ATP-grasp连接酶编码基因。链霉菌属前体肽编码基因的氨基酸序列比对如图1所示。通常，前体肽的N端具有前导肽区域，C端为核心肽区域。前导肽区域是修饰酶识别所必需的。核心肽区域完成修饰后，前导肽区域被切除。这些肽在前导肽区域的N端似乎存在多个保守基序（QPFALNYARPA、PYXYD、QLNV）。在前体编码基因中，核心肽区域通常在C端具有共有序列RE(L/V)GTTTSTAGSKTHFDD。为获得由该类生物合成基因簇合成的新的OEP，选择 Streptomyces prunicolor 的生物合成基因簇作为靶标，在大肠杆菌中进行克隆和共表达。
【数据】第11组BGC数量：534个；分布：放线菌门，主要链霉菌属；保守基序：QPFALNYARPA、PYXYD、QLNV；核心肽共有序列：RE(L/V)GTTTSTAGSKTHFDD
3.2 异源基因表达生产prunipeptin
S. prunicolor 的生物合成基因簇包含前体肽编码基因pruA（登录号：WP_019056920.1）和ATP-grasp连接酶编码基因pruB（登录号：WP_019056921.1）。每个基因的DNA序列根据大肠杆菌密码子使用偏好性进行优化，并化学合成DNA序列（图S1）。包含pruA和pruB的DNA序列（1,190 bp）整合到表达载体pET-41a(+)中，获得pET-41a-13075（图S2）。该载体在大肠杆菌DH5α中克隆后，转化至大肠杆菌BL21(DE3)。携带pET-41a-13075载体的大肠杆菌BL21(DE3)在含卡那霉素和IPTG的改良基础琼脂培养基上于30°C培养24小时。用实验室刮刀收集菌体，以两倍体积MeOH提取，MeOH提取液经HPLC和ESI-MS分析。该转化子被证实可产生若干类似肽（图S3和S4）。其中，分离获得产量最高的肽，命名为prunipeptin。prunipeptin的精确ESI-MS分析显示[M +2H]²⁺离子峰m/z 866.3945（计算m/z值为866.3947），表明分子式为C₇₃H₁₁₀N₂₀O₂₉（图S5）。prunipeptin的源内CID分析（表S2和图S6）通过y系列离子（y11–y16）确定了N端氨基酸序列为ELGTTT（图2A）。结合分子式，推测prunipeptin的氨基酸序列为ELGTTTSTAGSKTHFDD，且脱去两分子H₂O。由于prunipeptin的C端含有两个Asp残基，推测这两个Asp分别与Ser、Thr或Lys形成酯键或异肽键。源内CID分析中STAGSKTHFDD序列未观察到碎片离子，推测环状结构是导致该现象的原因。
【数据】pruA登录号：WP_019056920.1；pruB登录号：WP_019056921.1；DNA片段长度：1,190 bp；[M+2H]²⁺ m/z：866.3945（计算值866.3947）；分子式：C₇₃H₁₁₀N₂₀O₂₉；序列：ELGTTTSTAGSKTHFDD（脱去2 H₂O）
3.3 定点突变实验生产prunipeptin变体
为确定prunipeptin中参与酯键或异肽键形成的氨基酸残基，对载体pET-41a-13075进行定点突变实验（Bryksin和Matsumura, 2010），分别将prunipeptin中的第7位Ser、第8位Thr、第11位Ser、第12位Lys、第13位Thr替换为Ala（图3）。当第8位Thr、第11位Ser和第13位Thr被替换时，携带突变载体的转化子提取物中可通过HPLC和ESI-MS检测到Ala替换的prunipeptin（图S7和S8）（图3）。当第7位Ser、第12位Lys、第16位Asp和第17位Asp被单氨基酸替换时，转化子提取物中未通过HPLC检测到预期肽（图S7）（图3）。通过定点突变实验，设计使一个分子内键无法形成。推测第7位Ser、第12位Lys、第16位Asp和第17位Asp的定点突变导致产生了未完全修饰或未修饰的肽，这些肽可被大肠杆菌内源蛋白酶降解。因此，推测第7位Ser和第12位Lys与第16位或第17位Asp形成酯键或异肽键，但桥接模式尚不明确。
【数据】替换位点：7Ser、8Thr、11Ser、12Lys、13Thr→Ala；检出变体：8Thr、11Ser、13Thr替换；未检出变体：7Ser、12Lys、16Asp、17Asp替换
3.4 prunipeptin 15HW的结构确定
肽中环状结构的氨基酸序列分析通常较为困难，因为MS/MS实验通常不产生碎片离子。此外，肽的环状结构往往赋予其蛋白酶抗性。通常使用BNPS-skatole等化学裂解试剂打开环状结构。在actinokineosin（Takasaka et al., 2017）和achromosin（Kaweewan et al., 2017）等环肽的结构解析中，BNPS-skatole反应通过切割Trp C端的肽键高效打开环状结构。为将Trp引入环状结构，通过pET-41a-13075质粒的定点突变实验将His替换为Trp（图3）。携带His→Trp替换突变载体的转化子产生了预期肽（图S9），包括单氨基酸替换的prunipeptin变体prunipeptin HW（氨基酸序列：ELGTTTSTAGSKTWFDD）及其截短肽prunipeptin 15HW（氨基酸序列：GTTTSTAGSKTWFDD）。