来源：Comparative protein engineering redirects the specificity of Clostridium botulinum proteases（Cell Chemical Biology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
肉毒杆菌神经毒素A型和E型（BoNT/A、BoNT/E）的蛋白酶结构域LC/A和LC/E天然切割SNAP25，在临床上应用广泛。本研究采用比较蛋白质工程策略，结合前期突变数据、生物信息学与结构信息，对LC/A和LC/E进行定向进化。最终获得含14个突变的LC/A变体，对SNAP23的特异性较此前报道的工程蛋白酶提高273倍；含8个突变的LC/E变体对SNAP29的切割活性提高26,000倍，且对SNAP25无可检测活性。两种工程蛋白酶在生理相关底物浓度和盐浓度下均保持改变后的底物偏好。
研究背景
细胞信号传导与治疗性蛋白酶依赖底物特异性实现靶向作用和治疗指数。凋亡信号通路中，caspase蛋白酶通过切割特定序列引导信息流动与信号放大。蛋白酶通常面对众多底物、假底物和抑制剂，有效的蛋白酶需对特定序列和结构的靶标具有优先动力学。肉毒杆菌神经毒素轻链（LC）是自然界特异性最高的蛋白酶之一，本文将其重新定向，使其对目标底物具有特异活性、强力蛋白水解能力，同时排斥高度同源的序列。BoNT家族各血清型序列多样但特异性高度同源。BoNT/A与BoNT/E序列同源性仅40%，但两者均切割SNAP25，且切割位点不同，分别识别60个或19个底物残基。BoNT/A作为多组分毒素，包含重链（HC/A）和锌金属蛋白酶轻链（LC/A）。尽管BoNT全毒素可结合其他神经元，但对周围运动神经元亚群具有优先特异性。
研究方法
关键资源
菌株：BL21 Star (DE3)（Invitrogen，C601003）、XL1-Blue感受态细胞（Agilent，200249）。化学品与重组蛋白：LC/E和LC/A蛋白变体（本文构建，序列见Data S2）、SNAP29/SNAP25嵌合底物（本文构建）、SNAP23/SNAP25/SNAP29 DARET底物（本文构建）。试剂：SoluLyse蛋白提取试剂（Amsbio，L200125）、镍离子IMAC树脂（Biorad，1560137）、Benzonase核酸酶（Millipore，E1014-5KU）。试剂盒：Q5定点突变试剂盒（NEB，E0554S）、Gibson Assembly预混液（NEB，E2611S）、BCA蛋白定量试剂盒（Pierce，23225）。载体：pET-28c(+)（Novagen，69866-3）、pET-29 b(+)（MilliporeSigma，69-872-3）。仪器与耗材：96孔黑色平底聚苯乙烯NBS微板（Corning，3991）、96孔板（Celltreat，229576）、Acquity UPLC Protein BEH C4色谱柱（Waters，186004495）。软件：Prism（GraphPad）、Benchling、MassLynx（MaxEnt1算法，Waters）、UCSF ChimeraX。
菌株培养
大肠杆菌菌株XL1-Blue（Agilent）和BL21 Star (DE3)（Invitrogen）购自商业供应商。为确保基因型验证、身份和活力，所有菌株的新鲜储存液定期直接购自制造商。菌株在Luria-Bertani（LB）液体培养基或LB琼脂平板上37°C培养，添加卡那霉素（40 μg/mL）以维持质粒。长期保存时，经认证的菌株以甘油储存液形式于−80°C存档。
SNAP29/SNAP25嵌合DARET底物的构建、表达与纯化
用于底物步进第一步的嵌合底物，通过重叠延伸PCR将人SNAP29基因片段（氨基酸185至258，Genewiz合成）插入eGFP和eBFP之间，随后使用Gibson assembly克隆至pET-28c(+)。（SNAP29/SNAP25嵌合序列见Data S2。）质粒通过热激法（42°C）转化至化学感受态XL-1 Blue大肠杆菌细胞，涂布于LBkan琼脂平板，37°C过夜培养。挑取单菌落接种LBkan种子培养液，37°C、225 rpm振荡培养6至18小时。SNAP29 DARET-pET28c(+)构建体经DNA测序确认（Genewiz）。以SNAP29 DARET-pET28c(+)为模板，通过Q5突变（NEB）将SNAP29氨基酸224至240替换为人SNAP25（残基168至185）。SNAP29-SNAP25 DARET-pET-28c(+)构建体经DNA测序确认。