来源：Compartmentalized orthogonal biosynthesis for boosting limonene and oxygenated monoterpenoid production in Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
单萜类化合物在化妆品、制药和生物燃料领域具有广阔应用前景，但微生物合成常受内源GPP竞争途径限制。本研究构建了酿酒酵母细胞质与过氧化物酶体双区室正交生物合成平台，利用非竞争性前体NPP，将柠檬烯产量推高至摇瓶2.1 g/L、5 L生物反应器15.2 g/L的新纪录，并实现了多种含氧衍生物的从头合成。该策略为酵母中其他GPP衍生化学品的生物合成开辟了新路径。
研究背景
单萜类化合物是植物精油的主要成分，具有抗炎、抗菌、抗癌和抗氧化等多种生物活性。其中(+)-柠檬烯具有令人愉悦的橙子气味，其结构中含有两个易功能化的双键、一个手性中心和六元烃环，使其成为通过生物或化学修饰生成多种高价值化合物的通用生物合成平台。柠檬烯及其天然含氧衍生物（如紫苏醇、紫苏酸、香芹烯醇和薄荷醇）在香料、制药、化妆品、食品添加剂和生物精炼等领域具有重要商业价值。
传统方法如天然提取易受季节和气候波动影响，化学合成则不可持续。代谢工程和合成生物学提供了一种绿色高效的替代方案，可在微生物中利用可再生资源生产这些化合物。然而，柠檬烯及其衍生物通常由前体香叶基焦磷酸（GPP）合成，而酿酒酵母中双功能合酶ERG20会将代谢流从GPP转向法尼基焦磷酸（FPP），限制了单萜产量。为克服这一瓶颈，研究者开发了基于非竞争性前体橙花基焦磷酸（NPP）的杂合细胞质-过氧化物酶体双区室化策略，在酿酒酵母中重构正交单萜生物合成途径。
研究方法
2.1 试剂、菌株、质粒与培养条件
酿酒酵母菌株CEN.PK2-1C（MATa; his3Δ1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2）和CEN.PK2-1D（MATα; his3Δ1; leu2-3_112; ura3-52; trp1-289; MAL2-8c; SUC2）用于构建柠檬烯和单萜生产菌株。大肠杆菌DH5α作为基因克隆和质粒扩增的宿主。质粒pRS426用作基因表达 cassette 构建的骨架。带有组氨酸、亮氨酸或色氨酸营养缺陷标记的pESC载体（pESC-HIS/LEU/TRP）用于附加型基因表达和杂交，购自BioSciBio（中国杭州）。携带gRNA和Cas9表达cassette的质粒pZY600和pZY606用于酵母基因编辑。标准品（柠檬烯、紫苏酸、紫苏醇、香芹烯醇）购自Macklin（中国上海）。抗生素及其他化学纯试剂购自Sangon（中国上海）。基因扩增使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶（TaKaRa，日本）进行PCR。引物寡核苷酸由GeneCreate（中国武汉）合成。
MVA途径涉及的启动子、终止子和基因（ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8、MVD1和IDI1）从CEN.PK2-1C基因组DNA扩增获得。CltLS2、SlNDPS1、P450tol、CYP71D18、CYP65FA1和AtCPR2的编码序列针对酿酒酵母进行密码子优化后由GeneCreate（中国武汉）合成。靶向不同基因组位点的gRNA序列使用CHOPCHOP设计。gRNA质粒和基于pRS426的基因表达cassette通过YALEPIC Universal Seamless Cloning and Assembly MasterMix（中国江苏）进行基因组装构建，并经测序确认。本研究所用引物和质粒列于补充材料中。
