来源：De novo biosynthesis of vanillin in engineered Saccharomyces cerevisiae（Chemical Engineering Science）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
香兰素是全球用量最大的食品香料之一，天然提取不足市场需求的1%，化学合成又面临环境压力。本研究在酿酒酵母中设计并构建了从酪氨酸出发的香兰素从头生物合成途径，通过整合sam8、CYP199A2、comt、fcs和ech等外源基因，实现了香兰素的微生物合成。研究系统比较了不同来源的羟化酶、不同倍性的宿主菌株，并通过解除酪氨酸合成途径的反馈抑制，将香兰素产量从26.3 μg/L逐步提升至8545 μg/L，展示了微生物法生产香兰素的可行性。
研究背景
香兰素（4-羟基-3-甲氧基苯甲醛）是食品、医药和化妆品行业中最重要的风味化合物。2016年全球香兰素需求量约18600吨，预计到2025年将增长6.2%。天然香兰素从香草荚中提取，但植物来源供应量不足1%，且存在占用土地资源多、提取率低（仅约0.25%）、成本高昂等问题。化学合成虽成为主要来源，但金属基氧化策略带来环境污染并限制商业应用。因此，利用微生物细胞工厂进行香兰素的生物合成，被视为替代人工合成的有前景的路线。酿酒酵母天然产生的次级代谢产物较少，且具有完整的芳香族氨基酸代谢途径，是构建异源天然产物合成途径的理想底盘菌株。
研究方法
2.1 菌株与培养基
大肠杆菌DH5α和Trans5α用于基因克隆和基因表达盒的构建。大肠杆菌在LB培养基中培养，配方为：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L。根据需要向培养基中添加氨苄青霉素（100 μg/mL）或卡那霉素（50 μg/mL）。
酿酒酵母CEN.PK2-1C（MATa; ura3-52; trp1-289; leu2-3_112; his3Δ1; MAL2-8C; SUC2）和INVSc1（MATa/MATα; hisΔ1; leu2; trp1-289; ura3-52）作为DNA组装和香兰素途径表达的宿主菌株。酵母细胞在30°C的YPD rich培养基中培养，配方为：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物10 g/L。SD培养基由酵母氮碱6.7 g/L、d-葡萄糖20 g/L和四氨基酸 dropout 混合物（SD/-URA/-HIS/-TRP/-LED）0.6 g/L组成。需要时在培养基中添加潮霉素B（50 mg/mL）或遗传霉素（50 mg/mL）。
【数据】LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L；氨苄青霉素：100 μg/mL；卡那霉素：50 μg/mL；YPD培养基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物10 g/L；SD培养基：酵母氮碱6.7 g/L、d-葡萄糖20 g/L、dropout混合物0.6 g/L；潮霉素B：50 mg/mL；遗传霉素：50 mg/mL；培养温度：30°C
2.2 表达模块的构建
为了在酿酒酵母中表达异源基因，sam8、sam5、comt、fcs、ech和CYP199A2经JCat算法密码子优化后化学合成。密码子优化基因序列见表S2，构建表达模块所用引物列于表S3。表达模块按图S1所示构建。所有组装均通过模块化两步技术（M2S）实现。完整的表达模块通过Golden-Gate DNA方法组装背靠背双启动子、背靠背双终止子和两个基因。对于整合到基因组位点（delta15、delta17和delta22，表S4）的途径，使用醋酸锂法将线性化基因表达模块和必要的同源臂共转化至酿酒酵母中，并在30°C下孵育约36小时。阳性转化子通过菌落PCR和Sangon Biotech公司测序验证。
【数据】整合位点：delta15、delta17、delta22；转化方法：醋酸锂法；孵育温度：30°C；孵育时间：约36h
2.3 基因表达分析
采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测基因转录水平。重组酵母在YPD培养基中、30°C摇床培养36小时。随后使用E.Z.N.A.® Yeast RNA Kit提取总RNA，总RNA浓度通过酶标仪检测。总RNA纯化后，以总计1000 ng RNA和5 × PrimeScriptTM RT Master Mix进行反转录反应获得cDNA。随后以cDNA为模板，使用TB Green® Premix Ex Taq II试剂盒，通过Light CyCle96仪器进行定量RT-PCR测定基因表达水平。sam8、sam5、hpaB、hpaC、CYP199A2、comt、fcs和ech等外源基因的特异性引物使用Primer 5.0设计，汇总于表S5。
