来源：Cofactor-coupled cytochrome P450 engineering enables high-level biosynthesis of asiatic acid in Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
积雪草酸（ASA）是一种具有多种药理活性的五环三萜类化合物，传统上通过溶剂萃取从植物积雪草中获取，但受限于植物生长周期长、ASA含量低及季节性波动。本研究通过辅因子耦合的细胞色素P450工程，在酿酒酵母中实现了ASA的从头生物合成。通过筛选植物来源的P450-CPR配对、内质网空间重塑、NADPH再生强化以及FAD和血红素双辅因子途径工程，最终在5-L生物反应器中获得1069 mg/L的ASA产量，创下微生物生产ASA的最高产量纪录。
研究背景
三萜类化合物是植物来源天然产物中结构多样的一大类群，具有广泛的生物活性。其中，以积雪草酸为代表的三萜类化合物因具有抗炎、抗氧化、促进伤口愈合和神经保护等多种药理特性而备受关注。ASA是传统药用植物积雪草的主要活性成分，在神经系统疾病、纤维化和代谢疾病的治疗中显示出潜力，同时也是积雪草苷——积雪草中活性最强的皂苷之一——的关键前体。然而，当前ASA的工业化供应主要依赖植物提取，受制于栽培周期长、生物量低、季节性波动大以及有机溶剂的大量使用。合成生物学和代谢工程的最新进展使得在微生物宿主中重建复杂植物生物合成途径成为可能，为ASA的可持续生产提供了新路径。
研究方法
2.1 菌株与化学试剂
大肠杆菌DH5α和NEB 10-beta（北京博迈德基因技术有限公司，中国）用于基因克隆、质粒扩增和接种物制备。酿酒酵母菌株ZY35（尿嘧啶营养缺陷型）作为基因改造的起始菌株。熊果酸、科罗索酸、23-羟基熊果酸、积雪草酸、5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）、核黄素、血红素（纯度≥98%）和甲醇购自Macklin（上海，中国）。Kod One PCR Master Mix购自TOYOBO（北京，中国），ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit V3购自Vazyme（南京，中国）。Universal DNA凝胶纯化和质粒小提试剂盒购自TransGen（北京，中国）。5-氟乳清酸（5-FOA）购自Solarbio（北京，中国）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、NEB 10-beta、S. cerevisiae ZY35；试剂：5-ALA、核黄素、血红素（≥98%纯度）、5-FOA；来源：Macklin、TOYOBO、Vazyme、TransGen、Solarbio
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用质粒和菌株列于补充表S1和S2。酵母菌株构建流程图见补充图S1。所用酶的资源与登录号列于补充表S3。用于基因扩增或质粒构建的引物由Genewiz（苏州，中国）合成，列于补充表S4。密码子优化的异源基因片段由Tsingke（北京，中国）合成，内源基因从酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组扩增。改造的pUC19质粒（含合适的启动子和终止子）用于途径组装。整个分子克隆过程使用高保真DNA聚合酶。
菌株构建简要描述如下：构建整合片段时，从基因组分别用引物对P21/P22和P25/P26扩增911b位点上下游约500 bp的同源臂。表达片段P_TEF1-CaCYP716C11-T_ENO2-P_PGK1-BvCYP72A552-T_GPM1用引物对P23/P24从质粒pZY01扩增。三个片段通过LiAc/ssDNA转化法经酵母同源重组整合到911b位点。其他表达片段的整合同上。框内基因敲除菌株使用CRISPR/Cas9系统构建，gRNA质粒通过CRISPOR（https://crispor.gi.ucsc.edu/crispor.py/）设计以靶向特定基因组位点。本研究所用gRNA序列列于补充表S5。
