来源：Unravelling cryptic phosphonate biosynthesis in Chelatococcus asaccharovorans through genome mining（Computational Biology and Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
膦酸酯类天然产物因稳定的碳-磷（C–P）键而具有独特的化学稳定性和生物活性。本研究对4株公开可用的C. asaccharovorans基因组及相近物种进行比较基因组挖掘，在2株菌中鉴定出含磷酸烯醇丙酮酸变位酶（PepM）的膦酸酯生物合成基因簇。功能注释揭示了一套保守的膦酸酯合成相关基因，与已知FR-900098、dehydrophos等途径呈中等相似度，表明这些基因簇可能代表进化上独特的膦酸酯生物合成途径。
研究背景
膦酸酯是一类具有稳定碳-磷键的天然产物，该结构赋予其极强的抗化学降解和酶解能力，在医药和农业领域具有重要价值。例如，磷霉素（Fosfomycin）作为抗生素抑制细菌细胞壁合成，草铵膦（Phosphinothricin）作为除草剂抑制谷氨酰胺合成酶。在微生物中，膦酸酯生物合成由磷酸烯醇丙酮酸变位酶（PepM）催化形成第一个C–P键，该酶是膦酸酯生物合成途径的标志性酶。随着全基因组测序数据的积累和antiSMASH等生物信息学工具的发展，膦酸酯生物合成基因簇（BGCs）的鉴定与表征已大大推进。然而，膦酸酯产生菌历史上仅局限于少数研究较深入的细菌属。本研究对C. asaccharovorans及相关Chelatococcus物种进行基因组挖掘，旨在探索该属菌株的膦酸酯生物合成潜力。
研究方法
2.1 基因组数据获取
C. asaccharovorans及相关Chelatococcus spp.的全基因组序列从NCBI GenBank数据库获取。仅纳入公开可用的近完整和完整基因组装配。装配统计信息（包括基因组大小、GC含量和连续性指标）从NCBI记录中获取。基因组完整性和污染度通过KBase平台上的Assess Genome Quality with CheckM应用以默认参数进行评估。CheckM是一种基于参考系统发育树中基因组位置确定的谱系特异性标记基因集来评估基因组质量的自动化工具（Parks et al., 2015）。仅满足质量阈值（完整性≥95%，污染度≤5%）的基因组被纳入后续生物合成基因簇（BGC）预测和比较基因组分析。通过KBase生成的CheckM输出文件已作为补充数据S1提供，以确保基因组质量评估的透明性和可重复性。
【数据】数据库：NCBI GenBank；质量阈值：完整性≥95%，污染度≤5%；工具：CheckM（KBase平台，默认参数）
2.2 膦酸酯BGC的鉴定
使用antiSMASH网络服务器（版本8.0）采用细菌分析流程进行BGC鉴定（Blin et al., 2025）。基因组序列采用严格检测设置进行分析，以最小化假阳性预测并提高BGC鉴定的可靠性。启用的附加分析包括KnownClusterBlast、MIBiG簇比较、TFBS分析、ActiveSiteFinder、SubClusterBlast和RREFinder，以支持预测BGC的功能注释、比较评估和表征。可选模块包括ClusterBlast、Cluster Pfam分析、基于Pfam的GO术语注释、NCBI基因组上下文链接和TIGRFam分析未予选择。基因组挖掘专门针对膦酸酯相关的生物合成基因簇，特别侧重于PepM的鉴定——该酶是催化碳-磷（C–P）键形成的特征性酶。推定的膦酸酯BGC通过检查antiSMASH预测簇内的基因组成和基因组织进行人工管理。所有分析均保留antiSMASH预测的簇边界。
【数据】工具：antiSMASH 8.0；检测设置：严格；启用分析：KnownClusterBlast、MIBiG簇比较、TFBS分析、ActiveSiteFinder、SubClusterBlast、RREFinder
2.3 功能注释与基因组分析
