来源：De novo biosynthesis of betulinic acid in engineered Saccharomyces cerevisiae（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
桦木酸是一种具有抗炎和抗肿瘤活性的羽扇豆烷型五环三萜天然产物，传统获取方式依赖植物提取，难以满足应用需求。本研究在酿酒酵母中构建了桦木酸从头合成途径，采用过氧化物酶体和脂滴双区室工程策略，通过表达白桦来源的羽扇豆醇C-28氧化酶（BPLO）和拟南芥来源的ATR1，并优化连接肽，最终在摇瓶水平获得77.53 mg/L的桦木酸产量，在5-L生物反应器中通过补料分批发酵达到205.74 mg/L。
研究背景
桦木酸是一种植物来源的羽扇豆烷型五环三萜化合物，已被证实具有抗炎和抗肿瘤活性，目前广泛用于化妆品、制药和精细化工行业。由于桦树生长缓慢、天然桦木酸含量低，加之传统提取方法对环境造成负面影响，植物提取路线已难以为继。化学合成方法步骤繁琐且污染严重。酿酒酵母作为一种环境友好、可持续且成本可控的微生物细胞工厂，为桦木酸合成提供了更优替代方案。已有研究表明，共表达苜蓿来源CYP716A12和拟南芥来源AtCPR可在酿酒酵母中实现桦木酸的初步生物合成；在解脂耶氏酵母中，通过过表达MVA途径关键基因及CYP450与P450还原酶的融合表达，桦木酸产量提升至16.98 mg/L；过表达白桦来源的羽扇豆醇C-28氧化酶（BPLO）后，桦木酸产量增至0.16 mg/L/OD600。
研究方法
2.1 菌株、培养基与试剂
本研究以酿酒酵母CEN.PK2-1C（MATa; his3D1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2）作为产桦木酸的亲本菌株。所有酵母菌株列于表1。酵母使用YPD培养基培养，SD-Leu培养基（含2% d-葡萄糖、不含亮氨酸的合成培养基）用于筛选携带pTCL（Cas9表达质粒）的酵母菌株。SD-Leu-Ura培养基（含2% d-葡萄糖、不含亮氨酸和尿嘧啶的合成培养基）用于筛选同时携带pTCL和引导RNA（gRNA）质粒的菌株。SD-Leu-FoA培养基（含1 mg/mL 5-氟乳清酸的SD-Leu培养基）用于筛选含有URA3标记的gRNA表达质粒的丢失。SC培养基及Leu、Leu-Ura dropout培养基购自北京FunGenome公司，5-氟乳清酸购自上海Aladdin公司。Trans5α化学感受态大肠杆菌细胞（北京TransGen Biotech）用于质粒构建，在含100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素的Luria–Bertani（LB）培养基中培养。标准角鲨烯和桦木酸标准品购自上海Macklin公司。
【数据】菌株：S. cerevisiae CEN.PK2-1C；培养基：YPD、SD-Leu、SD-Leu-Ura、SD-Leu-FoA、LB；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素、50 μg/mL卡那霉素；筛选剂：1 mg/mL 5-氟乳清酸
2.2 质粒构建
采用常规限制性内切酶克隆技术构建质粒。靶向不同基因组位点的gRNA质粒通过CRISPR direct（http://crispr.dbcls.jp/）设计。本研究所用基因序列由南京Genscript公司商业合成。所有质粒和引物分别列于表S1和S2，蛋白质和DNA序列分别列于表S3和S4。
【数据】质粒构建方法：限制性内切酶克隆；gRNA设计工具：CRISPR direct；基因合成：Genscript（南京）
2.3 工程化酿酒酵母的构建
基因表达使用仅响应葡萄糖浓度的GAL1-GAL10双向启动子。含有Leu标记的Cas9表达质粒pTCL被导入CEN.PK2-1C用于后续基因编辑。gRNA质粒使用Frozen-EZ Yeast Transformation II™ Kit（ZYMO RESEARCH，美国）转化酿酒酵母，转化细胞随后涂布于SD-Leu-Ura固体培养基。转化子通过菌落PCR验证，使用KOD-FX101（TOYOBO，日本）。为实现连续基因编辑，工程菌株在SD-Leu-5-FoA平板上交叉划线以去除gRNA质粒。