转化子在SD-URA培养基（20 g/L葡萄糖，6.7 g/L无氨基酸酵母氮源，添加dropout粉末）上筛选。正确菌落转移至含BT Chelex 100 Resin的50 μL无菌水中，99℃煮沸10 min，离心10 min。取1 μL上清液作为菌落PCR模板。使用Kod One Master Mix通过菌落PCR确认靶基因缺失和异源基因整合。验证后的菌落在含100 mg/L 5-氟乳清酸（5-FOA）的YPD培养基上筛选，然后在YPD中培养以去除pCas9质粒。
【数据】同源臂长度：约500 bp；煮沸温度：99℃；煮沸时间：10 min；离心时间：10 min；PCR模板量：1 μL；5-FOA浓度：100 mg/L；筛选培养基：SD-URA、YPD
2.3 摇瓶与补料分批发酵
大肠杆菌DH5α和NEB 10-beta菌株在LB培养基（5.00 g/L酵母提取物，10.00 g/L胰蛋白胨，10.00 g/L NaCl）中培养，添加100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素，37℃、220 rpm。酿酒酵母菌株在YPD培养基（20.00 g/L葡萄糖，10.00 g/L酵母提取物，20.00 g/L蛋白胨）中30℃、220 rpm旋转摇床培养18 h。
摇瓶发酵时，工程菌株在改良YPD培养基中培养，含20.00 g/L葡萄糖、30.00 g/L蛋白胨和0.50 g/L尿嘧啶。培养物以5%（v/v）接种量转接至250 mL锥形瓶中的50 mL改良YPD培养基，30℃、220 rpm培养96 h。OD600使用Cary 3500 UV-Vis分光光度计（Agilent Technologies，美国）测量。
补料分批发酵时，菌株ZYAS58在5-L生物反应器（T&J Bioengineering Co., Ltd，上海，中国）中培养，合成培养基含40 g/L葡萄糖、30 g/L细菌蛋白胨、1.2 g/L K2HPO4、5.12 g/L MgSO4·7H2O、3.5 g/L K2SO4、9.0 g/L KH2PO4、0.28 g/L Na2SO4、2.0 mM 5-ALA、12 mL维生素溶液和10 mL微量元素溶液。10%（v/v）种子培养物接种至1.8 L合成培养基中。发酵在30℃进行，pH用氨水（25–35%，v/v）维持在5.5，溶解氧（DO）水平通过3.0 vvm的通气速率控制在30%。发酵24–48 h期间，以15–50 g/h的速率补加葡萄糖（800 g/L）以支持生物量积累。随后，补料底物切换为乙醇（99.7%，v/v），速率10–30 g/h。葡萄糖和乙醇浓度使用生物传感仪SBA-40（山东科学院生物研究所，中国）检测。
【数据】LB培养基：5.00 g/L酵母提取物、10.00 g/L胰蛋白胨、10.00 g/L NaCl；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素；温度：37℃；转速：220 rpm；YPD培养基：20.00 g/L葡萄糖、10.00 g/L酵母提取物、20.00 g/L蛋白胨；温度：30℃；时间：18 h；改良YPD：20.00 g/L葡萄糖、30.00 g/L蛋白胨、0.50 g/L尿嘧啶；接种量：5%（v/v）；培养体积：50 mL/250 mL；时间：96 h；转速：220 rpm；合成培养基：40 g/L葡萄糖、30 g/L细菌蛋白胨、1.2 g/L K2HPO4、5.12 g/L MgSO4·7H2O、3.5 g/L K2SO4、9.0 g/L KH2PO4、0.28 g/L Na2SO4、2.0 mM 5-ALA；接种量：10%（v/v）；工作体积：1.8 L；温度：30℃；pH：5.5；DO：30%；通气速率：3.0 vvm；葡萄糖补加速率：15–50 g/h；乙醇补加速率：10–30 g/h