嵌合底物2至8通过在SNAP25区域引入选择性突变构建（Q5突变，NEB），并经DNA测序确认。嵌合底物1至8及SNAP29 DARET-pET28c(+)质粒通过热激法（42°C）转化至化学感受态BL21 Star (DE3)大肠杆菌细胞，涂布于LBkan琼脂平板，37°C过夜培养。挑取单菌落接种LBkan种子培养液，37°C、225 rpm振荡培养6至18小时。随后，LBkan表达培养液以种子培养液的1:1000比例接种，37°C、225 rpm振荡培养至OD600达0.6。DARET底物生产通过添加IPTG（终浓度0.5 mM）诱导，22°C、225 rpm振荡培养18至24小时。细胞通过离心（6084×g，4°C，20分钟）收集，在冰上重悬于DARET裂解缓冲液（25 mM HEPES，300 mM NaCl，pH 8.0），于−80°C保存或立即裂解。可溶性蛋白通过超声破碎及离心（26,891×g，4°C，45分钟）提取，上清液与尿素（终浓度0.5 M）混合，室温下与预先用DARET裂解缓冲液平衡的镍离子IMAC树脂（Profinity，BioRad）批式结合过夜。DARET底物在重力柱中纯化：先用20倍柱体积（c.v.）DARET裂解缓冲液洗涤，再用12 c.v.含20 mM咪唑的DARET裂解缓冲液洗涤，最后用16 c.v.含250 mM咪唑的DARET裂解缓冲液洗脱。洗脱过程中收集肉眼可见绿色的DARET底物组分。合并这些组分，转移至透析袋（SnakeSkin，ThermoFisher），于4°C对预冷的冷泉港细胞内缓冲液（CSHIB，20 mM HEPES，110 mM KCl，10 mM NaCl，2 mM MgCl₂，5 mM KH₂PO₄，用KOH调pH至7.4）透析。经0.22 μm滤膜无菌过滤后，纯化的DARET底物通过BCA法（与BSA标准品比较）定量蛋白浓度，并通过SDS-PAGE表征纯度。DARET底物分装、避光保存，于4°C或闪冻后−80°C保存待测。
【数据】菌株：XL1-Blue、BL21 Star (DE3)；抗生素：卡那霉素40 μg/mL；培养温度：37°C；振荡：225 rpm；诱导剂：IPTG终浓度0.5 mM；诱导温度：22°C；诱导时间：18-24h；离心：6084×g/4°C/20min、26,891×g/4°C/45min；裂解缓冲液：25 mM HEPES、300 mM NaCl、pH 8.0；尿素终浓度：0.5 M；咪唑浓度：20 mM/250 mM；透析缓冲液：CSHIB（20 mM HEPES、110 mM KCl、10 mM NaCl、2 mM MgCl₂、5 mM KH₂PO₄、pH 7.4）；OD600：0.6
SNAP23、SNAP25、SNAP29 DARET底物的表达与纯化
以SNAP23 DARET底物为例。用于DARET检测的底物包含SNAP23 C端结构域（氨基酸137至211）或SNAP25（氨基酸134至206），融合于eGFP和eBFP之间，通过不依赖连接的克隆亚克隆至pET-28c(+)。DARET-pET-28c(+)质粒转化至BL21 Star (DE3)大肠杆菌，涂布于含40 μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板（LB/kan），37°C过夜培养。挑取单菌落接种LB/kan种子培养液，37°C、225 rpm振荡培养6至18小时。随后，LB/kan表达培养液以种子培养液的1:1000比例接种，37°C、225 rpm振荡培养至OD600达0.6。DARET底物生产通过添加IPTG（终浓度0.5 mM）诱导，于16、18或22°C、225 rpm振荡培养18至24小时。细胞通过离心（6084×g，4°C，20分钟）收集，在冰上重悬于DARET裂解缓冲液（25 mM HEPES，300 mM NaCl，pH 8.0），于−80°C保存或立即裂解。可溶性蛋白通过超声破碎及离心（26,891×g，4°C，45分钟）提取，上清液与尿素（终浓度0.5 M）混合，室温下与预先用DARET裂解缓冲液平衡的镍离子IMAC树脂（Profinity，BioRad）批式结合过夜。DARET底物在重力柱中纯化：先用20倍柱体积DARET裂解缓冲液洗涤，再用12 c.v.含20 mM咪唑的DARET裂解缓冲液洗涤，最后用16倍柱体积含250 mM咪唑的DARET裂解缓冲液洗脱。洗脱过程中收集肉眼可见绿色的DARET底物组分。合并这些组分，转移至透析袋（SnakeSkin，ThermoFisher），于4°C对预冷的冷泉港细胞内缓冲液（20 mM HEPES，110 mM KCl，10 mM NaCl，2 mM MgCl₂，5 mM KH₂PO₄，用KOH调pH至7.4）透析。经0.22 μm滤膜无菌过滤后，纯化的DARET底物通过BCA法定量蛋白浓度，并通过SDS-PAGE表征纯度。DARET底物分装、避光保存，于4°C保存。