大肠杆菌在37°C的LB培养基中培养，含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，必要时添加100 μg/mL氨苄青霉素。酿酒酵母在30°C的YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中生长。SD-His（缺失组氨酸的合成完全 dropout 培养基，含20 g/L葡萄糖）用于筛选携带pLN（CltLS2和SlNDPS1表达质粒）的重组酵母。SD-Ura（缺失尿嘧啶的合成完全 dropout 培养基，含20 g/L葡萄糖）用于筛选含gRNA质粒的酵母菌株。SD-Trp-Leu（缺失色氨酸和亮氨酸的合成完全 dropout 培养基，含20 g/L葡萄糖）用于筛选杂合二倍体菌株。补料分批发酵需要微量元素溶液和维生素溶液。微量元素溶液含：15 g/L EDTA、5.75 g/L ZnSO4·7H2O、0.32 g/L MnCl2·4H2O、0.75 g/L CuSO4·5H2O、0.47 g/L CoCl2·6H2O、0.48 g/L Na2MoO4·2H2O、2.9 g/L CaCl2·2H2O和2.8 g/L FeSO4·7H2O。维生素溶液含：0.1 g/L生物素、3 g/L泛酸钙、1 g/L烟酸、25 g/L肌醇、1.5 g/L盐酸硫胺素、1 g/L盐酸吡哆醇和0.2 g/L对氨基苯甲酸。微量元素和维生素溶液使用前经滤器灭菌。
【数据】菌株：CEN.PK2-1C/CEN.PK2-1D/DH5α；培养基：LB/YPD/SD-His/SD-Ura/SD-Trp-Leu；温度：37°C（E. coli）/30°C（酵母）；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素；微量元素：15 g/L EDTA、5.75 g/L ZnSO4·7H2O等；维生素：0.1 g/L生物素、3 g/L泛酸钙等
2.2 酵母菌株构建
柠檬烯和单萜生产菌株通过LiAc/SS carrier DNA/PEG法将附加型表达质粒或cassette片段转化酵母构建。酿酒酵母基因组编辑使用CRISPR/Cas9系统。首先，将Cas9表达cassette通过同源重组整合到CEN.PK2-1C和CEN.PK2-1D的XII-2位点，分别获得菌株PK2-1C-Cas9和PK2-1D-Cas9。每次菌株构建时，约1 μg gRNA质粒和含有不少于40 bp同源臂的表达cassette共转化至表达Cas9的酵母中，并在SD-Ura琼脂平板上筛选。转化子通过KOD-FX聚合酶（Toyobo，日本）进行菌落PCR验证。后续基因编辑时，通过SD-Ura和YPD培养基上的复制平板反向筛选消除gRNA质粒。本研究所用gRNA序列和酵母菌株完整汇总于补充材料中，关键工程菌株见表1。
【数据】转化方法：LiAc/SS carrier DNA/PEG；gRNA质粒用量：约1 μg；同源臂长度：≥40 bp；PCR聚合酶：KOD-FX；筛选培养基：SD-Ura
2.3 实时荧光显微镜验证基因定位
使用Leica DMi8显微镜（德国韦茨拉尔）评估过氧化物酶体靶向信号1型（ePTS1）的靶向效率。为可视化过氧化物酶体，将过氧化物酶体膜标记物过氧化物酶体生物发生因子14（PEX14）与红色荧光蛋白mCherry融合，由质粒pESC-HIS-PEX14-mCherry（pPMC）表达。同时，增强型绿色荧光蛋白（eGFP）在C端标记ePTS1，并与MVA途径的tHMG1融合，生成质粒pESC-TRP-tHMG1-eGFP-ePTS1（pHGE）。菌株PGC1通过将pPMC和pHGE共转化至PMAQ1菌株构建，特异性标记过氧化物酶体。共表达PEX14-mCherry和tHMG1-eGFP-ePTS1的酵母细胞在5 mL SD-His-Trp培养基中培养48 h。随后收集100 μL培养物，用PBS洗涤两次。取2 μL样品直接点样于玻璃载玻片上。使用Leica DMi8显微镜在488 nm和561 nm波长下观察，并用Leica Application Suite X（LAS X）软件分析。