2.4 Western blot
表达His标签CYP的菌株接种至10 mL试管中的1 mL SD-URA培养基，30℃、220 rpm摇床过夜培养。培养48 h后，12,000 rpm离心2 min收集细胞，重悬于等体积磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.5）。使用机械匀浆器破碎细胞，在变性条件下提取总细胞蛋白。蛋白提取物经SDS-PAGE分离并转移至膜上，依次与小鼠单克隆抗His抗体（1:2000；TransGen，中国）和HRP偶联的山羊抗小鼠IgG二抗（1:3300；TransGen，中国）孵育。使用Azure Biosystems 280（Dublin，CA，USA）通过化学发光检测蛋白条带。
【数据】离心：12,000 rpm、2 min；PBS：pH 7.5；一抗稀释比：1:2000；二抗稀释比：1:3300；培养时间：48 h；温度：30℃；转速：220 rpm
2.5 荧光显微镜分析
为验证CaCYP716E19和AmCYP716C53的亚细胞定位，通过柔性（GGGGS）3连接子将绿色荧光蛋白（GFP）融合至CaCYP716E19和AmCYP716C53的C端。同时，使用柔性（GGGGS）3连接子将红色荧光蛋白（mCherry）融合至内质网标记蛋白SEC61，作为内质网定位荧光信号的参考。表达盒分别使用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit克隆至pESC-Ura和pESC-Leu质粒。携带质粒的菌株ZYAS08和ZYAS30在5 mL SD-Leu-Ura培养基中30℃、220 rpm预培养18 h，然后接种至25 mL SD-Leu-Ura培养基中相同条件下培养60 h。离心收集细胞，PBS洗涤三次。取2 μL样品滴加至载玻片上进行成像。使用配备Nikon TI2-E自动倒置平台的Nikon A1R HD25共聚焦激光扫描显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位。GFP和mCherry分别在488 nm和585 nm激发。图像采集和处理使用NIS-Elements AR软件（Nikon，东京，日本）。
【数据】连接子：（GGGGS）3；预培养：5 mL SD-Leu-Ura、30℃、220 rpm、18 h；正式培养：25 mL SD-Leu-Ura、30℃、220 rpm、60 h；PBS洗涤：3次；样品量：2 μL；激发波长：GFP 488 nm、mCherry 585 nm
2.6 NADPH/NADP+、FAD(H)2、血红素和ROS水平的提取与测定
辅因子分析中，细胞内NADPH/NADP+比值使用商业NADPH/NADP+检测试剂盒（源叶生物技术，上海，中国）按制造商说明书定量。细胞内FAD(H)2水平使用FAD(H)2 ELISA试剂盒（Meimian，苏州，中国）定量。细胞内ROS水平使用活性氧检测试剂盒（Solarbio，北京，中国）测量。
血红素定量时，取5 mL发酵液，4℃、6000 rpm离心5 min收集细胞。细胞沉淀用无菌水洗涤并转移至2 mL管中，4℃、8000 rpm离心5 min。沉淀重悬于500 μL 20 mM草酸中，振荡5 min。
【数据】发酵液体积：5 mL；离心：6000 rpm、5 min、4℃；二次离心：8000 rpm、5 min、4℃；草酸浓度：20 mM；草酸体积：500 μL；振荡时间：5 min
研究结果
3.1 细胞色素P450-CPR系统的工程改造用于ASA生物合成