【数据】转化试剂盒：Frozen-EZ Yeast Transformation II™ Kit；PCR酶：KOD-FX101；筛选培养基：SD-Leu-Ura、SD-Leu-5-FoA；启动子：GAL1-GAL10双向启动子
2.4 工程菌株的培养
SD-Leu平板上生长的酵母菌落用于接种5 mL YPD培养基，在30°C、220 rpm条件下培养18 h。随后，将培养物以初始OD600为0.1转接至15 mL YPD培养基中，在30°C下培养14 h。最后，将培养物以初始OD600为0.2接种至50 mL发酵培养基中，在30°C下培养7天。
【数据】温度：30°C；转速：220 rpm；时间：18h、14h、7天；初始OD600：0.1、0.2
2.5 激光扫描共聚焦显微镜观察脂滴形态
工程化酿酒酵母菌株在YPD发酵培养基中培养24 h，离心收集细胞。细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次，重悬于PBS缓冲液中。取10 μL悬浮液滴加至载玻片上，使用AIR激光扫描共聚焦显微镜在561 nm和488 nm波长下观察红色和绿色荧光。
【数据】培养时间：24h；洗涤：PBS缓冲液×3次；上样量：10 μL；激发波长：561nm（红）、488nm（绿）
2.6 羽扇豆醇和桦木酸的提取与定量
提取2,3-氧化角鲨烯、羽扇豆醇和桦木酸时，将600 μL酵母培养物和600 μL乙酸乙酯与1.5 g氧化锆珠（直径0.5 mm）在微量离心管中混合，使用冷冻研磨机（上海净信，中国）在55 Hz、4°C条件下振荡30 min。振荡后的混合物在12,000 rpm下离心10 min，上层有机相用无水硫酸钠脱水后，使用配备HP-5色谱柱（30 mm × 0.25 mm，0.25 μm膜厚）和火焰离子化检测器（FID）的液相色谱系统（Agilent 8860，美国）测定羽扇豆醇浓度。N2作为载气，分流比为5:1。FID温度设定为300°C，进样口温度为280°C。柱箱温度在80°C保持1 min，然后以20°C/min的速率逐步升温至300°C，并保持20 min。桦木酸通过高效液相色谱检测。上层有机相自然蒸发干燥后，加入600 μL甲醇，超声悬浮3 h，使用SB-C18色谱柱（Agilent 1260，美国）进行分析。流动相A含10%甲醇和0.1%甲酸的水溶液，流动相B为纯乙腈。流动相（A/B，15:85，v/v）流速为0.8 mL/min，检测波长为203 nm。
【数据】提取溶剂：乙酸乙酯600 μL；研磨珠：1.5 g（0.5 mm直径）；研磨条件：55 Hz、4°C、30 min；离心：12,000 rpm、10 min；GC条件：HP-5柱、FID 300°C、进样口280°C、程序升温80°C→300°C（20°C/min）；HPLC条件：SB-C18柱、流速0.8 mL/min、检测波长203 nm、流动相A/B=15:85
2.7 补料分批发酵
补料分批发酵培养基包含20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、8 g/L KH2PO4、3 g/L MgSO4、0.72 g/L ZnSO4⋅7H2O、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液。补料分批发酵中，挑取单菌落接种至5 mL YPD培养基，在220 rpm、30°C条件下培养18 h。随后，将1 mL种子培养物转接至含15 mL YPD培养基的250-mL摇瓶中，在30°C、220 rpm旋转摇床中维持12 h。然后，将5 mL培养物转接至含100 mL YPD培养基的500-mL摇瓶中，在30°C、220 rpm旋转摇床中培养12 h。补料分批发酵在5-L生物反应器（百仑，中国）中进行，通过补充600 g/L葡萄糖将葡萄糖浓度维持在0–2 g/L。使用氨水将pH维持在5.0–5.5之间，溶解氧（DO）水平维持在30%。当OD600达到120时，在指数生长期加入7 g/L半乳糖诱导桦木酸合成。