【数据】RNA总量：1000 ng；培养温度：30°C；培养时间：36h
2.4 香兰素及代谢物的提取与定量
将工程酿酒酵母菌株预培养于20 mL YPD液体培养基中，30°C、220 rpm振荡培养36小时。然后将细胞混合物以1%接种量转入50 mL新鲜YPD液体培养基中。培养96小时后，加入与发酵液等体积的乙酸乙酯，涡旋充分混合15分钟。上清液经5000 rpm离心5分钟收集。提取液用旋转蒸发仪在30°C、5 rpm条件下浓缩至乙酸乙酯完全去除。残留物用2 mL甲醇重悬，经0.22 μm尼龙膜过滤器过滤后进行代谢物测定。
香兰素及其他中间代谢物通过LC-MS鉴定。样品经ACQUITY UPLC系统配备XEVO TQ-S三重四极杆串联质谱仪（ESI电离源）分析，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）。流动相由溶剂A（含0.1%甲酸的超纯水）和溶剂B（乙腈）组成，流速0.3 mL/min。梯度洗脱程序如下：0 min，86%溶剂A + 14%溶剂B；3 min，5%溶剂A + 95%溶剂B；4 min，86%溶剂A + 14%溶剂B。总洗脱时间6 min。柱温30°C，毛细管电压2.3 kV。离子源温度150°C，去溶剂气温度450°C，气体流量800 L/h。使用MassLynx 4.0软件以多反应监测（MRM）模式分析数据。每个生物学样品重复测定三次。
【数据】预培养体积：20 mL YPD；预培养条件：30°C、220 rpm、36h；接种量：1%；发酵体积：50 mL；发酵时间：96h；萃取剂：等体积乙酸乙酯；涡旋时间：15min；离心：5000 rpm、5min；浓缩：30°C、5rpm；甲醇重悬：2 mL；滤膜：0.22 μm尼龙膜；流速：0.3 mL/min；柱温：30°C；毛细管电压：2.3 kV；离子源温度：150°C；去溶剂气温度：450°C；气体流量：800 L/h；总洗脱时间：6min
研究结果
3.1 在酿酒酵母中构建异源香兰素生物合成途径
近年来，香兰素的生物合成被认为是有前景的人工合成替代方案，无需高能耗和高物耗。工程微生物中必不可少的酶可以将芳香族底物转化为香兰素。然而，复杂的酶系统和辅因子需求限制了香兰素的生物合成。由于酿酒酵母天然产生较少的次级代谢产物和其他色氨酸衍生物，其作为异源天然产物底盘具有更大潜力。
本研究利用酪氨酸对香兰素合成的结构优势，在酿酒酵母中设计了从酪氨酸起始的香兰素生物合成途径（图1）。酪氨酸经酪氨酸解氨酶（TAL，由sam8基因编码）通过非氧化脱氨转化为对香豆酸。sam8选自放线菌Saccharothrix espanaensis，对酪氨酸具有高选择性。对香豆酸随后通过来源于沼泽红假单胞菌的细胞色素P450单加氧酶CYP199A2在苯环3位羟基化生成咖啡酸。来源于拟南芥的咖啡酸O-甲基转移酶（COMT，由comt基因编码）参与甲基化反应，进一步从咖啡酸生成阿魏酸。最后，来源于链霉菌V-1菌株的反式阿魏酰辅酶A合成酶（FCS，由fcs基因编码）和烯酰辅酶A水合酶/醛缩酶（ECH，由ech基因编码）通过多步反应将阿魏酸转化为香兰素。
为验证所选途径的效率，分别在单倍体酿酒酵母CEN.PK2-1C或二倍体酿酒酵母INVSc1中构建菌株M1和H1：将sam8、CYP199A2和comt表达模块整合至delta15位点，fcs和ech表达模块整合至delta17位点。发酵液提取物的LC-MS分析证明，两种菌株均成功从酪氨酸合成了香兰素（图2A）。同时鉴定出对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸等关键中间代谢物。菌株M1和H1的生长情况相似，但单倍体菌株M1合成的香兰素滴度高于二倍体菌株H1，分别为35.6 μg/L和26.3 μg/L（图2B），提示单倍体菌株可能更适合香兰素的生产。
【数据】菌株M1香兰素滴度：35.6 μg/L；菌株H1香兰素滴度：26.3 μg/L；整合位点：delta15（sam8+CYP199A2+comt）、delta17（fcs+ech）
3.2 通过富集咖啡酸池提高香兰素产量
咖啡酸是植物苯丙烷途径中首次发现的代谢物，是其衍生物合成的关键前体。咖啡酸合成效率低下严重影响后续途径的产物产量。对于香兰素生产而言，咖啡酸的合成同样至关重要——它是羟基化对香豆酸并利用咖啡酸O-甲基转移酶生成阿魏酸的关键底物。据报道，铜绿假单胞菌hpaB和大肠杆菌hpaC的共表达可将对香豆酸转化为咖啡酸。来源于Saccharothrix espanaensis的4-香豆酸3-羟化酶（C3H，由sam5基因编码）是一种植物特异性的细胞色素P450依赖型单加氧酶，可催化从咖啡酸合成香兰素。