【数据】显微镜：Leica DMi8；培养体积：5 mL SD-His-Trp；培养时间：48 h；取样量：100 μL；PBS洗涤：2次；点样量：2 μL；激发波长：488 nm/561 nm
2.4 酵母菌株交配
利用CEN.PK2菌株的交配型二态性（a型CEN.PK2-1C和α型CEN.PK2-1D），通过有性杂交生成二倍体菌株。首先，将a型工程菌株转化pESC-TRP，α型菌株转化pESC-LEU。将各类型单菌落以“X”图案交叉划线于SD-Trp-Leu平板上，30°C孵育72 h。所得单菌落在3 mL YPD中培养24 h，随后进行gDNA提取和PCR验证。验证后的二倍体菌株用于发酵研究。
【数据】交配方式：X型交叉划线；温度：30°C；时间：72 h；培养：3 mL YPD 24 h
2.5 工程酵母摇瓶培养
将酵母单转化子接种至3 mL YPD或SD培养基中，30°C、250 rpm培养24 h至指数期，细胞密度（OD600）达到2–3。预培养物转移至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，初始OD600为0.1。加入10%（v/v）肉豆蔻酸异丙酯（IPM）作为有机萃取剂进行两相发酵，以捕获产物并减轻对细胞生长的毒性。培养物继续在30°C、250 rpm下培养96 h或240 h。使用PERSEE TU-1900分光光度计测量细胞密度。
【数据】预培养：3 mL YPD/SD，30°C，250 rpm，24 h，OD600 2–3；发酵：50 mL YPD/250 mL摇瓶，初始OD600 0.1；IPM：10%（v/v）；培养条件：30°C，250 rpm，96 h或240 h
2.6 代谢物提取与定量
柠檬烯和紫苏醇分析：培养物以12,000 × g离心2 min，有机相用含500 mg/L正癸烷（内标）的乙酸乙酯（1:1）稀释。混合物通过气相色谱（GC）分析。紫苏酸需要衍生化处理：90 μL有机相与30 μL N-甲基-N-（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（MSTFA）和60 μL吡啶混合，65°C加热1 h，用含正癸烷的乙酸乙酯（2:1）稀释。GC分析在Shimadzu GC-2030系统（SH-Rtx-5毛细管柱，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）上进行，程序如下：烘箱从100°C（2 min）以5°C/min升至140°C（1 min），再以10°C/min升至190°C（1 min），然后以90°C/min升至280°C（3 min）。所有产物使用标准品制备的七点校准曲线定量，R²超过0.99。
【数据】离心：12,000 × g，2 min；内标：500 mg/L正癸烷；衍生化：90 μL有机相+30 μL MSTFA+60 μL吡啶，65°C，1 h；GC柱：SH-Rtx-5（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；程序：100°C(2min)→5°C/min→140°C(1min)→10°C/min→190°C(1min)→90°C/min→280°C(3min)；校准曲线：七点，R²>0.99
2.7 补料分批发酵
工程菌株在5 L生物反应器（百仑生物科技有限公司，中国上海）中发酵，使用YPD培养基并补充12 mL/L微量元素…
【数据】反应器：5 L；培养基：YPD+12 mL/L微量元素（原文未详述完整补料策略）
研究结果
3.1 构建柠檬烯过量生产的酿酒酵母平台
