来源：Multi-level metabolic engineering for efficient ergothioneine production in yeast using a Pleurotus ostreatus-derived pathway（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（EGT）是一种具有2-硫代组氨酸独特结构的稀有天然氨基酸，凭借其硫醇-硫酮互变异构特性展现出优异的化学稳定性和强抗氧化活性。本研究首次将平菇（Pleurotus ostreatus）来源的EGT合成双酶基因（PoEgt1、PoEgt2）异源表达于酿酒酵母中，通过系统代谢工程策略——包括强化关键酶表达、重塑前体供应网络、阻断竞争途径、促进乙醇利用及优化辅因子再生——将摇瓶发酵产量从25.36 mg/L逐步提升至108.33 mg/L，并在5 L生物反应器补料分批发酵中达到1960.12 mg/L。代谢组学分析进一步揭示了高产菌株的代谢重编程机制。
研究背景
L-麦角硫因是一种稀有的天然氨基酸，具有独特的2-硫代组氨酸结构。该结构允许硫醇-硫酮互变异构，赋予EGT卓越的化学稳定性和强效抗氧化性能。作为少数已知含硫代咪唑基团的生物活性分子之一，EGT表现出显著的抗炎、抗衰老和神经保护功能，在医药、化妆品和功能性食品领域具有广阔的应用前景。
然而，EGT的广泛应用受限于其生产工艺。目前合成EGT的三种途径——化学合成、生物提取和微生物发酵——均存在明显短板。传统化学合成工艺复杂、原子经济性低（不足30%），且手性控制困难；生物提取则产量低，难以满足工业需求。因此，开发高效、经济的生产方法成为研究重点。目前能合成EGT的微生物主要包括分枝杆菌、甲基杆菌、丝状真菌和蓝细菌等。细菌与真菌的EGT生物合成途径存在差异，但均以L-组氨酸为起点。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株详见表S1。E. coli 菌株（Trans1-T1和Trans110）在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中、37°C、200 rpm条件下培养，质粒构建和保存期间根据需要添加100 μg/mL氨苄青霉素作为选择压力。酿酒酵母生产菌株（S288C BY4741: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0）的培养条件根据实验目的而异，常规培养和EGT生产使用YPD培养基（20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物），在30°C、220 rpm条件下进行；基因改造过程中的转化子筛选使用SD/-URA和SD/-His营养缺陷培养基（SD：合成限定培养基）。添加含1 g/L 5-氟乳清酸的YPD培养基进行反选择。氨基酸前体（L-Met、L-Cys、L-His）根据实验需要添加。固体培养基可添加2%（w/v）琼脂。
摇瓶发酵实验采用标准化操作流程。首先，将单菌落接种于5 mL YPD培养基中，在30°C、220 rpm条件下过夜培养至对数中期。然后，以5%（v/v）接种量将菌液转接至含50 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中，在相同条件下继续发酵108 h，以确保EGT的充分合成与积累。
【数据】培养基：LB/YPD/SD营养缺陷培养基；温度：37°C（E. coli）/30°C（酵母）；转速：200 rpm（E. coli）/220 rpm（酵母）；氨苄青霉素：100 μg/mL；接种量：5%（v/v）；发酵时间：108h；葡萄糖：20 g/L
2.2 PoEgt1和PoEgt2基因的鉴定与序列分析