为提高香兰素产量，通过比较三种不同来源的酶来优化咖啡酸的合成。将sam8、comt和hpaB/hpaC表达模块组装至delta15位点，fcs和ech表达模块组装至delta17位点，在酿酒酵母CEN.PK2-1C或酿酒酵母INVSc1中构建了菌株M2和H2。类似地，整合sam8、sam5、comt、fcs和ech表达模块构建了菌株M3和H3。qPCR验证了外源基因在所有工程酵母中均表达良好。
单倍体工程酵母（M1、M2）相比二倍体酵母（H1、H2）表现出更好的细胞生长，尽管M1和H1、M2和H2含有相同的表达模块（图3A）。然而，无论使用哪种酵母作为宿主，表达hpaB/hpaC基因的菌株香兰素滴度均显著高于表达CYP199A2基因的菌株，分别提高了1.31倍（M2）和1.46倍（H2）。用sam5基因替换hpaB/hpaC或CYP199A2基因后，香兰素滴度进一步提高，M3和H3分别比M1和H1提高了1.41倍和1.7倍（图3B）。含sam5基因的单倍体工程酵母M3产生了50.2 μg/L的香兰素，显示出合成咖啡酸的优势。
含hpaB/hpaC的菌株产生的咖啡酸滴度低于含sam5的菌株。这可能是由于hpaB/hpaC编码的酶具有将酪氨酸催化为l-DOPA的副作用，减少了对香豆酸的合成，最终影响咖啡酸的产量。将放线菌Sacharothrix espanaensis的TAL与Saccharothrix espanaensis的C3H组合在大肠杆菌中，以酪氨酸为底物可合成180 mg/L咖啡酸，但添加酪氨酸导致大规模生产成本过高。Berner等人推测sam8和sam5蛋白在saccharomicin苷元途径中具有催化功能。可以推测，sam8和sam5基因组合产生高咖啡酸产量的机制可能类似于各种细菌中的苯酚羟化酶。这些讨论充分表明，优化咖啡酸池有利于提高香兰素的代谢流。
考虑到引入不同途径生产咖啡酸后，从头合成香兰素滴度仅为50.2 μg/L，推测前体供应不足是重要限制因素。
【数据】hpaB/hpaC菌株提高倍数：M2提高1.31倍、H2提高1.46倍；sam5菌株提高倍数：M3提高1.41倍、H3提高1.7倍；菌株M3香兰素产量：50.2 μg/L；大肠杆菌咖啡酸产量：180 mg/L
3.3 表达DAHP合酶和CHA酶突变体提高香兰素滴度
酿酒酵母中存在的酪氨酸和苯丙氨酸均可被多种酶催化产生香兰素（图4A）。为缩短代谢途径，选择酪氨酸作为香兰素合成的前体。尽管如上所述已成功合成香兰素，但其滴度仍然较低。宿主合成的酚酸、醛类以及酪氨酸的可用水平都会影响宿主中的外源途径，从而影响香兰素产量。推测这可能是由于酪氨酸前体供应不足所致。
在酪氨酸合成过程中，DAHP合酶催化赤藓糖-4-磷酸（E4P）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）形成DAHP，该步骤受ARO4基因控制，是第一个重要的反馈抑制基因。ARO7是第二个重要的反馈抑制基因，编码分支酸变位酶，控制CHA的转化。此前研究表明，将ARO4K229L、ARO7G141S、AROL、PcAASsyn和AtUGT85A1syn基因整合至酿酒酵母中，酪醇滴度可达399.2 ± 5.6 mg/L。突变ARO4和ARO7可获得200倍的改善……
【数据】酪醇滴度：399.2 ± 5.6 mg/L；突变基因：ARO4K229L、ARO7G141S
3.4 前体添加对香兰素产量的影响
【数据】阿魏酸添加量：400 mg/L；香兰素最终产量：8545 μg/L
讨论与解读
本研究通过代谢工程和基因工程方法，在酿酒酵母中成功构建了香兰素生物合成途径。研究系统比较了单倍体CEN.PK2-1C和二倍体INVSc1作为底盘菌株的差异，发现单倍体菌株在生产香兰素方面更具优势。通过筛选不同来源的羟化酶，最终优选S. espanaensis来源的sam5编码的4-香豆酸3-羟化酶，有效富集了咖啡酸池。进一步表达ARO4K229L和ARO7G141S突变体，解除了酪氨酸合成的负反馈抑制。值得注意的是，咖啡酸O-甲基转移酶（COMT）是香兰素生产中的限速酶。最终，通过补加400 mg/L阿魏酸，香兰素产量提升至8545 μg/L，证明了微生物技术生产香兰素的可行性。
编译者解读：该研究展示了典型的合成生物学迭代优化策略——从途径设计、酶源筛选到前体供应强化，层层递进。尤其值得关注的是对宿主倍性（单倍体vs二倍体）和同工酶来源的系统比较，这种"底盘-元件"匹配思维对同类芳香族化合物的微生物合成具有借鉴价值。然而，8545 μg/L的产量仍远低于工业化要求，且依赖外源阿魏酸补加，真正的"从头合成"效率仍有较大提升空间。后续研究若能强化内源前体供应并优化限速酶COMT的催化效率，将有望进一步推动微生物法香兰素的产业化进程。
参考来源
Qiu D. De novo biosynthesis of vanillin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Chemical Engineering Science, 2022. DOI: 10.1016/j.ces.2022.118049
DOI: 10.1016/j.ces.2022.118049