【数据】菌株：BL21 Star (DE3)；抗生素：卡那霉素40 μg/mL；培养温度：37°C；振荡：225 rpm；诱导剂：IPTG终浓度0.5 mM；诱导温度：16/18/22°C；诱导时间：18-24h；离心：6084×g/4°C/20min、26,891×g/4°C/45min；裂解缓冲液：25 mM HEPES、300 mM NaCl、pH 8.0；尿素终浓度：0.5 M；咪唑浓度：20 mM/250 mM；透析缓冲液：20 mM HEPES、110 mM KCl、10 mM NaCl、2 mM MgCl₂、5 mM KH₂PO₄、pH 7.4；OD600：0.6
研究结果
增强工程化LC/A对SNAP23的特异性
本研究建立在先前报道的LC/A变体omLC/A之上。该LC/A变体对SNAP23相对SNAP25的切割特异性较为温和。这种特异性可通过特异性指数或SNAP23与SNAP25切割速率之比来量化。在"无盐缓冲液"（50 mM KH₂PO₄，pH 7.4）中，omLC/A的特异性指数为2。然而，在冷泉港哺乳动物细胞内缓冲液（CSH IB，20 mM HEPES，110 mM KCl，10 mM NaCl，2 mM MgCl₂，5 mM KH₂PO₄，pH 7.4）中进行蛋白水解测定时，该特异性指数降至1；该缓冲液旨在模拟细胞内条件。高盐缓冲液中观察到的特异性下降可能源于盐桥或氢键相互作用的破坏。本报告中，LC蛋白酶切割活性将在高盐CSH IB、生理相关底物浓度（估计为3 μM）和温度（37°C）下测定。因此，本文实验聚焦于LC/A变体的定向进化，以提高其对生理盐浓度的耐受性以及更高的特异性和蛋白水解活性。
为与此前发表的经八轮定向进化获得omLC/A的工作保持一致，omLC/A的初始突变在此显示为第9轮。第9轮中，文库靶向特定位置，使用两个单独克隆的简并密码子（NDT和VHG）；这两个密码子共同将靶向位置修饰为编码19种氨基酸。该策略省略了20种常见氨基酸中的Trp，因为Trp的大尺寸和疏水性可能不利于提高酶特异性；本文后续所有突变仅使用NDT密码子，编码结构和功能多样的12种氨基酸。第9轮聚焦于LC/A中可能以带电侧链作为结合主要决定因素的位置——基于酶结构的分析。作者假设修饰带电残基可以改善CSH IB高盐浓度下的识别和活性。每轮突变中，选择进行突变的特定残基编号在文中给出；为简洁起见，并非区域中每个残基都进行了筛选。
第9轮发现了LC/A的E55H变体（缩写为ARd9A，即第9轮A突变体）。ARd9A在CSH IB中将SNAP23对SNAP25的特异性指数提高了4倍。原始LC/A变体中E55侧链的负电荷可能形成有利于底物识别的电荷-电荷相互作用。然而，这种库仑相互作用的亲和力在CSH IB较高盐浓度下可能降低。因此，E55H取代可以找到相似但盐敏感性较低的相互作用。尽管该残基可能不直接接触底物，但E55H突变位于底物控制环中，可改变底物在结合裂隙中的契合度。该E55H变体在高盐条件下底物特异性的快速提升证明了这一初始设计策略的成功。
同样在第9轮中，作者在活性位点外的底物结合裂隙氨基酸位置生成了突变文库。例如，160区域包含一个β折叠，将底物夹在活性位点残基之间。作者假设这些残基可以微妙地改变底物与酶活性位点之间的相互作用，并可能提高酶的底物特异性和活性。Blum等人也在三个不同LC血清型（LC/E、LC/F和LC/X）的160区域发现了改变特异性的取代。该结果展示了噬菌体辅助连续进化的力量，其通过高通量筛选捕获重定向底物特异性的突变。此处，ARd9B中的E164S突变使SNAP23特异性较omLC/A提高9.4倍。将E55H和E164S突变组合，该LC/A变体（命名为ARd9C）对SNAP23的特异性提高了41倍。
第10轮中，作者进一步检查了高效160区域中的氨基酸残基。在161位筛选得到ARd10A中的I161T。在162位，ARd10B中的突变Q162D较先前最佳突变体增加了1.9倍的底物特异性。综合来看，160区域似乎是LC蛋白酶底物特异性的热点区域。