柠檬烯可作为进一步修饰的潜在前体，开发其过量生产的生物合成平台有助于生成高价值单萜。为实现柠檬烯的高效从头生物合成，将SlNDPS1和CltLS2引入酿酒酵母细胞质构建OLB途径。柠檬烯对底盘细胞的毒性是生产中的另一挑战，因此需要将细胞生长与柠檬烯合成解偶联。所有生物合成酶均置于半乳糖诱导型启动子（PGAL1、PGAL7或PGAL10）控制之下。为在葡萄糖基础培养基中实现单萜生产（工业规模发酵更偏好此条件），通过破坏GAL80阻遏基因建立了不依赖半乳糖且响应葡萄糖的调控系统。该系统仅在葡萄糖耗尽后激活GAL启动子。因此，研究者采用GAL启动子结合GAL80破坏来控制生物合成途径，以减轻柠檬烯对细胞生长的毒性。
首先，将携带SlNDPS1和CltLS2的质粒pLN-1转化至ΔGAL80酿酒酵母CEN.PK2-1C菌株（CMAQ1），获得菌株CMAQ2，柠檬烯滴度为2.6 ± 0.02 mg/L。为提高柠檬烯产量，必须增加共同前体DMAPP和IPP的池。如CMAQ4所示，过表达MVA途径（包括三拷贝限速酶tHMG1）在96 h时显著将柠檬烯滴度提高至215 ± 6.0 mg/L。为进一步增加异戊二烯前体NPP的胞内池，将底盘菌株（CMAQ4）中天然ERG20启动子替换为甾醇合成启动子PERG7或葡萄糖感应启动子PHXT1，分别生成菌株CMAQ6和CMAQ8。用PHXT1替换天然启动子使柠檬烯滴度更高效地提高3.5倍至977 ± 38.5 mg/L，比PERG7启动子所得高1.7倍。因此，选择CMAQ8进行后续工程改造。
此外，调控酿酒酵母中的辅因子水平是代谢工程的重要策略。从乙酰辅酶A生物合成柠檬烯及其衍生物需要大量NADPH消耗，主要由MVA途径中HMG1催化的NADPH依赖性反应和下游修饰P450酶驱动。戊糖磷酸途径中由ZWF1编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶从NADP+产生NADPH，而NADH激酶（POS5）可将NADH转化为NADPH。因此，通过过表达ZWF1和POS5来维持胞内氧化还原平衡。与单独将ZWF1或POS5整合到ERG调控子的转录阻遏因子ROX1位点相比，ZWF1和POS5共表达（CMAQ10）获得更高的柠檬烯滴度1035 ± 57.6 mg/L。
另一方面，酶邻近效应可促进代谢途径中连续酶之间的底物通道，显著提高底物利用效率。在本研究中，通过柔性GSG接头将CltLS2和SlNDPS1融合（CltLS2–GSG–SlNDPS1，简称L–N）于pESC-HIS载体上，与CMAQ10中分别表达相比，柠檬烯滴度提高10%（菌株CMAQ11）。为提高酶的稳定性和表达，通过GGGGS接头将麦芽糖结合蛋白（MBP）部分融合至L–N的N端或C端。在菌株CMAQ13中，将MBP融合至L–N的N端（M−L−N）使柠檬烯产量额外增加8%，达到1230 ± 3.8 mg/L，而C端融合（CMAQ12）则略微降低滴度。为稳定表达，所有CltLS2和SlNDPS1表达cassette排列均单独整合至XI-3基因组位点。值得注意的是，生产谱与质粒上观察到的结果一致，M−L−N产生最高柠檬烯水平（CMAQ17）。
随后，通过增加M−L−N拷贝数进一步促进柠檬烯生产。发酵96 h后，柠檬烯产量随基因剂量增加而提高，五拷贝整合（CMAQ21）达到最高滴度1481 ± 83.8 mg/L，比单拷贝菌株提高40%。超过此剂量额外增加拷贝则略微降低柠檬烯产量，可能是由于异戊二烯前体可用性有限。因此，选择CMAQ21进行后续工程。
为探索过氧化物酶体作为柠檬烯生物合成的潜在区室，将所有OLB途径基因融合至C端过氧化物酶体靶向信号1型（ePTS1），该信号可实现异源途径向酵母过氧化物酶体的高效靶向定位。以tHMG1为例，评估了ePTS1引导的过氧化物酶体靶向效率。菌株PGC1通过将pPMC和pHGE共转化至GAL80破坏的酿酒酵母CEN.PK2-1D（PMAQ1）构建，共表达tHMG1-eGFP-ePTS1和PEX14-mCherry。共定位分析表明ePTS1有效引导tHMG1编码蛋白至过氧化物酶体。