为鉴定平菇中的EGT生物合成基因PoEgt1和PoEgt2，本研究使用平菇基因组组装数据（NCBI分类ID：5322）进行了全面的基因组分析。查询序列包括来自15个真菌物种的Egt1和Egt2直系同源序列：粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、紫麦角菌（Claviceps purpurea）、匍枝根霉（Rhizopus stolonifer）、构巢曲霉（Aspergillus nidulans）、罗克福尔青霉（Penicillium roqueforti）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、碳黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、四孢脉孢菌（Neurospora tetrasperma）、双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、香菇（Lentinula edodes）、灰树花（Grifola frondosa）、蛹虫草（Cordyceps militaris）、茶树菇（Cyclocybe aegerita）和灵芝（Ganoderma sinense）。
使用ORF Finder工具（NCBI，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）预测PoEgt1和PoEgt2基因的开放阅读框（ORF），确保获得全长基因序列。随后，使用BLASTp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行蛋白质序列比对，并使用MEGA v11进行多序列比对。使用IQ-TREE 2.1.2（http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/）在最大似然（ML）方法下进行系统发育重建，设置1000次bootstrap重复以评估节点支持度。使用FigTree v1.3.1对所得系统发育树进行可视化和分析。使用NCBI保守结构域数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）鉴定保守蛋白结构域，通过MEME Suite（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）预测功能基序。TBtools-II可视化揭示这些特征的分布，突出显示EGT生物合成酶在真菌物种间的结构和功能保守性[26]。
本研究使用分子对接技术研究小分子配体（SAM、HIS、CYS和HER）与靶蛋白（PoEgt1、PoEgt2、NcEgt1和NcEgt2）之间的相互作用。首先，使用AlphaFold3预测蛋白质三维结构，并使用Maestro 11.9平台上的Protein Preparation Wizard模块进行预处理和能量优化。使用Chem3D初步优化后，对小分子配体进行加氢、结构优化和能量最小化处理。随后，使用Glide模块进行分子对接，以预测的蛋白质活性位点为中心生成对接网格，进行标准精度（SP）对接。最后，综合考虑对接分数和相互作用模式（如氢键、疏水相互作用等）来分析和评估配体的潜在结合活性。系统发育分析中使用的所有参考蛋白序列及其NCBI登录号和全长序列见表S2。
【数据】bootstrap重复：1000次；分子对接方法：Glide SP模式；结构预测工具：AlphaFold3；能量优化平台：Maestro 11.9；比对工具：BLASTp、MEGA v11
2.3 质粒构建与基因组编辑
初始EGT生产酿酒酵母菌株的构建通过系统遗传工程方法完成。首先，将已鉴定的PoEgt1和PoEgt2基因开放阅读框针对酿酒酵母进行密码子优化，并克隆至含有Delta1和Delta2[27,28]同源臂的pESC-URA3载体骨架中，同时将ScMet15基因插入pESC-HIS3载体（所有构建均由GeneWiz（中国）合成，本研究中密码子优化基因的核苷酸序列见表S3）。将组装好的质粒通过热激法转化至E. coli Trans1-T1感受态细胞（CD501–02，TransGen Biotech，中国），随后进行质粒提取和验证。