【数据】发酵罐：5-L生物反应器；培养基组分：20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、8 g/L KH2PO4、3 g/L MgSO4、0.72 g/L ZnSO4⋅7H2O、10 mL/L微量元素、12 mL/L维生素；补糖：600 g/L葡萄糖维持0–2 g/L；pH：5.0–5.5（氨水调节）；DO：30%；诱导：7 g/L半乳糖（OD600=120时）
研究结果
3.1 增强桦木酸合成的2,3-氧化角鲨烯前体库
角鲨烯是一种易积累的中间代谢产物，是一种亲脂性化合物，储存在酵母细胞的细胞质和脂滴中，是桦木酸和甾醇生物合成的重要前体。然而，大量角鲨烯在细胞质中的积累会对细胞造成胁迫，对细胞活性和桦木酸合成产生不利影响。脂滴对角鲨烯的储存能力有限，而过氧化物酶体作为参与细胞解毒的主要细胞器，被认为是酵母中亲脂性产物的有前景的储存细胞器。因此，我们将角鲨烯合成途径区室化到过氧化物酶体中，以促进代谢中间体的隔离。我们推测这种方法可能有助于降低角鲨烯中间体的细胞质浓度，从而减轻细胞负担。
桦木酸的合成起源于甲羟戊酸（MVA）途径，2,3-氧化角鲨烯被确定为桦木酸生物合成途径中的关键前体。然而，酿酒酵母内源的麦角甾醇途径与桦木酸合成竞争底物2,3-氧化角鲨烯，导致2,3-氧化角鲨烯快速流向副产物途径。因此，我们采用代谢工程策略调节麦角甾醇生物合成，减少其对2,3-氧化角鲨烯的消耗，从而将更多MVA途径来源的2,3-氧化角鲨烯导向酿酒酵母中的桦木酸合成（图1A）。
为将工程途径定位到过氧化物酶体，选择了ePTS1融合标签进行定位。随后，为评估过氧化物酶体作为萜烯合成细胞位点的潜力，将包含九个基因（ERG10、ERG13、tHMGR1、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20和ERG9）的工程化角鲨烯合成途径融合到C端ePTS1。通过在CEN.PK2-1C菌株中过表达这些基因，获得了工程菌株SquP1，其角鲨烯产量高达1128.85 ± 25.32 mg/L（图1B）。
基因表达水平直接由相应启动子的强度决定，产物合成途径中基因转录水平的调控对代谢通量分配至关重要。细胞内2,3-氧化角鲨烯的含量决定三萜类化合物的生物合成通量，过氧化物酶体中积累的角鲨烯被ERG1转化为2,3-氧化角鲨烯，后者作为细胞生长和三萜类化合物生产的代谢物。因此，我们构建了分别由P GAL1和P GAL10启动子控制ERG1表达的菌株OSQ1和OSQ2，以鉴定增强角鲨烯向2,3-氧化角鲨烯代谢流量的有效启动子。然而，在这两个菌株中均未检测到2,3-氧化角鲨烯（图1C）。
鉴于ERG7和ERG1受代谢网络的严格调控，我们假设2,3-氧化角鲨烯作为麦角甾醇合成途径的前体，会被下游ERG7迅速转化为羊毛甾醇，从而阻止2,3-氧化角鲨烯在细胞内的积累。为考察工程菌株中代谢通量的迁移，我们测定了这些菌株中的角鲨烯和麦角甾醇水平，结果检测到角鲨烯产量下降，而2,3-氧化角鲨烯的下游产物麦角甾醇在OSQ1和OSQ2菌株中增加。作为麦角甾醇合成的前体，2,3-氧化角鲨烯极有可能被ERG7（催化2,3-氧化角鲨烯生成麦角甾醇的酶）快速转化，从而阻止其在细胞中积累。此外，我们发现OSQ1菌株比OSQ2消耗更多角鲨烯，这为使用强启动子表达ERG1更有利于角鲨烯向下游产物转化提供了证据。因此，我们考虑使用GAL1启动子增强酿酒酵母中ERG1的表达（图1D）。
此前研究表明，类固醇的过度积累可通过内质网相关蛋白降解途径导致ERG1降解。为解除负反馈调节，我们考虑使用ERG7来减弱或抑制其生物活性。作为细胞膜的重要组成成分，麦角甾醇在膜结合酶的活性和细胞物质转运中发挥重要作用。因此，完全抑制麦角甾醇合成会严重损害膜的结构和功能完整性，最终导致细胞死亡。为此，我们提出了ERG7-ERG1稳态机制，在转录和翻译水平调控代谢途径。使用来自黄柄曲霉（Talaromyces flavus）、白色念珠菌（Candida albicans）和黄曲霉（Aspergillus flavus）的ERG7基因替换酿酒酵母内源ERG7，分别构建了菌株OSQ3、OSQ4和OSQ5（图1D）。在这些工程菌株中，我们发现角鲨烯浓度显著降低，但麦角甾醇未检测到显著变化。此外，在三个菌株中均检测到2,3-氧化角鲨烯的细胞内水平升高，表明当内源ERG7基因被其他真菌来源的同源基因替换时，ERG7活性可以被减弱，2,3-氧化角鲨烯向麦角甾醇的转化减少，从而导致2,3-氧化角鲨烯在酿酒酵母中积累。在这三个菌株中，OSQ3菌株消耗了超过85%的角鲨烯，其2,3-氧化角鲨烯的细胞内产量最高，达363.45 ± 6.24 mg/L（图1E）。因此，我们选择OSQ3菌株作为后续三萜类化合物生产的理想底盘细胞。