预测膦酸酯BGC内的开放阅读框（ORFs）通过BLASTp搜索NCBI非冗余（nr）蛋白质数据库进行功能注释。使用NCBI保守结构域数据库（CDD）鉴定保守蛋白结构域，以支持生物合成基因的功能分配。推定生物合成功能基于BLASTp同源性、保守结构域架构和标志性膦酸酯生物合成基因（特别是PepM）的存在进行综合分配。使用antiSMASH输出分析簇架构，以表征预测膦酸酯BGC内核心生物合成基因、调控元件和辅助生物合成基因的排列。整个分析过程中保留antiSMASH预测的簇边界，而各ORF的功能分配则使用BLASTp和CDD结果进行精化。仅保留位于antiSMASH预测簇边界内且获得BLASTp和CDD注释支持的ORFs用于后续比较和功能分析。详细的BLASTp注释结果和保守结构域注释（CDD）见补充表S1。
【数据】数据库：NCBI nr蛋白数据库、NCBI CDD；分析工具：BLASTp、CDD
2.4 与MIBiG数据库的比较分析
将预测的膦酸酯BGC与MIBiG（Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster）数据库进行比较，以鉴定最接近的已表征参考簇。antiSMASH生成的相似性指标用作描述性度量，用于评估预测簇与已知簇之间的相关性，而非推断性统计度量。基于序列相似性、基因组织和共享的核心生物合成组分，簇被分类为与已知途径密切相关、趋异变体或推定新颖。该比较框架能够评估所鉴定膦酸酯BGC的进化背景和潜在新颖性。
【数据】数据库：MIBiG；比较工具：antiSMASH相似性指标
研究结果
3.1 全基因组测序数据与装配特征
本研究纳入了C. asaccharovorans（CA−1至CA−4）全基因组序列及其他Chelatococcus物种，包括C. albus、C. composti、C. daeguensis和C. sambhunathii。基因组装配、登录号、BioProject标识符和详细装配统计信息见表1。分析数据集包含从NCBI数据库获取的contig、scaffold和完整基因组水平装配。在4株C. asaccharovorans菌株中，基因组大小为7.2至7.3 Mb，GC含量约为64%。相比之下，种间比较显示其他Chelatococcus物种的基因组较小（约3.7–4.4 Mb），GC含量略高（68–69%）。装配连续性在数据集中存在差异，contig N50值范围为86.3 kb至5.7 Mb，反映了装配质量的差异。尽管存在这种异质性，基因组质量评估显示所有基因组的完整性一致地高（≥99%），污染度低（<2%），确认了这些装配适用于可靠的BGC挖掘。
【数据】基因组大小：C. asaccharovorans 7.2–7.3 Mb，其他Chelatococcus约3.7–4.4 Mb；GC含量：C. asaccharovorans约64%，其他物种68–69%；N50：86.3 kb–5.7 Mb；完整性：≥99%；污染度：<2%
3.2 膦酸酯BGC的鉴定
使用antiSMASH 8.0版进行的基因组挖掘在分析的12个Chelatococcus基因组中的2个中鉴定出推定膦酸酯生物合成基因簇。这些阳性结果仅限于4株C. asaccharovorans中的2株（CA−1和CA−2），而CA−3、CA−4及所有相关Chelatococcus物种缺乏膦酸酯核心生物合成簇。在CA−1菌株中，编码PepM（催化碳-磷（C–P）键形成的关键酶）的基因在确定的基因组位点内被检测到。在CA−2菌株中，相应酶被注释为磷酸烯醇丙酮酸磷酸变位酶，功能上等同于PepM。在两株阳性菌株中，膦酸酯相关基因定位于离散的基因组区域，呈现出典型生物合成基因簇的有组织排列特征。对预测簇的人工检查确认了核心生物合成基因及相关辅助元件的存在，支持了这些菌株的预测膦酸酯生物合成潜力。CA−1和CA−2的antiSMASH预测膦酸酯BGC架构如图1所示。
尽管使用PlasmidFinder进行的计算机筛选未检测到染色体外元件，但在没有实验性质粒提取和长读长测序的情况下，不能完全排除这些簇可能位于大型未作图的巨型质粒上的可能性。
【数据】阳性菌株：CA−1、CA−2（共12个基因组中2个）；阴性菌株：CA−3、CA−4及其他Chelatococcus物种；工具：antiSMASH 8.0、PlasmidFinder
3.3 膦酸酯BGC的功能注释与基因组成