对于染色体整合，使用SapI（D5885，Beyotime，中国）和Esp3I（D5721，Beyotime，中国）限制性内切酶将质粒线性化，并通过LiAc介导的转化[29]导入酿酒酵母BY4741（CC301，Coolaber，中国），通过两步筛选流程选择成功整合子。为构建多拷贝菌株，将URA3-PoEgt1-PoEgt2表达盒靶向308a位点进行多拷贝整合，以URA3作为选择标记。对于过表达菌株，使用ESEfinder（https://esefinder.ahc.umn.edu/）进行启动子区域计算预测后，将天然启动子替换为强启动子pTEF1。采用Laughery等人[30]描述的CRISPR/Cas9系统进行精确启动子替换，将sgRNA/Cas9表达载体与修复模板通过LiAc方法共转化至酵母感受态细胞中，使用URA3标记筛选成功重组子。基因敲除菌株通过完整开放阅读框删除实现。本研究中构建的质粒列于表S4。本研究中使用的所有引物和寡核苷酸由擎科（青岛，中国）合成，列于表S5。
【数据】限制性内切酶：SapI、Esp3I；转化方法：热激法（E. coli）/LiAc法（酵母）；整合位点：δ位点、308a位点；启动子：pTEF1（强组成型）；筛选标记：URA3、HIS3、MET15
2.4 通过qPCR分析基因拷贝数和表达水平
为定量目标基因的相对表达水平，将酵母细胞在YPD培养基中过夜培养至对数中期。使用M5 EASYspin酵母RNA快速提取试剂盒（MF158–01，Mei5bio，中国）按照制造商方案提取总RNA。使用PrimeScript™ RT试剂盒（含gDNA Eraser）（RR047A，Takara，日本）从500 ng总RNA中按照标准方案合成第一链cDNA。在Applied Biosystems QuantStudio 5实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，美国）上使用基因特异性引物（表S5）和qPCR Master Mix（A6001，Promega，中国）进行定量PCR，每个反应设置三次重复，Ct值报告为三次重复的平均值。以管家基因（ACT1）作为内参，使用比较ΔΔCt方法[31]进行计算。
【数据】总RNA用量：500 ng；qPCR系统：QuantStudio 5；内参基因：ACT1；分析方法：ΔΔCt法；重复次数：3次
2.5 5 L生物反应器补料分批发酵
将单菌落接种于含20 mL YPD培养基的50 mL试管中，在30°C、220 rpm条件下过夜培养至对数生长期。然后将培养物以5%（v/v）接种量转移至两个含100 mL YPD培养基的500 mL锥形瓶中，继续培养至OD600达到3.0–4.0。将所得培养物转移至5 L生物反应器（初始工作体积为2 L YPD培养基），发酵条件控制在30°C ± 0.5°C、pH 5.0 ± 0.2（通过2 M KOH/H₂SO₄自动调节）、级联速度控制（500–1200 rpm）以维持溶解氧（DO）在20–30%，通气量为2 L/min（通过0.22 μm过滤器灭菌）。
【数据】反应器体积：5 L；初始工作体积：2 L；温度：30°C ± 0.5°C；pH：5.0 ± 0.2；转速：500–1200 rpm；DO：20–30%；通气量：2 L/min；接种量：5%（v/v）；OD600：3.0–4.0
研究结果
3.1 平菇EGT合酶的进化特征、蛋白质结构及底物结合机制分析
#### 3.1.1 关键酶PoEgt1和PoEgt2的进化与结构分析
在平菇中，EGT生物合成途径的最后两步由关键酶PoEgt1和PoEgt2催化。本研究对平菇的PoEgt1和PoEgt2酶进行了进化与结构分析，旨在系统评估其异源表达潜力，并为后续代谢工程提供理论基础。
进化分析表明，PoEgt1的底物结合区域与食用菌同源蛋白具有约85%的序列相似性。其底物结合口袋中的关键催化残基在空间结构上与高产参考酶高度保守，提示PoEgt1具备在异源表达系统中支持底物识别和催化功能的结构基础。进一步的结构域分析揭示了食用菌特有的适应性变异，如PoEgt2中的PLP结合结构域特征。这些预适应的结构特征可能增强与真核细胞翻译后修饰系统的兼容性（图2A）。此外，结构域特征与先前报道的蛹虫草EGT合酶[33]相比既表现出保守性又存在差异性。研究表明，食用菌通过在关键结构域（如Methyltransf_33和DinB）中发生适应性突变，同时保留核心催化功能（AAT_I和FGE-sulfatase），进化出高效的EGT合成能力。因此，异源表达平菇来源的PoEgt1和PoEgt2可能是构建酵母高效EGT生物合成途径的有前景的策略。