后续突变采用了不同的文库设计策略——靶向高变位置。具体而言，作者在十个LC同源物（包括八个梭菌属（A至G和X）和两个非梭菌属（En和Wo））的比对中，突变了底物结合裂隙中序列保守性低的位置。这些血清型具有出色的切割能力和高底物特异性。但这些酶在底物或切割位点上差异很大。纳入非梭菌直系同源物进一步扩展了序列多样性的调查范围，提供更多样化的比较数据。血清型间100%保守的位置可能反映了蛋白质折叠或催化功能的刚性序列要求。相比之下，20s和50s环具有0%保守的短片段。这些环中缺乏保守序列可能导致这些血清型底物特异性的差异。因此，作者假设这些氨基酸取代高度可变的位置是定向进化活动的理想靶点。
受此策略启发，第11轮靶向低序列保守性位置。作者首先聚焦于构成底物结合裂隙的环，筛选了250和300区域突变的文库。ARd11A中的Y250F、ARd11B中的T306S，以及ARd11C中Y250F和T306S的组合，使LC/A对SNAP23的特异性较ARd10B提高了3.5倍。定向进化过程中积累的组合突变产生了ARd11C，其共有14个总突变，SNAP23/25特异性指数较起始突变体omLC/A提高273倍。
接下来，作者比较了定向进化活动中最佳LC/A变体的米氏动力学。过表达并纯化的ARd10B和ARd11C在CSH IB中测定，比较它们对SNAP23和SNAP25的切割活性。ARd11C对SNAP23的催化效率较omLC/A提高18倍。这种SNAP23蛋白水解活性的提高由ARd11C的K M降低和k cat增加共同驱动；换言之，ARd11C比omLC/A更好地结合靶标底物，且催化速率更快。此外，ARd11C变体对SNAP25的切割活性大幅降低。ARd11C对SNAP25的催化效率较omLC/A降低28倍，较WT LC/A降低42倍。对SNAP23切割特异性的提高和对SNAP25活性的降低，主要反映在对SNAP23的催化速率（k cat）提高和与SNAP25结合亲和力（K M）降低。第10轮和第11轮之间的增益通过比较ARd10B和ARd11C的催化效率（k cat/K M）得以揭示。尽管两者对切割SNAP23的催化效率基本相同，但ARd11C对SNAP25的催化效率较ARd10B低>300倍。
LC/A定向进化活动的信息随后指导了LC/E的定向进化。这些实验证明了LC/A定向进化结论的普适性，也将比较蛋白质工程的概念从比较蛋白质三维结构和序列扩展到功能层面。
【数据】缓冲液：无盐缓冲液（50 mM KH₂PO₄，pH 7.4）/CSH IB（20 mM HEPES、110 mM KCl、10 mM NaCl、2 mM MgCl₂、5 mM KH₂PO₄，pH 7.4）；底物浓度：3 μM；温度：37°C；omLC/A特异性指数：无盐缓冲液中为2、CSH IB中为1；ARd9A特异性提高：4倍；E164S特异性提高：9.4倍；ARd9C特异性提高：41倍；Q162D提高：1.9倍；ARd11C提高：3.5倍（较ARd10B）；ARd11C总突变数：14个；特异性指数提高：273倍（SNAP23/25，较omLC/A）；催化效率提高：18倍（SNAP23，较omLC/A）；SNAP25催化效率降低：28倍（较omLC/A）、42倍（较WT LC/A）；ARd11C对SNAP25催化效率较ARd10B低：>300倍
讨论与解读
值得注意的是，ERd6A在底物步进后仅需三轮进化即可获得。结果凸显了少量突变即可实现特异性的大幅改变。这些快速的特异性增益建立在LC/A工程获得的知识之上。然而，LC/A和LC/E的定向进化也发现了突变未能改善结合的位置。如本文所示，比较蛋白质工程利用结构和序列同源性来识别共享和多样的基序，从而驱动蛋白质功能的重大变化。选择进行突变的特定残基基于以下因素：首先，考虑每个残基相对于活性位点和底物的位置。总体而言，突变策略省略了活性位点或底物接触残基（即第一圈残基），而是靶向第二或第三圈残基。其次，分析氨基酸序列数据以识别各LC血清型间保守性低的残基。同时强调对特异性控制环的突变，这些环在LC血清型间通常具有较低的序列保守性。将突变集中在这些区域为改变底物特异性提供了特别有效的起点。
编译者解读
本研究展示了比较蛋白质工程在蛋白酶底物重定向中的高效性——通过跨血清型结构比对锁定可变区域，以少量突变实现特异性数量级跃升。LC/E变体对SNAP29的26,000倍活性提升尤为亮眼，但作者并未止步于体外活性，而是在生理盐浓度和底物浓度下验证了特异性保持，这为后续体内应用提供了可信度。局限在于研究仍停留在纯化蛋白层面，未涉及细胞或动物模型中的脱靶效应评估。从合成生物学角度看，这种"先比对、再定点、后进化"的策略可推广至其他治疗性蛋白酶或核酸酶的特异性改造，具有较高的方法论参考价值。
参考来源
期刊：Cell Chemical Biology, 2026
DOI: 10.1016/j.chembiol.2026.08.003
DOI: 10.1016/j.chembiol.2026.08.003