细胞色素P450酶在天然产物生物合成中催化多种区域和立体选择性氧化反应。在ASA生物合成中，P450执行两个连续的羟基化步骤：前体熊果酸（UA）的C-23羟基化和C-2α羟基化（图2A）。然而，植物来源P450的催化效率在微生物宿主中常因表达差、膜锚定不足和电子传递效率低而受限。为解决这些限制，研究者从积雪草和其他产三萜植物中筛选了能高效催化C-23羟基化的P450候选酶，随后以相同策略筛选了能催化C-2α羟基化的P450酶。同源P450在特定位点的效率和特异性常有差异，因此可以选择最有效的酶来增强酿酒酵母中的ASA生物合成。
具体而言，为重建完整的ASA生物合成途径，研究者评估了三个已报道的催化C-23羟基化的P450酶——来自欧洲山芥的BvCYP72A552、来自积雪草的CaCYP716E19和来自刺楸的KsCYP72A397——以及五个负责C-2α羟基化的候选酶，即来自白骨壤的AmCYP716C53、来自积雪草的CaCYP716C11、来自山楂的CpCYP716C49、来自大花紫薇的LsCYP716C55和来自油橄榄的OeCYP716C67，以评估其兼容性。这些基因在强组成型启动子（PGK1和TEF1）下于ZY35中表达，并整合至911b位点，生成菌株ZYAS01至ZYAS15。
如图2B所示，菌株ZYAS01（含CaCYP716C11和BvCYP72A552）、ZYAS02（含CaCYP716C11和CaCYP716E19）和ZYAS03（含CaCYP716C11和KsCYP72A397）分别产生5.93、9.52和8.20 mg/L的ASA。CaCYP716C11与其他三个负责C-23羟基化的P450共表达时ASA水平较低，但氧化产物23-HA显著积累，范围为50.76至53.53 mg/L。同时，科罗索酸（COA）水平保持在4 mg/L以下（图2B）。
随后，研究者筛选了另外四个C-23羟基化P450，菌株ZYAS08（含AmCYP716C53和CaCYP716E19）产生了显著更高的55.30 mg/L ASA，约为ZYAS02的5.8倍（图2B）。对其他四个C-2α羟基化P450酶的筛选显示，副产物23-HA和COA的积累保持在低水平。可以推测，菌株ZYAS01-ZYAS03中23-HA和/或COA等中间体的差异积累不仅受酶表达差异的影响，还受内在催化活性、溶解性和折叠效率差异的影响，这些是异源P450表达中经常报道的瓶颈。相比之下，菌株ZYAS08中23-HA和COA均保持低水平，UA仍超过600 mg/L。Western blot分析显示，AmCYP716C53的丰度与其他测试酶相当。这表明，虽然AmCYP716C53的内在催化活性或溶解性也可能有贡献，但ZYAS08中显著更高的ASA滴度最可能与AmCYP716C53和CaCYP716E19的协同效应一致，两者共同最小化了副产物积累并将通量导向ASA生物合成。
为进一步提高氧化模块的氧化还原效率，研究者将注意力转向CPR——通过黄素辅因子将电子从NADPH传递给P450单加氧酶的关键电子载体。P450酶的催化性能高度依赖于这一电子传递过程的效率和兼容性。研究者评估了来自九个植物来源的CPR，包括檀香、葡萄、青蒿、水飞蓟、长春花、拟南芥、三七、甜叶菊和苹果。植物来源的CPR通常与植物P450酶更兼容，因此预期与菌株ZYAS08的最佳P450组合配对时能增强酵母中的氧化还原偶联效率。每个CPR在组成型TEF1启动子下表达并整合至酵母基因组的1021b位点，生成菌株ZYAS16至ZYAS24。
如图2C所示，来自拟南芥的AtCPR显著提高了ASA产量，菌株ZYAS21达到最高滴度62.87 mg/L。重要的是，这一提升并未伴随OD600的显著变化，表明CPR的选择主要影响氧化还原效率而非生物量形成。产量的提高主要归因于增强的CYP-CPR电子传递，尽管不能排除所选CPR表达水平的贡献。表达AtCPR的菌株比ZYAS08获得了显著更高的ASA滴度。这一结果与此前关于CPR兼容性可强烈影响P450催化氧化效率的报道一致。
【数据】ASA产量：ZYAS01 5.93 mg/L、ZYAS02 9.52 mg/L、ZYAS03 8.20 mg/L、ZYAS08 55.30 mg/L、ZYAS21 62.87 mg/L；23-HA积累：50.76–53.53 mg/L；COA水平：<4 mg/L；ZYAS08相对ZYAS02提升：约5.8倍；UA残余：>600 mg/L