【数据】序列相似性：~85%；参考物种：蛹虫草；关键结构域：Methyltransf_33、DinB、AAT_I、FGE-sulfatase
#### 3.1.2 PoEgt1和PoEgt2的保守活性位点与高效底物结合模式
为阐明平菇EGT合酶的结构-功能关系，本研究以高产同源蛋白——粗糙脉孢菌来源的酶[23]作为参考进行系统结构分析。Ramachandran图分析（图S2）表明四个蛋白质模型具有高质量。重叠结果显示，PoEgt1和NcEgt1在底物结合口袋的关键残基（TYR800、TRP835和ARG442）处表现出显著的空间重叠（图2B（a, b））。类似地，PoEgt2和NcEgt2在整体结构和活性位点残基（TYR39、SER38、LYS238）方面表现出强保守性（图2C（a, b）），强调了关键催化位点的进化保守性[22,34]。
分子对接进一步阐明了它们的高效催化机制。PoEgt1通过涉及ARG-489和GLY-490的氢键网络稳定结合L-Cys，同时其Fe³⁺辅因子与HER之间的静电相互作用增强了催化效率（图2B（c, d, e））。在PoEgt1-SAM-His系统中，L-His与Fe³⁺配位并与ASN-834形成氢键，同时SAM与ARG451、TYR569和TRP835形成氢键，并与ASP809发生静电相互作用（图2B（f, g, h））。PoEgt2通过涉及LYS381、ARG66和LYS238的静电相互作用锚定HCO，同时与SER38和THR287形成氢键网络（图2C（c, d, e））。
这些发现证实PoEgt1和PoEgt2具有多个利于异源表达的优势，包括底物特异性、催化保守性和对真核环境的适应性。所鉴定的清晰构效关系为后续工程改造提供了精确靶点。总之，对PoEgt1和PoEgt2——平菇高效EGT合成的关键酶——的进化和结构分析揭示了保守与适应之间的进化平衡。其催化核心严格保守，确保功能完整性，而特定结构域的适应性变异增强了对真核系统的兼容性。这种“功能保守但系统适应”的特征使其成为构建酵母细胞工厂的理想遗传元件，为后续酶工程提供了理论指导和潜在靶点。对于Egt1，可靶向SAM结合口袋以提高底物亲和力并缓解反馈抑制。对于Egt2，可修饰底物结合结构域以增加硫供体亲和力或将辅因子偏好从NADPH转变为NADH。定向进化结合高通量筛选为鉴定具有更高活性和稳定性的优良变体提供了有力策略。
【数据】关键残基（PoEgt1/NcEgt1）：TYR800、TRP835、ARG442；关键残基（PoEgt2/NcEgt2）：TYR39、SER38、LYS238；PoEgt1-Cys相互作用残基：ARG-489、GLY-490；PoEgt1-SAM-His相互作用残基：ASN-834、ARG451、TYR569、TRP835、ASP809；PoEgt2-HCO相互作用残基：LYS381、ARG66、LYS238、SER38、THR287
3.2 平菇EGT生物合成途径在酿酒酵母中的构建与优化
#### 3.2.1 EGT生物合成途径的重建
基于平菇已被证实的EGT合成能力[35]，并考虑到其天然生产系统的不足，本研究首次在酿酒酵母中重建了平菇的EGT生物合成途径，旨在构建高效、环保的EGT生产平台。通过系统改造酿酒酵母菌株BY4741，将两个关键生物合成基因PoEgt1和PoEgt2以及营养缺陷标记基因ScHIS3和ScMET15精确整合至基因组的δ位点[36,37]，并置于半乳糖诱导型启动子GAL1和GAL10的调控之下（图3A）。
初步筛选后，ST7显示出最高的EGT滴度（25.36 ± 0.38 mg/L），且该菌株的PoEgt1基因拷贝数也在所有测试菌株中最高（图3B, C）。这一产量高于先前研究中在酿酒酵母EC1118中表达灰树花来源基因所报道的产量（20.61 mg/L）[38]，因此被选作后续优化的基础菌株。