基于BLASTp对antiSMASH预测的膦酸酯生物合成基因簇（BGCs）内开放阅读框（ORFs）的功能注释，在C. asaccharovorans菌株CA−1和CA−2中均鉴定出一套保守基因。注释的ORFs编码PepM、I/II类折叠吡哆醛磷酸（PLP）依赖性氨基转移酶、磷酸胆碱胞苷酰转移酶家族蛋白、与MocR家族转录调控因子相关的含氨基转移酶样结构域蛋白、GntR家族转录调控因子以及I类S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）依赖性甲基转移酶。保守结构域分析支持了BLASTp注释结果，并确认了与膦酸酯生物合成、氨基转移酶活性、转录调控和甲基转移酶介导的修饰功能相关的结构域的存在。值得注意的是，PepM——膦酸酯生物合成中负责碳-磷（C–P）键形成的标志性酶——在两个簇中均被鉴定到。
总体而言，基于BLASTp和保守结构域分析，CA−1和CA−2的膦酸酯BGC表现出高度相似的基因含量。观察到的簇间差异主要与antiSMASH预测区域内的基因组织和注释相关，而非核心膦酸酯生物合成基因的存在与否。基于已鉴定的基因含量，可以提出一个初步的生物合成方案。PepM的存在提示通过C–P键形成构建膦酸酯骨架，而相关的氨基转移酶可能参与将膦酸酯中间体转化为氨基膦酸酯衍生物。此外，共定位的SAM依赖性甲基转移酶可能提示甲基化介导的结构多样化的可能性。磷酸胆碱胞苷酰转移酶家族蛋白的出现进一步提示在生物合成过程中存在额外的修饰或活化反应。综合来看，这些特征与潜在产生修饰的氨基膦酸酯代谢物一致，但精确的中间体、反应顺序和最终化学结构仍有待实验确定。
【数据】注释基因：PepM、PLP依赖性氨基转移酶、磷酸胆碱胞苷酰转移酶家族蛋白、MocR家族调控因子相关氨基转移酶样蛋白、GntR家族转录调控因子、I类SAM依赖性甲基转移酶；菌株：CA−1、CA−2
3.4 与MIBiG数据库的比较分析
使用antiSMASH相似性指标，将CA−1和CA−2的预测膦酸酯BGC与MIBiG数据库进行对比分析。两个簇的最佳匹配均为先前已表征的膦酸酯途径，包括FR−900098（相似度0.50）、dehydrophos（0.47）、fosfomycin（0.45）和dehydrofosmidomycin（0.39）（图2）。中等相似度值表明核心生物合成元件的部分保守性，同时提示整体簇架构存在显著差异。
综合来看，这些结果支持CA−1和CA−2簇可能代表C. asaccharovorans中进化上独特或此前未表征的膦酸酯生物合成途径的假说。
【数据】最佳匹配相似度：FR-900098（0.50）、dehydrophos（0.47）、fosfomycin（0.45）、dehydrofosmidomycin（0.39）
讨论与解读
膦酸酯是一类化学性质独特且具有重要生物学意义的天然产物，其生物合成历史上与少数已充分表征的细菌属相关（Metcalf and van der Donk, 2009）。本研究首次在C. asaccharovorans中进行了基于基因组的膦酸酯相关BGC表征，拓展了膦酸酯生物合成多样性的认知。关键发现是在4株分析的C. asaccharovorans基因组中有2株鉴定到PepM。PepM通过形成碳-磷（C–P）键催化膦酸酯生物合成的限速步骤，被广泛认为是膦酸酯途径的诊断性酶（Ramos-Figueroa et al., 2022）。PepM在CA−1和CA−2菌株的有组织BGC中定位，强烈支持其真正的生物合成角色而非参与一般磷代谢。值得注意的是，含PepM的膦酸酯BGC仅在2株C. asaccharovorans中被检测到，而其余分析的C. asaccharovorans基因组及所有其他Chelatococcus物种中均不存在。这种受限分布表明，在当前可用的Chelatococcus数据集中，膦酸酯生物合成潜力存在菌株水平上的差异。
编译者解读：该研究通过系统的基因组挖掘策略，将膦酸酯生物合成的系统发育范围扩展至Chelatococcus属，展示了antiSMASH与BLASTp/CDD联合分析在隐秘天然产物途径发现中的高效性。其方法学价值在于严格的基因组质量筛选和保守的簇边界保留策略，提高了预测可靠性。然而，研究完全基于计算预测，缺乏实验验证——这既是局限也是后续方向。从合成生物学应用角度看，PepM的异源表达和簇的激活表达将是验证该途径功能并获取新结构膦酸酯化合物的关键步骤，也为挖掘更多"沉默"天然产物途径提供了可借鉴的范例。
参考来源
期刊：Computational Biology and Chemistry, 2026
DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2026.109255
DOI: 10.1016/j.compbiolchem.2026.109255