3.2 通过内质网工程增强ASA生产
膜结合细胞色素P450酶的催化活性与内质网（ER）的结构和功能密切相关，P450在ER上锚定并与其氧化还原伴侣CPR相互作用。发育良好的ER网络支持蛋白质折叠、膜整合以及P450与CPR的空间共定位，从而改善电子传递并缓解代谢压力。研究者假设扩展酿酒酵母中的ER膜容量可以增强P450的定位和周转，最终提高ASA生物合成。
为验证这一假设，研究者采用了两种互补的ER靶向策略（图3A）。第一，通过过表达INO2（磷脂生物合成的转录调控基因）和敲除PAH1（限制ER扩展的磷脂酸磷酸酶基因）来调节ER形态。第二，引入来自拟南芥的MSBP1和MSBP2——两种据报道可增强P450膜锚定并缩短酶间距离的膜类固醇结合蛋白。具体而言，研究者将内源INO2启动子替换为诱导型GAL1启动子，敲除PAH1，并将MSBP1或MSBP2的表达盒整合至菌株ZYAS21的416d位点，生成菌株ZYAS25至ZYAS28。
如图3B所示，表达INO2（ZYAS25）或敲除PAH1（ZYAS26）分别将ASA产量提高至65.96和64.57 mg/L。此外，AtMSBP1和AtMSBP2的异源表达在菌株ZYAS27和ZYAS28中将产量分别提高至71.42和68.11 mg/L，相比ZYAS21分别提高了13.59%和8.33%。为进一步促进ER稳态并优化与P450酶的空间邻近性，研究者在ZYAS25背景中敲除了PAH1，进一步将ASA产量提升至75.13 mg/L（ZYAS29）。敲除PAH1已被证明可增大ER膜表面积，从而缓解局部拥挤和折叠压力，改善异源P450的插入和稳定性。扩展的ER膜还促进了P450与CPR之间的动态相互作用，增强了电子传递并提高了它们的相互作用效率。值得注意的是，ZYAS29的OD600与对照菌株相比无显著差异。
【数据】ASA产量：ZYAS25 65.96 mg/L、ZYAS26 64.57 mg/L、ZYAS27 71.42 mg/L、ZYAS28 68.11 mg/L、ZYAS29 75.13 mg/L；ZYAS27相对ZYAS21提升：13.59%；ZYAS28相对ZYAS21提升：8.33%
3.3 NADPH再生模块化增强以支持P450活性
P450酶催化循环需要NADPH作为电子供体，因此细胞内NADPH的供应直接影响ASA生物合成的效率。为增强NADPH再生，研究者从两个方向进行了工程改造（图4A）。一方面，过表达磷酸戊糖途径（PPP）的关键酶——葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GND1），以增强通过PPP的碳通量；另一方面，异源表达转氢酶——来自大肠杆菌的可溶性吡啶核苷酸转氢酶（UDH-A）和来自酿酒酵母的内源线粒体转氢酶（NNT1），以实现NADPH的额外再生。
如图4B所示，在菌株ZYAS29基础上过表达ZWF1和GND1（菌株ZYAS31）将ASA产量提升至82.35 mg/L；异源表达UDH-A（菌株ZYAS32）和NNT1（菌株ZYAS33）分别将产量提升至78.92和80.14 mg/L。当同时过表达ZWF1、GND1和UDH-A时（菌株ZYAS34），ASA产量达到86.47 mg/L。如图4C所示，胞内NADPH/NADP+比值测定显示，工程菌株ZYAS34的NADPH/NADP+比值达到2.87，显著高于对照菌株ZYAS29的1.92，表明NADPH再生途径的强化有效提高了胞内还原力供应。
【数据】ASA产量：ZYAS31 82.35 mg/L、ZYAS32 78.92 mg/L、ZYAS33 80.14 mg/L、ZYAS34 86.47 mg/L；NADPH/NADP+比值：ZYAS34 2.87 vs ZYAS29 1.92
3.4 FAD和血红素途径工程增强ASA生产
黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和血红素是P450酶和CPR催化功能所必需的辅因子。FAD作为CPR的黄素辅因子参与电子传递，而血红素是P450活性中心的关键辅基。为解除辅因子供应对P450催化效率的限制，研究者对FAD和血红素生物合成途径进行了工程改造（图5A）。
在FAD途径工程中（图5B），研究者过表达了酿酒酵母内源的FAD合成酶基因FAD1和核黄素激酶基因FMN1，以增强FAD的从头合成。在菌株ZYAS34基础上过表达FAD1和FMN1（菌株ZYAS36）将ASA产量提升至93.28 mg/L。在血红素途径工程中（图5C），研究者过表达了血红素生物合成的关键酶——5-氨基乙酰丙酸合酶（HEM1）、胆色素原脱氨酶（HEM3）和粪卟啉原III氧化酶（HEM6），并在培养基中补充了5-ALA（2.0 mM）。在菌株ZYAS36基础上过表达HEM1、HEM3和HEM6并补充5-ALA（菌株ZYAS38），ASA产量进一步提升至101.35 mg/L。将FAD和血红素途径工程组合（菌株ZYAS39），ASA产量达到105.62 mg/L（图5D）。
【数据】ASA产量：ZYAS36 93.28 mg/L、ZYAS38 101.35 mg/L、ZYAS39 105.62 mg/L；5-ALA补充浓度：2.0 mM
3.5 基因调控与发酵优化增强ASA生产
在获得高产菌株ZYAS39后，研究者进一步通过增加P450基因拷贝数和调控全局转录因子来优化ASA生产（图6A）。将AmCYP716C53的额外拷贝整合至基因组（菌株ZYAS55），ASA产量提升至112.46 mg/L。过表达全局转录因子UPC2.1——甾醇合成途径和脂质代谢的关键调控因子（菌株ZYAS58），ASA产量进一步达到118.73 mg/L。
最终，研究者使用菌株ZYAS58在5-L生物反应器中进行补料分批发酵（图6B）。发酵过程中，前期以葡萄糖为碳源支持细胞生长，后期切换为乙醇作为碳源以减少副产物积累。经过192 h发酵，ASA产量达到1068.92 mg/L，为目前报道的微生物生产ASA的最高产量。
【数据】ASA产量：ZYAS55 112.46 mg/L、ZYAS58 118.73 mg/L（摇瓶）；5-L发酵：1068.92 mg/L；发酵时间：192 h
讨论与解读
本研究通过系统性的P450-CPR工程与辅因子代谢重塑相结合的策略，在酿酒酵母中实现了积雪草酸的高效生物合成。研究的关键创新在于：一是通过筛选植物来源的P450-CPR配对，建立了高效的连续羟基化级联反应；二是通过内质网扩展和支架蛋白招募优化了P450的膜定位和电子传递；三是通过磷酸戊糖途径扩增和转氢酶表达增强了NADPH再生；四是通过血红素和FAD生物合成途径工程解决了氧化还原限制。这些协同干预使最终菌株ZYAS58在5-L补料分批发酵中达到1068.92 mg/L的ASA产量，创下微生物生产ASA的最高纪录。
编译者解读：本研究展示了辅因子工程在P450依赖型天然产物生物合成中的核心地位。传统代谢工程往往聚焦于途径基因的过表达，而本研究将视角拓展至电子传递链的完整重构——从CPR配对选择到ER空间重塑，再到NADPH/FAD/血红素三重辅因子的系统优化，体现了"全链条氧化还原平衡"的设计理念。1069 mg/L的产量对于三萜类化合物而言已具工业转化潜力，但P450酶的表达量仍可能是进一步提升的瓶颈。该策略对其它高氧化态三萜（如甘草次酸、齐墩果酸衍生物）的微生物合成具有直接借鉴价值。
参考来源
Zhu Y. Cofactor-coupled cytochrome P450 engineering enables high-level biosynthesis of asiatic acid in Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133558
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133558