【数据】ST7菌株EGT滴度：25.36 ± 0.38 mg/L；对照产量（灰树花来源基因/EC1118）：20.61 mg/L；整合位点：δ位点；启动子：GAL1/GAL10
#### 3.2.2 组成型EGT生产菌株的构建
在成功构建基础生产菌株的基础上，本研究进一步旨在开发不依赖诱导剂的组成型EGT生产系统，以降低生产成本并简化培养流程。半乳糖调控系统已被工程化改造，其分子机制已得到充分阐明[39]。在半乳糖存在时，Gal3p与Gal80p相互作用，解除后者对转录激活因子Gal4p的抑制，从而使Gal4p能够特异性结合GAL1/10启动子并激活下游基因表达（图3D）。
为建立不依赖诱导剂的组成型表达系统，利用基因工程技术精确敲除GAL80基因，获得工程菌株ST71（图3E）。实验结果表明，在非诱导条件下，菌株ST71的EGT产量（26.18 ± 0.43 mg/L）和生物量与半乳糖诱导的对照菌株ST7相当，证实半乳糖响应系统已被成功失活和调控（图3F）。这些发现与先前研究一致，表明GAL启动子系统通过将细胞生长与产物生物合成解偶联，有效降低代谢负担和产物毒性[40]，为构建组成型表达系统提供了理论基础。
【数据】ST71菌株EGT产量（非诱导条件）：26.18 ± 0.43 mg/L；对照菌株ST7（半乳糖诱导）：约25.36 mg/L；敲除基因：GAL80
#### 3.2.3 通过提高关键酶表达水平优化EGT生物合成途径
考虑到PoEgt1和PoEgt2基因表达对EGT生产的关键作用[23,41]，本研究采用基因组整合技术提高其表达水平，从而优化EGT生物合成效率。qPCR分析显示，工程菌株间PoEgt1和PoEgt2基因的转录水平存在显著差异（图3G）。随后，筛选出三个高表达候选菌株（ST717、ST718和ST719）进行摇瓶发酵实验。其中，ST719菌株表现出优异的EGT生产性能，滴度达到37.55 mg/L（原文此处截断）。
【数据】候选菌株：ST717、ST718、ST719；ST719菌株EGT滴度：37.55 mg/L（原文此处截断，后续数据原文未详述）
讨论与解读
本研究首次成功将平菇来源的双酶途径异源表达于酿酒酵母中，建立了绿色、高效、无需诱导剂的EGT生物合成细胞工厂。通过多阶段代谢工程策略——包括增强异源酶表达、重塑前体供应网络、改善乙醇利用和优化辅因子再生——显著提高了EGT生物合成效率。最终在补料分批发酵中实现了1960.12 ± 46.65 mg/L的产量。代谢组学分析进一步揭示了高产菌株的合成生物学工程特征，证明通过增强还原力供应与前体定向转化的协同作用，建立了高效的EGT生物合成网络。该研究不仅构建了酿酒酵母中EGT合成的高效细胞工厂，也为复杂天然产物的合成建立了代谢工程范式。
编译者解读
该研究的核心亮点在于“从天然宿主到异源平台”的系统工程思维——选择食用菌来源的合成酶基因而非传统细菌来源，利用其“功能保守但系统适应”的进化特征，显著降低了异源表达障碍。多层次代谢工程的组合策略（前体供应+乙醇利用+辅因子平衡）体现了合成生物学中“全局优化优于单点强化”的理念。5 L发酵规模下近2 g/L的产量为工业化放大提供了有说服力的数据支撑。值得关注的是，代谢组学揭示的戊糖磷酸途径通量增强和TCA循环回补机制，为其他依赖NADPH和氨基酸前体的天然产物合成提供了可借鉴的代谢重编程范式。后续研究可聚焦于进一步解析PoEgt1/PoEgt2的底物通道效应及工业规模发酵的工艺经济性评估。
参考来源
Zhongjuan Di. Multi-level metabolic engineering for efficient ergothioneine production in yeast using a Pleurotus ostreatus-derived pathway. Chemical Engineering Journal, 2026.
DOI: 10.1016/j.cej.2026.175686
DOI: 10.1016/j.cej.2026.175686