精确ESI-MS确认了肽的分子式，表明两种肽均如prunipeptin一样，从线性肽的预期分子式中脱去两分子H₂O（图S10）。意外的是，携带His→Trp替换突变载体的转化子产生的prunipeptin 15HW产量约为prunipeptin的5倍（图S11）。为进行结构解析，从1 L转化子培养物中分离获得prunipeptin 15HW（2.0 mg）（图S12）。以DMSO-d₆为溶剂进行NMR分析，但由于NMR谱峰过宽，解析困难。prunipeptin 15HW的源内CID分析（表S3和图S13）确定了N端序列为GTTT（图2B）。prunipeptin 15HW的环状部分与prunipeptin一样未产生碎片离子。为确定异肽键模式，对prunipeptin 15HW进行碱水解。结果通过HPLC获得酯键裂解的prunipeptin 15HW（图2C和S14A）。为确定桥接模式，对酯键裂解的prunipeptin 15HW进行源内CID分析（表S4和图S15）。结果检测到y6+H₂O–y14离子系列，表明N端氨基酸序列为GTTTSTAGS（图2C）。此外，检测到b14离子，表明第10位Lys与第14位Asp之间存在异肽键。为确定环内氨基酸序列（KTWFD），进行BNPS-skatole处理（Fontana, 1972; Crimmins et al., 2005）。结果获得Trp C端裂解的prunipeptin 15HW（图2D和S14B）。在BNPS-skatole反应中，肽中的Trp残基被氧化并转化为带螺内酯的3-氧吲哚（Fontana, 1972）。通过源内CID分析，检测到y8–y11、b10、b11和y'5离子（表S5和图S16），确认了Trp C端裂解的prunipeptin 15HW的结构（图2D）。prunipeptin 15HW的桥接模式被确定为酯键（第5位Ser与第15位Asp）和异肽键（第10位Lys与第14位Asp），如图2B所示。prunipeptin的桥接模式也被推测如图2A所示。
【数据】prunipeptin HW序列：ELGTTTSTAGSKTWFDD；prunipeptin 15HW序列：GTTTSTAGSKTWFDD；15HW产量：约为prunipeptin的5倍；分离量：2.0 mg/L；桥接模式：酯键（5Ser-15Asp）、异肽键（10Lys-14Asp）
3.5 prunipeptin 15HW的蛋白酶抑制实验
已有报道表明其他环肽如microviridins具有蛋白酶抑制活性（Ishitsuka et al., 1990; Okino et al., 1995; Shin et al., 1996; Murakami et al., 1997; Fujii et al., 2000; Rohrlack et al., 2003; Reshef和Carmeli, 2006; Dehm et al., 2019）……
【数据】测试酶：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶；抑制活性结果：原文未详述（原文节选在此处截断）
讨论与解读
在microviridin B的生物合成中，两个ATP-grasp连接酶MdnB和MdnC分别负责形成两个酯键和一个异肽键。MdnC的功能被确定为形成两个酯键，而MdnB则催化异肽键的形成。第5组的ATP-grasp连接酶可分子内催化两个酯键和一个异肽键生成OEP5-1。本研究表明，ATP-grasp连接酶PruB同样具有双功能催化活性，可在分子内形成一个酯键和一个异肽键。然而，OEP5-1与prunipeptin的桥接形成模式相似度较低。通过Blastp搜索比较PruB与OEP5-1的ATP-grasp连接酶（登录号：GAJ78971.1）的氨基酸序列，结果显示两种蛋白质的序列相似性仅为25%，且比对中未发现保守区域（表S7）。基于X射线晶体学获得的MdnC结构，其反应机制已被研究。MdnC的晶体结构分析表明，前导序列被α7螺旋和β9β10发夹结构之间的口袋识别，核心肽区域被招募……
【编译者解读】
本研究展示了基因组挖掘与异源表达策略在发现新型RiPPs中的高效性——仅两个基因的最小基因簇即可在大肠杆菌中重构出结构新颖的双环肽。PruB单酶催化形成酯键与异肽键的双功能特性，为ATP-grasp连接酶的底物识别与催化机制研究提供了独特模型。值得关注的是，His→Trp突变意外将产量提升约5倍，这一现象暗示前体肽序列对抗降解或修饰效率的深层影响。但NMR谱峰过宽导致的解析困难也提示，此类环肽的结构表征仍需依赖化学裂解与MS联用的经典策略。未来若能将PruB的底物混杂性与工程改造结合，有望创制结构多样的环肽骨架。
参考来源
Unno, K. (2021). Heterologous expression of cryptic biosynthetic gene cluster from Streptomyces prunicolor yields novel bicyclic peptide prunipeptin. Microbiological Research, 2021. DOI: 10.1016/j.micres.2020.126669
DOI: 10.1016/j.micres.2020.126669