上述发现证明，酿酒酵母中角鲨烯的区室化积累为桦木酸合成提供充足前体来源是一种有前景的策略，工程菌株OSQ3的角鲨烯产量为1128.85 ± 25.32 mg/L。此外，我们协调了ERG7-ERG1平衡，在转录和翻译水平调控ERG7基因表达，获得高达363.45 ± 6.24 mg/L的2,3-氧化角鲨烯产量。通过拉-阻策略，我们实现了2,3-氧化角鲨烯的高水平胞内积累，为其他多环三萜类化合物的合成奠定了基础。
【数据】SquP1菌株角鲨烯产量：1128.85 ± 25.32 mg/L；OSQ1/OSQ2菌株：未检测到2,3-氧化角鲨烯；OSQ3菌株：消耗>85%角鲨烯，2,3-氧化角鲨烯产量363.45 ± 6.24 mg/L；异源ERG7来源：Talaromyces flavus、Candida albicans、Aspergillus flavus
3.2 引入羽扇豆醇合酶构建羽扇豆醇合成途径
2,3-氧化角鲨烯是三萜类和甾醇合成的共同前体，通过不同氧化角鲨烯环化酶（OSCs）的催化生成不同的环状前体，这一反应对于三萜类化合物的结构多样性也至关重要。羽扇豆醇合酶是一种常见的OSC，催化2,3-氧化角鲨烯环化生成羽扇豆醇——羽扇豆烷型三萜的母核。来自拟南芥的AtLUP1基因是最早被鉴定的三萜合酶之一，已被证实在进化上保守且具有高度的催化多功能性。因此，为构建合成羽扇豆醇的酿酒酵母细胞工厂，我们对AtLUP1密码子进行了优化。
通常，高效产物合成不受单一限速步骤的限制，而是依赖于多种酶的协同平衡。虽然单基因过表达可以轻易实现……
【数据】基因：AtLUP1（拟南芥来源）；密码子优化：是；催化反应：2,3-氧化角鲨烯→羽扇豆醇
3.3 桦木酸合成途径的构建与优化
（原文后续结果部分未在节选范围内完整呈现，以下根据已有节选内容翻译）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过双细胞器区室化策略在酿酒酵母中实现了桦木酸的从头合成。首先，通过优化角鲨烯单加氧酶（ERG1）的表达并用黄柄曲霉来源的异源ERG7替换天然羊毛甾醇合酶（ERG7），实现了2,3-氧化角鲨烯的胞内积累。随后，将代谢途径分为两个模块——过氧化物酶体区室化的角鲨烯和脂滴区室化的2,3-氧化角鲨烯、羽扇豆醇及桦木酸——这有助于平衡代谢途径中的通量，减少中间代谢物对宿主细胞生长的抑制作用。最后，筛选了CYP和CPR酶的最佳组合，平衡了脂滴中电子传递链的还原力，并将编码CYP和CPR的多拷贝基因整合到酵母基因组中。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"区室化+拉阻策略"结合解决疏水性产物合成与储存难题的典型范例。通过将角鲨烯合成途径锚定于过氧化物酶体、将下游途径定位于脂滴，巧妙规避了胞质中亲脂性中间体积累对细胞的毒性。异源ERG7替换策略调控ERG7-ERG1稳态平衡，体现了对内源代谢调控网络的精细干预。从摇瓶77.53 mg/L到5-L发酵罐205.74 mg/L的放大表现，验证了该策略的工业可行性。然而，桦木酸产量仍低于工业化要求，后续可通过动态调控、蛋白工程改造CYP酶活性等策略进一步提升。
参考来源
Tang, S. De novo biosynthesis of betulinic acid in engineered Saccharomyces cerevisiae. Bioorganic Chemistry, 2024. DOI: 10.1016/j.bioorg.2024.107737
DOI: 10.1016/j.bioorg.2024.107737