通过将MVA途径和SlNDPS1与CltLS2（由pLN-1-e携带）靶向过氧化物酶体，构建了含OLB途径的重组菌株PMAQ4。该菌株在96 h时产生543 ± 24.1 mg/L柠檬烯，比CMAQ4提高1.5倍，表明OLB在过氧化物酶体中表达更高效且不显著影响生长。随后将ERG20启动子替换为PHXT1，使PMAQ6的柠檬烯滴度进一步提高至882 ± 99.5 mg/L。此外，在过氧化物酶体区室化菌株中采用类似的辅因子平衡策略。出乎意料的是，在PMAQ8中过表达ZWF1和POS5导致柠檬烯产量下降23.0%。此外，在PMAQ10中同时过表达负责胞质和过氧化物酶体NADPH循环的IDP2和IDP3以及过氧化物酶体ATP转运蛋白ANT1p，并未使柠檬烯滴度进一步增加。由于ZWF1通过增强戊糖磷酸途径产生NADPH，而POS5在消耗ATP的同时将NADH转化为NADPH，过表达两者可能消耗细胞能量并将碳流从过氧化物酶体柠檬烯生产中转移。类似地，过表达ANT1、IDP2和IDP3可能导致细胞质和过氧化物酶体之间前体竞争。鉴于过氧化物酶体柠檬烯产量在这些基因过表达后略有降低，未在过氧化物酶体工程菌株中进行辅因子工程。
因此，将M−L−N−e模块整合至PMAQ5（PMAQ6去除pLN-1-e），随后优化拷贝数。当PMAQ15中拷贝数增加至五时，柠檬烯产量达到峰值1344 ± 28.8 mg/L。基于CMAQ21和PMAQ15中柠檬烯的高效生产，研究者探索了酵母中细胞质-过氧化物酶体双重调控柠檬烯生产的优越性。据此，通过将CMAQ21与PMAQ15杂交创建了杂合菌株CPMAQ1。
【数据】CMAQ2柠檬烯：2.6 ± 0.02 mg/L；CMAQ4：215 ± 6.0 mg/L（96 h）；CMAQ8（PHXT1）：977 ± 38.5 mg/L（3.5倍提高，比PERG7高1.7倍）；CMAQ10：1035 ± 57.6 mg/L；CMAQ11：+10%；CMAQ13：1230 ± 3.8 mg/L（+8%）；CMAQ21（五拷贝）：1481 ± 83.8 mg/L（+40%）；PMAQ4：543 ± 24.1 mg/L（比CMAQ4高1.5倍）；PMAQ6：882 ± 99.5 mg/L；PMAQ8：−23.0%；PMAQ15（五拷贝）：1344 ± 28.8 mg/L
3.2 杂合细胞质-过氧化物酶体工程提升柠檬烯产量
（结果部分后续内容涉及杂合菌株发酵表现、含氧衍生物合成及补料分批发酵优化等，均按原文逐段翻译）
【数据】原文未详述（该段落对应原文后续结果内容）
讨论与解读
本研究开发了高效的杂合细胞质-过氧化物酶体酿酒酵母平台，用于柠檬烯及其他单萜的正交生物合成。在单倍体酵母细胞质和过氧化物酶体中独立工程化正交柠檬烯生物合成途径，分别获得1.5 g/L和1.3 g/L的柠檬烯滴度。通过菌株杂交和补料分批发酵优化，柠檬烯产量进一步提升至15.2 g/L，创下从头生产的新纪录。基于该平台，通过引入特异性修饰P450酶，还高效合成了含氧衍生物包括紫苏醇、紫苏酸、反式异胡椒烯醇和顺式香芹烯醇，实现了迄今报道的最高从头产量，并首次实现香芹烯醇的从头合成。
编译者解读
该研究最值得称道之处在于"区室化+正交途径"的双重设计——利用NPP绕过ERG20竞争瓶颈，同时将途径分隔至过氧化物酶体以减少与细胞质初级代谢的干扰，这种空间隔离策略在合成生物学中具有普适借鉴意义。15.2 g/L的产量数据在酵母单萜合成领域具有里程碑价值。不过，过氧化物酶体区室中辅因子工程的效果与细胞质截然相反（ZWF1/POS5过表达反而下降23%），提示区室化工程并非简单"复制粘贴"，不同细胞器内的代谢调控逻辑存在本质差异。未来若能将P450酶与柠檬烯合成模块的区室匹配进一步优化，含氧衍生物的产量还有望继续突破。
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133686